朱建勛,王繼卿,胡 江,劉 秀,李少斌,閆 偉,羅玉柱

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070)

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五個(gè)綿羊群體KAP11-1基因核苷酸序列變異分析

朱建勛,王繼卿,胡 江,劉 秀,李少斌,閆 偉,羅玉柱

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070)

為了分析綿羊KAP11-1基因的核苷酸序列變異,采用PCR-SSCP方法和DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了歐拉羊、甘肅高山細(xì)毛羊、灘羊、湖羊和青海細(xì)毛羊5個(gè)群體(749只個(gè)體)KAP11-1基因的單核苷酸多態(tài)性,同時(shí)分析了等位基因頻率、遺傳雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量等群體遺傳特征。結(jié)果表明,5個(gè)綿羊群體的KAP11-1基因中共檢測(cè)到c.93C/T、c.240G/A、c.285C/G/A和c.331A/G 4個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn),且c.331A/G為非同義突變。等位基因A在5個(gè)群體中出現(xiàn)的頻率最高(87.70%),為優(yōu)勢(shì)等位基因,其次為等位基因B(基因頻率為11.03%),等位基因C和D的頻率最低(分別為0.53%和0.74%)。群體遺傳學(xué)分析結(jié)果表明,灘羊KAP11-1基因的遺傳雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量均高于其余4個(gè)群體。KAP11-1基因作為羊毛經(jīng)濟(jì)性狀的主要候選基因之一,其核苷酸序列的變異導(dǎo)致KAP11-1中相應(yīng)氨基酸的改變,最終可能會(huì)影響羊毛纖維的結(jié)構(gòu)和羊毛主要經(jīng)濟(jì)性狀。

綿羊;KAP11-1基因;核苷酸序列變異;PCR-SSCP;單核苷酸多態(tài)性

羊毛纖維的主要結(jié)構(gòu)由角蛋白(Keratins)和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Keratin-associated proteins,KAPs)構(gòu)成。大量的角蛋白聚集成束形成8～10 nm的角蛋白中間絲(Keratin intermediate filaments,KIFs),KAPs則通過(guò)大量的二硫鍵交聯(lián)形成半剛性基質(zhì)嵌入到KIFs的半胱氨酸殘基中[1]。KAPs最典型的特征是結(jié)構(gòu)中含有較高比例的半胱氨酸或甘氨酸/酪氨酸殘基,并根據(jù)其含量的不同分為3類,分別是高硫角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(HS-KAPs,≤30 mol% Cysteine)、超高硫角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(UHS-KAPs,>30mol% Cysteine)、高甘氨酸/酪氨酸角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(HGT-KAPs,35～60 mol% Glycine/Tyrosine)[1]。目前,共發(fā)現(xiàn)和命名了27個(gè)KAPs家族成員,其中KAP1～3、KAP10～16和KAP23～27屬于HS-KAPs;KAP4、KAP5、KAP9和KAP17屬于UHS-KAPs;KAP6～8和KAP18～22屬于HGT-KAPs[2]。

KAPs基因是編碼羊毛纖維的重要結(jié)構(gòu)基因,長(zhǎng)度較小(約600～1 500 bp),一般包含一個(gè)單獨(dú)的外顯子,且外顯子被一些介入序列隔開[3]。研究表明,KAPs基因與羊毛的質(zhì)量和產(chǎn)量存在相關(guān)性[4],因此可以找到一些與毛用性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記,為綿羊品種改良提供繁殖新技術(shù)。艾買提·買買提[5]通過(guò)對(duì)KAP9-2基因位點(diǎn)不同基因型與剪毛量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),AA、AB、BB和CC基因型對(duì)應(yīng)羊只個(gè)體的剪毛量差異顯著(P<0.05),推測(cè)KAP9-2基因可作為中國(guó)美利奴羊(新疆型)剪毛量的有效分子標(biāo)記。Parsons等[6]研究發(fā)現(xiàn)KAP6和KAP8與羊毛產(chǎn)量和纖維直徑有明顯的相關(guān)性,并推測(cè)在KAP6和KAP8同一區(qū)域可能存在著控制羊毛纖維直徑的主效基因。Cockett等[7]進(jìn)一步證實(shí)了KAP6和羊毛纖維直徑之間的相關(guān)性。孫福亮等[8]發(fā)現(xiàn)新吉細(xì)毛羊KAP13-1基因的CC基因型對(duì)應(yīng)個(gè)體的產(chǎn)毛量顯著高于TT基因型(P<0.05),NN基因型對(duì)應(yīng)個(gè)體的產(chǎn)毛量和羊毛拉伸長(zhǎng)度顯著高于MM基因型(P<0.05),認(rèn)為可通過(guò)提高CC和NN基因型的頻率來(lái)增加新吉細(xì)毛羊的產(chǎn)毛量和羊毛拉伸長(zhǎng)度。

