段佳君，鄒天寧，張 季，劉德權

云南省腫瘤醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院乳腺外一科，云南 昆明 650118

ER陽性乳腺癌中Efp和Plk3蛋白表達相關性探討

段佳君，鄒天寧，張 季，劉德權

云南省腫瘤醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院乳腺外一科，云南 昆明 650118

背景與目的：長期以來，雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌患者對內分泌治療耐藥是臨床上棘手的難題。目前研究表明，雌激素效應環(huán)指蛋白（estrogen-responsive finger protein，Efp）和polo樣激酶3（polo-like kinase 3，Plk3）的表達與乳腺癌發(fā)展具有密切關系。該研究旨在探討ER陽性乳腺癌中Efp和Plk3蛋白表達相關性，了解Efp和Plk3表達變化在耐藥中的作用。方法：應用免疫組織化學SP法檢測74例ER陽性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達情況，結合臨床資料進行分析。并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）及蛋白［質］印跡法（Western blot）檢測ER陽性乳腺癌MCF-7細胞中Efp和Plk3的基因和蛋白表達變化。結果：74例ER陽性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達與患者的臨床病理特征未見任何關系（P＞0.05），其中有51例（68.9%）患者Efp表達陽性和23例（31.1%）患者Plk3表達陽性，χ2檢驗分析結果顯示，ER陽性乳腺癌組織中Efp和Plk3具有顯著的負相關關系（χ2=8.837，P＜0.05）。RTFQ-PCR檢測結果顯示，MCF-7細胞經雌激素刺激后Efp mRNA的表達顯著增加，而Plk3 mRNA的表達無明顯變化。Western blot檢測結果顯示，MCF-7細胞經雌激素和MG132刺激后，Efp的蛋白表達較MG132組顯著增加，而Plk3蛋白表達明顯下降。結論：在ER陽性乳腺癌患者中Efp和Plk3的蛋白表達呈負相關，Efp高表達可促進Plk3的蛋白降解，對內分泌耐藥過程的形成可能產生一定影響。

乳腺癌；雌激素受體；雌激素效應環(huán)指蛋白；Polo樣激酶3；耐藥

近年來，隨著對乳腺癌發(fā)病機制和治療研究的不斷深入，人們發(fā)現大部分對內分泌治療耐藥的乳腺癌患者中雌激素受體（estrogen receptor，ER）呈陽性，其生長具有雌激素依賴性［1-2］。雌激素效應環(huán)指蛋白（estrogenresponsive finger protein，Efp）基因作為ERα的靶基因，在依賴雌激素的乳腺癌細胞增殖和功能的調節(jié)中發(fā)揮重要作用，有研究證實，當雌激素與ER結合時可誘導Efp高表達，后者可通過泛素途徑降解細胞內多種與乳腺癌增殖相關的蛋白，導致疾病進一步惡化，甚至使機體產生耐藥［3-4］。Polo樣激酶3（polo-like kinase 3，Plk3）是Plk家族成員之一，最新研究顯示，其過表達能抑制ER陽性乳腺癌細胞的增殖［5］?；诖?，本文擬探討ER陽性乳腺癌中Efp和Plk3蛋白表達相關性，旨在了解Efp和Plk3表達的變化在ER陽性乳腺癌內分泌治療耐藥中的作用，為臨床治療乳腺癌提供新的思路。

1　材料和方法

1.1 臨床資料

選取2010年3月—2010年9月于云南省腫瘤醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院乳腺外一科行乳腺癌切除術并且ER陽性的乳腺癌患者74例，均為女性，中位年齡為51（33～71）歲?；颊咝g前未行放療、化療和內分泌治療，術中在乳腺癌組織離體后立即切取約0.2 g標本及癌旁正常組織，并迅速置于液氮中保存?zhèn)溆?。上述組織標本均經過病理診斷為ER陽性乳腺癌。所有患者均簽署了知情同意書，實驗過程嚴格按照國家倫理學審查機構和協(xié)議進行。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，PBS干粉購自美國Sigma公司，胰蛋白酶-EDTA購自武漢博士德生物工程有限公司，TransScript?Two-Step實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）SuperMix試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，免疫組化鼠抗人Efp單抗、鼠抗人Plk3單抗購自英國Abcam公司，蛋白酶體抑制劑MG-132、雌二醇E2購自美國Gene Operation公司，ER陽性MCF-7細胞株由云南省腫瘤醫(yī)院病理科提供，鼠抗人Efp單抗、鼠抗人的Plk3單抗和兔抗人的β-actin單抗均美國SantaCruz公司，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，倒置光學顯微鏡（奧林巴斯CKX-41）購自日本奧林巴斯株式會社。

