李勇杰，于慶龍，潘際剛，王宏健，宛 蕾，王旭東

1.貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室，貴州 貴陽 550025；

2.貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，貴州 貴陽 550025

酒精對乳腺癌細胞表皮生長因子受體-鈣激活中性蛋白酶通路及細胞遷移的影響

李勇杰1，于慶龍1，潘際剛1，王宏健1，宛 蕾2，王旭東1

1.貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室，貴州 貴陽 550025；

2.貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，貴州 貴陽 550025

背景與目的：酒精（ethyl alcohol，EtOH）可促進乳腺癌的惡性演進，但其信號機制尚未完全明了。本研究通過觀察EtOH對乳腺癌細胞鈣激活中性蛋白酶（calcium-activated neutral protease，CANP）-周期蛋白E/局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）信號通路和細胞遷移的影響，以及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在其中的介導作用，探討EtOH促進乳腺癌細胞遷移的信號機制。方法：以人乳腺腫瘤細胞系MCF-7為模型細胞（MCF-10A乳腺上皮細胞為對照）；采用蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）分析周期蛋白E和FAK蛋白剪切反應；通過傷口愈合實驗觀察細胞遷移效應；采用EGFR抑制劑（EGFR inhibitor，EGFR-I）或CANP抑制劑Calpeptin抑制EGFR或CANP活性，觀察抑制劑對EtOH誘導CANP1大亞基、周期蛋白E/ FAK蛋白剪切及細胞遷移的影響。結果：以EtOH（0.3%）處理模型細胞可觀察到周期蛋白E和FAK出現(xiàn)明顯蛋白剪切且該效應呈劑量和時間依賴性，還觀察到EtOH刺激細胞遷移活動（+47.30%，P＜0.05），但EtOH對MCF-10A細胞遷移無明顯影響；以Calpeptin（10 μmol/L）預處理模型細胞，可見EtOH（0.3%）或EGF（10 ng/mL）誘導的周期蛋白E/FAK蛋白剪切效應受到明顯抑制；EGFR-I（3 μmol/L）可顯著抑制EtOH誘導的CANP1大亞基和周期蛋白E/ FAK蛋白剪切及細胞遷移效應（-53.00%，P＜0.01）。結論：EtOH可通過EGFR激活乳腺癌細胞CANP信號活動并促進細胞遷移，EGFR-CANP通路參與介導EtOH與EGF之間的串話，提示EGFR-CANP信號通路中的關鍵分子可為防止乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在藥物靶點。

酒精；表皮生長因子受體；鈣激活中性蛋白酶；細胞遷移；乳腺癌

包括乳腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的主要致死原因在于腫瘤遠處臟器轉(zhuǎn)移。酒精（ethyl alcohol，EtOH）與乳腺癌發(fā)病的關系已經(jīng)得到流行病學數(shù)據(jù)的支持［1］。近年來的研究資料顯示，EtOH還可能參與促進乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［2-5］，從而影響乳腺癌患者的生存率。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）參與促進乳腺癌的發(fā)展［6］，乳腺癌細胞中高活性鈣激活中性蛋白酶（calcium-activated neutral protease，CANP）及CANP依賴性周期蛋白E蛋白剪切與乳腺癌的不良預后顯著相關［7-9］。腫瘤細胞的遷移活動是乳腺癌轉(zhuǎn)移的早期和限速步驟之一。然而，EtOH是否可通過EGFR刺激乳腺癌細胞CANP信號活動及細胞遷移，目前還未見文獻報道。

1　材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

人乳腺癌細胞MCF-7（ER+）購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。MCF-10A乳腺上皮細胞由重慶第三軍醫(yī)大學生物化學教研室惠贈。培養(yǎng)基（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM）、無酚紅DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素購自美國HyClone公司；活性炭處理胎牛血清（charcoalstripped fetal bovine serum，CS-FBS）購自法國BioWest公司；二甲亞楓（dimethylsulfoxide，DMSO）購自美國MPBio公司；人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自英國Peprotech公司；鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin購自德國Calbiochem公司；抗周期蛋白E和局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）單克隆抗體、抗β-actin抗體、羊抗小鼠IgG-HRP及羊抗兔IgG-HRP購自美國Santa Cruz公司；EtOH購自美國Sigma-Aldrich公司；EGFR抑制劑（EGFR inhibitor，EGFR-I）購自德國Merk公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