KAP11-1基因是目前在KAP11基因家族中發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)基因,有關(guān)該基因的遺傳變異在綿羊、人、牛和小鼠上已有報(bào)道[9-12],但在中國(guó)綿羊品種上沒(méi)有相關(guān)研究。因此,本試驗(yàn)以綿羊KAP11-1基因?yàn)楹蜻x基因,采用PCR-SSCP方法,結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù),分析該基因在5個(gè)中國(guó)綿羊群體中的遺傳特征,豐富我國(guó)羊毛基因組研究?jī)?nèi)容,為綿羊毛用性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及DNA提取

采集5個(gè)綿羊品種的749份血樣,包括歐拉羊、甘肅高山細(xì)毛羊、灘羊、湖羊和青海細(xì)毛羊,具體采樣地點(diǎn)、血樣儲(chǔ)存類型及樣本數(shù)量見表1。根據(jù)常規(guī)采樣要求,每只羊頸靜脈采血2 mL,不加任何抗凝劑,直接滴于FTA卡(Whatman,Middlesex,UK)上,室溫下放置、晾干備用。用Zhou等[13]描述的2步法提取FTA卡中的基因組DNA,用于PCR擴(kuò)增。

表1 試驗(yàn)樣本信息

1.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中綿羊KAP11-1基因序列(登錄號(hào):HQ595347),利用DNAMAN 軟件(version 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada)設(shè)計(jì)特異性引物,擴(kuò)增該基因部分編碼區(qū)序列,目的片段大小為408 bp。上游引物序列為5′-GGATTGGAGGAGAAT

ACACTG-3′;下游引物序列為5′-ACTGCTGGTACGT

CCTGGAG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積20 μL,其中Taq預(yù)混酶(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)10 μL,上、下游引物(0.25 μmol/L)各0.4 μL,ddH2O為8.2 μL,基因組DNA為1.2 mm 的FTA卡小圓片1個(gè)(約相當(dāng)于50 ng/μL基因組DNA 1.0 μL)。

PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸7 min,4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 SSCP分析

取2 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,加入8 μL變性上樣緩沖液(98%去離子甲酰胺,10 mmol/L EDTA,0.025%溴酚藍(lán)和0.025%二甲苯氰),95 ℃變性5 min后,立即置于冰水混合物中,迅速上樣于10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=37.5∶1)中,于260 V、18 ℃條件下在0.5×TBE 緩沖液中電泳20 h。

1.4 銀染

電泳結(jié)束后,根據(jù)Byun等[14]描述的方法銀染聚丙烯酰胺凝膠。

1.5 等位基因序列測(cè)定

等位基因測(cè)序方法因純合子和雜合子而異。如果SSCP條帶是純合子,用PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序;如果SSCP條帶是雜合子,按照Gong等[15]描述的方法切膠測(cè)序。序列測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用DNAMAN 軟件(version 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada)比對(duì)等位基因核苷酸序列,用GenBank中在線Blast軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.goc/)比對(duì)本試驗(yàn)獲得的等位基因序列與綿羊基因組(Genome assembly v3.1,Oar3.1)已有序列的同源性。利用Popgen 32.0軟件計(jì)算等位基因頻率、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和Hardy-Weinberg平衡定律。采用PIC軟件計(jì)算群體多態(tài)信息含量(PIC)。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中,選取綿羊(HQ595347)、山羊(NM_001285767.1)、牛(NM_001080740.1)、人(NM175858.2)、獼猴(XM_001083627.1)和小家鼠(NM_001113406.1)KAP11-1基因的核苷酸序列,比較物種間核苷酸序列同源性,并根據(jù)不同物種間KAP11-1基因的遺傳距離,用MEGA(version 5.0)軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1KAP11-1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