1.3 免疫組織化學SP法

采用免疫組織化學SP法檢測ER陽性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達。方法如下:取患者的乳腺癌組織標本，經10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成厚4 μm的連續(xù)病理切片，抗原修復采用EDTA（pH=9.0）抗原修復液高壓鍋熱修復。鼠抗人Efp單克隆抗體和鼠抗人Plk3單克隆抗體的工作濃度分別為1∶200和1∶200，置于4 ℃冰箱溫育過夜。PBS沖洗2次，滴加二抗后室溫溫育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封固。

1.4 陽性結果判斷

Efp、Plk3陽性表達判定:以細胞質呈現棕黃色及棕褐色顆粒者為陽性細胞，測定時采用雙盲法，由兩名經驗豐富的病理科醫(yī)師在200倍光鏡下隨機選擇5個視野進行半定量計數［6］。根據染色強度，無色積分為0分，淺黃色積分為1分，棕黃色積分為2分，棕褐色積分為3分；根據陽性細胞數＜25%為陰性（-），25%～50%為低水平表達（+），50%～75%為中等水平表達（++），＞75%為較高水平表達（+++）。本研究以（-）～（+）為陰性組，以（++）～（+++）為陽性組。

1.5 ER陽性MCF-7細胞培養(yǎng)

加入1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）重懸ER陽性MCF-7細胞后，調整細胞密度為1×104個/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞用0.05%胰蛋白酶進行消化傳代。

1.6 RTFQ-PCR實驗

取細胞培養(yǎng)收集的ER陽性MCF-7細胞，將細胞密度調整為2×106個/mL，按每孔100 μL接種于96孔板中，分為溶劑對照組（無水乙醇）和E2組（E2濃度為1×10-7mol/L）。每組設4個復孔，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞，參照試劑盒說明書分別提取各組細胞總RNA，并反轉錄為cDNA，以β-actin為內對照進行PCR擴增。目的基因和內參的引物設計是根據GenBank提供Efp、Plk3和β-actin的mRNA序列（表1）。

表 1 目的基因的引物設計Tab. 1 Primer designing of target gene

1.7 蛋白［質］印跡法（Western blot）實驗

取收集的ER陽性MCF-7細胞，將細胞密度調整為2×106個/mL，按每孔100 μL接種于96孔板中，分為溶劑對照組（無水乙醇）、E2組（E2濃度為1×10-7mol/L）、MG-132組（MG-132濃度為5×10-6mol/L）和E2+MG-132組（E2濃度為1× 10-7mol/L，MG-132濃度為5×10-6mol/L）。每組設4個復孔，置于37℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞用PBS洗滌2次，加入1×SDS上樣緩沖液300 μL，冰上放置30 min，超聲裂解細胞，4 ℃，12 000×g條件下離心10 min，收集上清液為細胞裂解液。用BCA法進行蛋白定量，10%SDA-PAGE垂直電泳分離，上樣量為30 μg/孔，轉移蛋白質到聚乙烯二氟膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，1∶1 000倍稀釋的鼠抗人Efp單抗、1∶1 000倍稀釋的鼠抗人Plk3單抗和1∶4 000倍稀釋的兔抗人β-actin單抗室溫溫育1 h，膜洗3次，加入1∶3 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗鼠或抗兔的二抗室溫溫育1 h，膜洗3次，用ECL發(fā)光系統(tǒng)進行顯影，對條帶進行定性分析，以β-actin作為內參照。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數據處理。計數資料采用χ2檢驗。Efp和Plk3的表達相關性研究采用χ2檢驗或連續(xù)校正的χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1 免疫組織化學法檢測ER陽性乳腺癌組織中Efp和Plk3的蛋白表達