MCF-7細胞培養(yǎng)在DMEM（高糖，含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素）中。MCF-10A細胞在含10%馬血清、10 ng/mL霍亂毒素、10 μg/mL胰島素、50 ng/mL氫化可的松、20 ng/mL EGF及1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 EtOH處理

細胞在有酚紅完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)自60%滿度后，換成加2.5%CS-FBS的無酚紅DMEM培養(yǎng)24 h，再以無血清、無酚紅DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后按實驗要求加入體積分數(shù)0～0.5%的EtOH處理0～24 h。

1.4 EGFR及CANP抑制劑作用的觀察

實驗細胞分為E t O H（0.3%）組、EtOH（0.3%）+Calpeptin（15 μmol/L）組、EGFR-I（3 μmol/L）組和EtOH（0.3%）+EGFR-I（3 μmol/L）組，按實驗要求加入相應抑制劑預處理模型細胞，再加入EtOH處理0～24 h觀察細胞遷移變化或裂解細胞提取蛋白定量后進行蛋白印跡分析。

1.5 傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力

細胞種植在12孔板中，有酚紅條件下培養(yǎng)至90%～100%滿度后，無菌條件下用200 μL槍頭在培養(yǎng)皿底作輕柔十字劃痕，形成單細胞層無細胞區(qū)（寬約1.5 mm），然后以PBS清洗2～3次，以除去漂浮細胞。根據(jù)實驗要求，更換有酚紅或無酚紅培養(yǎng)基（含1.5%CS-FBS）繼續(xù)培養(yǎng)，按實驗要求加入藥物處理。于倒置顯微鏡下，分別在0和24 h時間點照相，觀察和分析對照組和處理組劃痕寬度的變化。各實驗組24 h細胞遷移距離（mm）=24 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度；24 h細胞遷移率=（24 h對照組劃痕寬度-24 h處理組劃痕寬度）/24h對照組劃痕寬度×100%。

1.6 蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測目標蛋白相對分子質(zhì)量變化

細胞培養(yǎng)至70%滿度，按實驗要求處理細胞后，加入RIPA細胞裂解液（使用前20 min加蛋白酶抑制劑使其終濃度為1 mmol/L），在冰上溫育15 min以利充分裂解，然后在4 ℃以20 627×g離心15 min。取樣品上清液留用，采用BCA試劑盒（購自上海碧云天生物技術有限公司）進行蛋白定量。進行Western blot檢測時，每個泳道按30 μg蛋白質(zhì)樣品進行上樣， SDSPAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜（購自美國Millipore公司）上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；然后按要求加入FAK單克隆抗體（1∶2 500）或抗CANPI/II小亞基抗體（1∶2 000）室溫雜交1～2 h或4 ℃溫育過夜。一抗處理后以TBST洗膜3次后，再加入相應的辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2 000）室溫雜交1 h，PVDF膜以化學發(fā)光試劑盒（購自美國Millipore公司）進行顯色，以Syngene Imaging System進行成像，以Quantity One對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對實驗結果進行分析處理。數(shù)據(jù)以表示，組內(nèi)兩樣本均數(shù)比較用t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　實驗結果

2.1 EtOH誘導MCF-7乳腺癌細胞周期蛋白E和FAK蛋白剪切及細胞遷移

以體積分數(shù)為0～0.5%的EtOH刺激模型細胞3 h，可觀察到周期蛋白E和FAK的蛋白剪切呈劑量依賴性；以體積分數(shù)為0.3%EtOH刺激模型細胞0～3 h可觀察到時間依賴性蛋白剪切。以體積分數(shù)為0.3%的EtOH刺激模型細胞，可見細胞遷移明顯增快（47.3%±4.0%）。以體積分數(shù)為0.3%的EtOH刺激對MCF-10A乳腺上皮細胞無明顯影響（圖1）。