KAP11-1基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),得到一條特異性較好的電泳條帶(圖1),且片段大小為408 bp,與目的片段大小一致,可以進(jìn)行下一步的SSCP分析。

M.Marker;1～3.歐拉羊;4～5.甘肅高山細(xì)毛羊;6.灘羊;7～8.湖羊;9.青海細(xì)毛羊。

M.DNA Marker;PCR products in lane 1-3,lane 4-5,lane 6,lane 7-8 and lane 9 are random individual from Oula sheep,Gansu Alpine Merino,Tan sheep,Hu sheep and Qinghai merino sheep,respectively.

圖1 綿羊KAP11-1基因的PCR擴(kuò)增檢測(cè)圖

Fig.1 PCR amplification ofKAP11-1 gene in sheep

2.2KAP11-1基因的SSCP檢測(cè)結(jié)果

KAP11-1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析后,在5個(gè)綿羊群體的749只個(gè)體中共檢測(cè)到4個(gè)等位基因(分別命名為A、B、C、D)和6種基因型(AA、BB、AB、AC、AD、BD)(圖2)。經(jīng)在線Blast軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn),等位基因A、B、C的核苷酸序列與已提交的綿羊KAP11-1基因的部分序列相同(登錄號(hào):HQ595347、HQ595351、HQ595352),等位基因D為本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)。

圖2 綿羊KAP11-1基因的PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果

4個(gè)等位基因中共檢測(cè)到4個(gè)SNPs位點(diǎn)(表2),占分析位點(diǎn)總數(shù)的0.98%。其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)3個(gè)(c.93C/T、c.240G/A和c.331A/G),占核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的75%;顛換位點(diǎn)1個(gè)(c.285C/G/A),占25%。在4個(gè)SNPs位點(diǎn)中,c.93C/T、c.240G/A和c.285C/G/A是同義突變;c.331A/G是非同義突變,導(dǎo)致KAP11-1多肽鏈上1個(gè)氨基酸的改變(p.Ser111Gly)。

表2 綿羊KAP11-1基因的核苷酸和氨基酸序列變異

注:原始序列指GenBank中綿羊的核苷酸序列(登錄號(hào):HQ595347);-.氨基酸沒(méi)有發(fā)生變化。

Note:Original sequence refers to the nucleotide sequence of sheep in GenBank (Accession number:HQ595347);-.No amino acid change.

對(duì)20種常見氨基酸在綿羊KAP11-1中的數(shù)量和摩爾百分比分析發(fā)現(xiàn),在等位基因B編碼的氨基酸序列中,由于存在p.Ser111Gly,使得Ser的數(shù)量由原來(lái)的30個(gè)變?yōu)?9個(gè),摩爾百分比由原來(lái)的18.87%變?yōu)?8.24%;相應(yīng)的,Gly的數(shù)量由原來(lái)的9個(gè)變?yōu)?0個(gè),摩爾百分比由原來(lái)的5.66%變?yōu)?.29%(表3)。

表3 綿羊KAP11-1中各氨基酸的數(shù)量及其在氨基酸序列中所占的比例

注:表中氨基酸的數(shù)量和摩爾百分比是利用DNAMAN軟件(version 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada)對(duì)綿羊KAP11-1基因編碼區(qū)(480 bp)編碼的氨基酸(159個(gè))組成分析所得。

Note:The number and mole percentage of amino acids (159) listed in this table were obtained from the coding region (480 bp) of ovineKAP11-1 gene by using DNAMAN software (version 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada).