免疫組織化學法檢測結果顯示，Efp和Plk3主要表達于漿細胞的細胞質中，細胞質染色多且呈棕黃色顆粒或團塊狀（圖1、2）。

圖 1 ER陽性乳腺癌組織中Efp表達Fig. 1 The expression of Efp in ER positive breast cancer

圖 2 ER陽性乳腺癌組織中Plk3表達Fig. 2 The expression of Plk3 in ER positive breast cancer

2.2 ER陽性乳腺癌患者Efp和Plk3蛋白表達與患者臨床的關系

74例ER陽性乳腺癌患者組織中，Efp和Plk3蛋白表達與臨床病理特征無明顯的相關性（P＞0.05，表2）。

2.3 ER陽性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達的相關性分析

在74例ER陽性乳腺癌患者中，有51例患者Efp表達陽性，陽性率為68.9%；有23例患者Plk3表達陽性，陽性率為31.1%。在51例Efp表達陽性患者中，有11例Plk3表達陽性，23例Efp表達陰性患者中有13例Plk3表達陽性。經χ2檢驗分析發(fā)現，ER陽性乳腺癌組織中Efp和Plk3具有顯著的負相關關系（χ2=8.837，P=0.003）。

2.4 雌激素對ER陽性乳腺癌MCF-7細胞的Efp mRNA和Plk3 mRNA基因表達的影響

采用RTFQ-PCR檢測ER陽性乳腺癌MCF-7細胞的Efp mRNA和Plk3 mRNA基因表達情況，結果顯示，與對照組相比，E2組中MCF-7細胞經雌激素刺激后Efp mRNA的表達顯著增加，而Plk3 mRNA的表達則無明顯變化（圖3）。

表 2 Efp、Plk3蛋白表達在ER陽性乳腺癌組織中的表達與臨床病理特征關系Tab. 2 The Relationship between expressions of Efp and Plk3 and clinical characteristics in ER positive breast cancer

圖 3 雌激素對ER陽性乳腺癌MCF-7細胞的Efp和Plk3基因表達的影響Fig. 3 Expression of Efp mRNA and Plk3 mRNA in ER positive MCF-7 cells induced by estrogen

2.5 雌激素和蛋白酶體抑制劑對ER陽性乳腺癌MCF-7細胞的Efp和Plk3蛋白表達的影響

采用Western blot檢測ER陽性乳腺癌MCF-7細胞的Efp和Plk3蛋白表達情況。結果顯示:E2組細胞經雌激素刺激后Efp的蛋白表達較對照組顯著增加而Plk3蛋白明顯下降；MG132組細胞經蛋白酶體抑制劑刺激后Plk3蛋白較對照組顯著增加；E2+MG132組細胞經雌激素和MG132刺激后，Efp的蛋白表達較MG132組顯著增加，而Plk3蛋白表達明顯下降（圖4）。

圖 4 雌激素和蛋白酶體抑制劑對ER陽性乳腺癌MCF-7細胞的Efp和Plk3蛋白表達的影響Fig. 4 Expression of Efp and Plk3 protein in ER positive MCF-7 cells induced by estrogen and MG132

3　討　論

ER陽性乳腺癌患者對內分泌治療耐藥一直是臨床上的難題。近年來研究發(fā)現，長期雌激素刺激能引起ER下游靶基因上的雌激素反應元件調控基因表達能力增強，它是導致乳腺癌耐藥過程形成的重要因素［7-8］。Efp主要表達于雌激素靶向性的組織和細胞中，如乳腺和子宮等上皮細胞。既往研究證實，Efp高表達可導致雌激素依賴性癌細胞的增殖和惡化，Zhao等［9］研究發(fā)現，雌激素誘導ER陽性乳腺癌細胞中Efp高表達，導致抑癌因子KLF5降解。Efp在ER陽性乳腺癌中也存在高表達現象，Ueyama等［10］通過沉默MCF-7乳腺癌細胞中Efp的表達，導致MCF-7的體外增殖受到顯著抑制。因此，Efp可能是參與乳腺癌耐藥過程的一個重要指標。高表達的Efp作為一種泛素連接酶，可通過泛素途徑降解細胞內多種與乳腺癌增殖相關的蛋白，如Plk3蛋白。Plk3作為Plk家族的成員之一，是有絲分裂、胞質分裂和DNA損傷反應的關鍵調節(jié)劑。Naik等［11］發(fā)現抑制乳腺癌細胞中Plk3的活性，可導致乳腺癌細胞異常增殖。Yan等［12］的調查顯示，大部分乳腺癌患者的癌組織中Plk3蛋白表達減少。因此，推測Efp和Plk3可能參與了ER陽性乳腺癌患者的內分泌治療耐藥過程。