2.2 EtOH誘導的MCF-7細胞周期蛋白E和FAK的蛋白剪切依賴鈣蛋白酶

以CANP抑制劑Calpeptin預處理模型細胞1 h，發(fā)現(xiàn)Calpeptin阻斷EtOH誘導的周期蛋白和FAK蛋白剪切；以EGF（10 ng/mL）刺激模型細胞可引起與EtOH相似的蛋白剪切效應，而此效應同樣可以被Calpeptin所阻斷（圖2）。

2.3 EGFR介導EtOH誘導的鈣蛋白酶依賴性周期蛋白E/FAK蛋白剪切和細胞遷移

以EGFR-I預處理細胞1 h，再以體積分數(shù)為0.3%的EtOH刺激模型細胞3 h，觀察EGFR-I對EtOH誘導的CANP1、周期蛋白E/FAK剪切反應及細胞遷移的影響。結果發(fā)現(xiàn)，EGFR-I可明顯抑制或阻斷EtOH誘導的上述剪切反應，同時EGFR-I也可明顯抑制EtOH誘導的細胞遷移效應（53.0%±4.1%，圖3）。

圖 1 EtOH誘導MCF-7乳腺癌細胞周期蛋白E和FAK蛋白剪切及細胞遷移Fig. 1 EtOH stimulated the truncation of cyclin E/FAK and migration in MCF-7 breast cancer cells

圖 2 EtOH或EGF誘導的周期蛋白E和FAK蛋白剪切可被鈣蛋白酶抑制劑阻斷Fig. 2 EtOH- or EGF-induced proteolysis of cyclin E/FAK was profoundly reduced by calpain inhibitor， calpeptin

圖 3 EGFR-I 對EtOH誘導鈣蛋白酶1及周期蛋白E/FAK蛋白剪切和細胞遷移的影響Fig. 3 Effects of EGFR-I on the proteolysis of calpain1 and cyclin E/FAK and migration induced by EtOH in MCF-7 cells

3　討　論

近年來，我國乳腺癌發(fā)病率呈快速增高趨勢，形勢不容樂觀［10］。防止乳腺癌轉(zhuǎn)移是提高患者生存率和生活質(zhì)量的關鍵，因而對乳腺癌轉(zhuǎn)移的細胞分子機制進行深入研究具有重要理論和實際意義?，F(xiàn)有資料顯示，EtOH可通過EGFR誘導乳腺癌細胞發(fā)生上皮細胞轉(zhuǎn)化從而促進細胞遷移和侵襲［2］。EtOH還可通過雌激素及Nm23-ITGA5信號通路促進乳腺癌的發(fā)展及腫瘤細胞侵襲行為［3-4］，EtOH促進乳腺癌惡性演進還可能與p38γ及巨噬細胞有關［5-6］。本研究顯示，EtOH可刺激MCF-7細胞CANP敏感性底物蛋白分子周期蛋白E和FAK發(fā)生剪切形成小分子產(chǎn)物并促進細胞遷移，但EtOH對MCF-10A乳腺上皮細胞遷移無明顯影響。CANP依賴性周期蛋白E和FAK與乳腺癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有關［8-9，11］，提示EtOH促進乳腺癌細胞遷移可能與胞內(nèi)CANP活性有關。