2.4KAP11-1基因在5個(gè)綿羊群體中的等位基因頻率和基因型頻率

5個(gè)綿羊群體KAP11-1基因的基因型頻率和等位基因頻率具有品種差異性(表4)。在歐拉羊、甘肅高山細(xì)毛羊、湖羊和青海細(xì)毛羊中僅檢測(cè)到A和B 2個(gè)等位基因及AA、BB和AB 3種基因型。在灘羊中檢測(cè)到全部4個(gè)等位基因和6種基因型。在5個(gè)綿羊群體中,等位基因A出現(xiàn)的頻率最高(87.70%),為優(yōu)勢(shì)等位基因,其次為等位基因B,等位基因C和D出現(xiàn)的頻率最低,兩者之和僅占1.27%。基因型AA在5個(gè)綿羊群體中出現(xiàn)的頻率最高 (82.38%),為優(yōu)勢(shì)基因型。

表4 五個(gè)綿羊群體KAP11-1基因的基因型頻率與等位基因頻率

2.5KAP11-1基因的雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量

5個(gè)綿羊群體KAP11-1基因的遺傳多態(tài)性信息(表5)顯示,灘羊具有較高的遺傳變異,其遺傳雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)分別為0.17和1.38。甘肅高山細(xì)毛羊上述2個(gè)參數(shù)均最低,說(shuō)明在5個(gè)綿羊群體中其遺傳變異最小。灘羊KAP11-1基因的PIC值為0.26,屬中度多態(tài),其余4個(gè)群體KAP11-1基因的PIC值均小于0.25,呈低度多態(tài)。

2.6KAP11-1基因的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)和中性檢驗(yàn)

5個(gè)綿羊群體KAP11-1基因的遺傳平衡檢驗(yàn)和中性檢驗(yàn)見表6。5個(gè)綿羊群體KAP11-1基因的χ2值和G2值均未達(dá)到顯著水平,說(shuō)明群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示,5個(gè)綿羊群體的觀測(cè)F值在KAP11-1基因中處于95%的置信區(qū)間內(nèi),并接近區(qū)間上限(U95)。

表5 五個(gè)綿羊群體KAP11-1基因的遺傳多態(tài)參數(shù)

表6 綿羊KAP11-1基因的遺傳平衡檢驗(yàn)和中性檢驗(yàn)

2.7KAP11-1基因的核苷酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

綿羊、山羊和牛等6個(gè)物種KAP11-1基因的核苷酸序列同源性比較結(jié)果見表7。綿羊KAP11-1基因的核苷酸序列與山羊、牛的同源性最高,分別為99.2%和95.4%,與人、獼猴和小家鼠的同源性依次為83.1%,82.9%和80.8%。不同物種KAP11-1基因的核苷酸序列同源性高低與系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致(圖3)。系統(tǒng)發(fā)育樹中,綿羊與山羊、牛的親緣關(guān)系最近,在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一支,而與人、獼猴和小家鼠的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表7 六個(gè)物種KAP11-1基因核苷酸序列同源性比較結(jié)果

圖3 基于KAP11-1基因核苷酸序列構(gòu)建不同物種的NJ樹

3 討論

羊毛纖維具有高度的組織結(jié)構(gòu),其纖維的90%由KIFs和KAPs組成,這2種類型的蛋白都由多基因家族編碼。目前國(guó)內(nèi)外大多學(xué)者把KAPs基因家族的遺傳變異與羊毛(羊絨)經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性分析作為研究熱點(diǎn)。張亞妮等[16]以KAP6-1(S1位點(diǎn))、KAP1-1(S2位點(diǎn))和KAP1-3(S3和S4位點(diǎn))為候選基因,研究其多態(tài)性與遼寧絨山羊經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),S1-AB、S1-BB、S3-BB和S4-AB可作為遼寧絨山羊產(chǎn)絨量性狀的優(yōu)勢(shì)標(biāo)記基因型。Parsons等[6]通過(guò)對(duì)美利奴羊半同胞家系研究發(fā)現(xiàn)KAP6、KAP7和KAP8基因所在染色體區(qū)段與羊毛纖維直徑有相關(guān)關(guān)系。Gong等[17]以320只新西蘭綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象,采用PCR-SSCP技術(shù)分析了KAP1-4基因的遺傳多態(tài)性,結(jié)果在9條等位基因序列中發(fā)現(xiàn)了14個(gè)SNPs位點(diǎn),預(yù)測(cè)該基因可能是綿羊毛用性狀的候選基因。