本研究探討ER陽性乳腺癌中Efp和Plk3蛋白表達相關性，在74例ER陽性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達與患者的臨床病理特征未見明顯關聯（P＞0.05），而χ2檢驗分析結果顯示，ER陽性乳腺癌組織中Efp和Plk3具有顯著的負相關關系（χ2=8.837，P＜0.05）；此外，免疫組織化學檢測顯示，在同一個乳腺癌患者的乳腺癌組織標本中，Efp的高表達往往同時存在Plk3的低表達，提示Efp高表達可促進Plk3的蛋白降解。進一步觀察外源性雌激素和蛋白酶抑制劑MG132反應性指蛋白Efp對Plk3表達的影響，結果顯示，MCF-7細胞經雌激素刺激后Efp mRNA的表達顯著增加，而Plk3 mRNA的表達無明顯變化，說明雌激素能顯著促進Efp高表達，而對Plk3的表達不產生影響。隨后我們通過Western blot檢測不同刺激對MCF-7細胞Efp和Plk3蛋白的影響，結果顯示，MCF-7細胞經雌激素刺激后，Efp的蛋白表達較對照組顯著增加，而Plk3蛋白明顯下降。Plk3在細胞中可被蛋白酶抑制劑MG132穩(wěn)定［13］，當MCF-7細胞經MG132刺激后，Plk3蛋白較對照組顯著增加。MCF-7細胞經雌激素和MG132同時刺激后，Efp的蛋白表達較MG132組顯著增加，而Plk3蛋白表達明顯下降。上述結果進一步驗證了Efp高表達可促進Plk3的蛋白降解。

綜上所述，在ER陽性乳腺癌中，雌激素能促進Efp高表達，加速Plk3的蛋白降解，從而更有利于具有雌激素依賴性的ER陽性乳腺癌細胞的增殖。因此，Efp和Plk3表達的變化可能對內分泌耐藥過程的形成產生一定影響。

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Expression correlation between Efp and Plk3 in estrogen receptor-positive breast cancer

DUAN Jiajun， ZOU Tianyu， ZHANG Ji， LIU Dequan
（Department of Mammary Surgery， Yunnan Cancer Hospital，Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650118， Yunnan Province， China）
Correspondence to: DUAN Jiajun E-mail: zhuomiansohuji@163.com

Background and purpose: Estrogen receptor （ER）-positive breast cancer always presents a dilemma for resistance to endocrine therapy in a long time. The recent studies showed that the expression of estrogenresponsive finger protein （Efp） and polo-like kinase 3 （Plk3） had a close relationship with breast cancer development. This study was to explore the expression correlation between Efp and Plk3 in ER-positive breast cancer in order to understand the influence of Efp and Plk3 on the drug resistance. Methods: The expression of Efp and Plk3 in 74 cases of ER-positive breast cancer was detected by SP immunohistochemistry. The clinical significance was then analyzed. Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RTFQ-PCR） and Western blot were used to detect the expression of Efp and Plk3 in ER-positive MCF-7 cells. Results: No significant relationship was found between Efp and Plk3 expression and the clinicopathological features of 74 cases of ER-positive breast cancer （P＞0.05）. The number of cases whose Efp showed positive expression was 51 （68.9%）， while the number of cases whose Plk3 showed positive expression was 23 （31.1%）. Chi-square test analysis showed the expression of Efp and Plk3 was negatively correlated in 74 cases of ER-positive breast cancer （χ2=8.837， P＜0.05）. The result of RTFQ-PCR showed that the expression of Efp mRNA in MCF-7 cells was up-regulated by estrogen stimulation， whereas Plk3 mRNA was not changed. The result of Western blot showed that the expression of Efp protein in MCF-7 cells was increased by estrogen and MG132 stimulation， whereas Plk3 protein was decreased. Conclusion: The expression of the Efp protein is negatively correlatedwith Plk3 protein in ER-positive breast cancer. High expression of Efp may be involved in the resistance to endocrine therapy.

Breast cancer； Estrogen receptor； Estrogen-responsive finger protein； Polo-like kinase 3； Drug resistance

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.10.007

R737.9

A

1007-3639（2016）10-0848-06

段佳君 E-mail:zhuomiansohuji@163.com

（2015-11-10

2016-02-10）