本研究組前期研究顯示，EtOH可誘導乳腺癌細胞周期蛋白E發(fā)生蛋白剪切［11］，提示EtOH的作用可能與胞內(nèi)CANP有關。Luo等［12］觀察了EtOH對低侵襲性乳腺癌細胞（BT-20、MCF-7及T47D）EGFR家族表達的影響，發(fā)現(xiàn)EtOH可上調(diào)T47D細胞erbB2、erbB3及erbB4表達并促進細胞遷移。EGFR（erbB1）信號通路在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中也具有重要促進作用［7］，但其信號機制尚未完全明確。本研究顯示，EGF也可誘導與EtOH相似的周期蛋白E和FAK蛋白剪切效應，而以CANP抑制劑Calpeptin預處理模型細胞，則EGF或EtOH誘導蛋白剪切效應均可被阻斷，提示EtOH誘導的周期蛋白E/FAK蛋白剪切與其激活CANP有關，且EtOH和EGF可通過CANP發(fā)生串話。以EGFR抑制劑EGFR-I預處理模型細胞，可見EtOH誘導的周期蛋白E/FAK及CANP1大亞基（CANP激活的直接標志［11］）蛋白剪切均可被其阻斷，同時EtOH誘導的細胞遷移效應也可被EGFR-I所阻斷，說明EtOH誘導MCF-7細胞CANP激活和細胞遷移效應與EGFR有關。EtOH對雌激素敏感性MCF-10A細胞遷移無明顯影響，這可能與正常乳腺上皮細胞內(nèi)CANP活性較低有關［13］。

總之，本研究表明EtOH可通過EGFR激活乳腺癌細胞CANP信號活動并促進細胞遷移，而EGFR下游的CANP-周期蛋白E/FAK信號活動可能參與促進乳腺癌細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移［14-15］，提示EGFR-CANP信號通路中的關鍵分子可能成為防治乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在藥物靶點，值得深入研究。

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Impacts of ethanol on the epidermal growth factor receptor （EGFR） -calpain signaling and migration

in breast cancer cells

LI Yongjie1， YU Qinglong1， PAN Jigang，1WANG Hongjian1， WAN Lei2， WANG Xudong1
（1.Department of Physiology， Guizhou Medical University School of Basic Medicine， Guiyang 550025， Guizhou Province， China； 2 Department of Pharmacology， Guizhou Medical University School of Basic Medicine， Guiyang 550025， Guizhou Province， China）
Correspondence to: Wang Xudong E-mail: 1157102188@qq.com

Background and purpose: Ethanol has been reported to stimulate progression of breast cancer， yet the underlying mechanism is not fully understood. This study aimed to investigate effects of ethyl alcohol （EtOH） on the calcium-activated neutral protease （CANP）-cyclin E/focal adhesion kinase （FAK） signaling and cell migration in breast cancer cells， as well as the role of epidermal growth factor receptor （EGFR） in the EtOH-stimulated effects， in order to assess the signaling mechanism（s） underlying how EtOH enhances cancer progression. Methods: Human breast cancer cell line MCF-7 was employed as a model system， with MCF-10A mammary epithelial cells as control. In vitro wound healing assay was carried out to evaluate EtOH-induced cell migration. The effects of EtOH or epidermal growth factor on the proteolysis of cyclin E/FAK were detected by Western blot. EGFR inhibitor （EGFR-I） and a specific inhibitorfor CANP， Calpeptin， were applied to pretreat cultured cells to explore their influences on the cell migration and cyclin E/FAK proteolysis triggered by EtOH. Results: Treatment of model cells with EtOH （0.3%） stimulated significant proteolysis of cyclin E/FAK in a dose-/time-dependent manner and increased migration （+47.30%， P＜0.05） in MCF-7 breast cancer cells， but had no significant effect on migration in MCF-10A cells. Pretreatment with Calpeptin （10 μmol/L）significantly reduced EtOH （0.3%）- or EGFR （10 ng/mL）-induced cyclin E/FAK truncation. EGFR-I （3 μmol/L） profoundly reduced EtOH-indcued CANP dependent proteolysis of CANP1 and cyclin E/FAK as well as cell migration（-53.00%， P＜0.01）. Conclusion: EtOH significantly stimulates activation of CANP via EGFR pathway， resulting in proteolysis of cyclin E/FAK and migration in MCF-7 breast cancer cells， suggesting EGFR-CANP signaling to be a potential target for suppression of metastasis in breast cancer.

Ethanol； Epidermal growth factor receptor； Calcium-activated neutral protease； Migration； Breast cancer

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.10.003

R737.9

A

1007-3639（2016）10-0820-06

國家自然科學基金資助項目（31360252）。

王旭東 E-mail: 1157102188@qq.com

（2016-01-05

2016-03-26）