本試驗(yàn)首次研究了中國(guó)綿羊群體KAP11-1基因的遺傳多態(tài)性。在所分析的749只綿羊個(gè)體中,共發(fā)現(xiàn)了A、B、C和D 4個(gè)等位基因,其中等位基因D為本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)。KAP11-1基因的等位基因頻率在細(xì)毛羊、裘皮羊、羔皮羊等不同毛用綿羊品種中的分布表現(xiàn)出品種差異性,在一定程度上反映了毛用羊品種的生產(chǎn)力方向。在5個(gè)綿羊品種中,僅在灘羊中檢測(cè)到C和D 2種等位基因。灘羊是我國(guó)獨(dú)有的輕裘皮用綿羊品種,以生產(chǎn)潔白、美觀、輕便、保暖、耐用的二毛裘皮(灘羊出生后1月齡左右屠宰所得的皮張,其毛股長(zhǎng)而彎曲,有“9道灣”之稱。)著稱于世。等位基因C和D可能與灘羊二毛裘皮毛股彎曲數(shù)有關(guān)。楊麗娟等[18]采用PCR-RFLP分子標(biāo)記技術(shù),在258只灘羊的KAP1-3基因中檢測(cè)到2個(gè)等位基因A、B和3種基因型AA、AB、BB。相關(guān)性分析表明,BB基因型的毛股彎曲數(shù)顯著高于AA和AB基因型(P<0.05),認(rèn)為可以通過(guò)提高BB基因型頻率來(lái)增加灘羊二毛裘皮的毛股彎曲數(shù)。等位基因B在湖羊中出現(xiàn)的頻率最高,這可能與小湖羊皮(湖羊出生后1～2 d內(nèi)宰剝的羔皮稱為“小湖羊皮”,毛色潔白光潤(rùn),皮質(zhì)輕柔,花紋呈波浪形,有“軟寶石”之稱。)的特性有關(guān),但目前沒(méi)有這方面的研究報(bào)道,還需進(jìn)行相關(guān)性分析加以驗(yàn)證。歐拉羊、甘肅高山細(xì)毛羊和青海細(xì)毛羊各等位基因頻率差異不大,這可能與上述這3個(gè)品種都含有藏綿羊的血統(tǒng)有關(guān)。

4個(gè)等位基因的編碼區(qū)共檢測(cè)出4個(gè)SNPs位點(diǎn)(c.93C/T、c.240G/A、c.285C/G/A和c.331A/G),其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)(c.93C/T、c.240G/A和c.331A/G)多于顛換位點(diǎn)(c.285C/G/A)。這是因?yàn)镾NPs在CG序列上出現(xiàn)的頻率較高,而CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基容易發(fā)生甲基化,從而自發(fā)脫去氨基形成胸腺嘧啶。同義突變(c.93C/T、c.240G/A和c.285C/G/A)多于非同義突變(c.331A/G),占核苷酸變異位點(diǎn)的75%。同義突變雖然不引起氨基酸的改變,但因?yàn)楦淖兞撕塑账嵝蛄?三聯(lián)體密碼子),有可能影響轉(zhuǎn)錄后的加工和切接信號(hào)的順序,同時(shí)降低mRNA的穩(wěn)定性[19-21],最終影響基因的表達(dá)。非同義突變(c.331A/G)導(dǎo)致KAP11-1多肽鏈上1個(gè)氨基酸由絲氨酸(Ser)變?yōu)楦拾彼?Gly),該變異可能對(duì)綿羊的毛用性狀有一定影響,但需要進(jìn)行相關(guān)性分析檢驗(yàn)其對(duì)羊毛性狀的作用。Gong等[9]采用PCR-SSCP方法分析了新西蘭羅姆尼羊KAP11-1基因的遺傳變異,結(jié)果在6個(gè)等位基因序列中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)SNPs位點(diǎn)(c.69G/T、c.93C/T、c.288C/G/A、c.334A/G和c.426C/T),除c.93C/T外,其余SNPs位點(diǎn)均與本研究結(jié)果不同,這可能是由于研究品種不同所造成的。這也說(shuō)明如果增加綿羊品種的數(shù)量,在KAP11-1基因中可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的等位基因和SNPs位點(diǎn),同時(shí)也印證了該基因在不同綿羊品種中的分布具有品種差異性。

雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)是度量群體遺傳變異的重要指標(biāo),不同的遺傳參數(shù)體現(xiàn)各群體的遺傳差別,度量數(shù)值越高,遺傳變異就越大。在5個(gè)綿羊群體中,灘羊的He、Ne和PIC均最大。這說(shuō)明試驗(yàn)灘羊在飼養(yǎng)過(guò)程中,人工選擇壓力不大,主要經(jīng)濟(jì)性狀在群體內(nèi)變異較大。同時(shí)也反映出該群體選育空間很大,如果育種措施(如表型選擇+后裔測(cè)定、分子標(biāo)記輔助選擇)得當(dāng),可使生產(chǎn)性能在較短的時(shí)間內(nèi)有較大的提高,從而使主要表型性狀趨于一致。χ2適合性檢驗(yàn)表明,KAP11-1基因在5個(gè)綿羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05),說(shuō)明在隨機(jī)遺傳漂變和人工選擇過(guò)程中5個(gè)群體的KAP11-1基因處于動(dòng)態(tài)平衡,選擇壓力對(duì)該基因的作用不強(qiáng)。

KAP11-1基因的核苷酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,綿羊與山羊、牛的同源性和親緣關(guān)系最近,在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一支,而與人、獼猴和小家鼠的同源性和親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該結(jié)論符合動(dòng)物分類學(xué)上將綿、山羊和牛歸為同一科(?？苹蚨唇强?的分類方法。

綿羊KAP11-1基因包含由480個(gè)核苷酸組成的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),共編碼159個(gè)氨基酸。其中絲氨酸(Ser)、半胱氨酸(Cys)和蘇氨酸(Thr)含量最高,分別占氨基酸總數(shù)的18.87 mol%,12.58 mol%,11.95 mol%。絲氨酸和蘇氨酸是易于發(fā)生磷酸化的氨基酸,綿羊KAP11-1中絲氨酸和蘇氨酸殘基數(shù)占整個(gè)多肽鏈上氨基酸總數(shù)的30.82 mol%,潛在磷酸化位點(diǎn)數(shù)是其他高硫KAPs基因的2～4倍[9]。磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后一種最常見和最重要的修飾方式。蛋白質(zhì)磷酸化作用發(fā)生于許多生物化學(xué)過(guò)程中,如在細(xì)胞外信號(hào)的傳遞以及細(xì)胞內(nèi)調(diào)整代謝過(guò)程(包括基因表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂和增殖等)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[22-23]。雖然目前對(duì)于KAPs蛋白的磷酸化沒(méi)有系統(tǒng)的研究結(jié)論,但是Ku等[24]指出角蛋白(Keratins)的磷酸化對(duì)其組裝可能有較大的影響,Feng等[25]發(fā)現(xiàn)酪蛋白磷酸化能對(duì)角蛋白起總體修飾作用。

綿羊KAP11-1基因的核苷酸序列變異可能會(huì)影響表達(dá)、蛋白質(zhì)磷酸化水平及其結(jié)構(gòu),最終可能會(huì)影響羊毛的質(zhì)量或產(chǎn)量等毛用性狀,但因缺乏表型數(shù)據(jù),有關(guān)KAP11-1基因與綿羊毛用性狀的相關(guān)性分析有待進(jìn)一步研究。

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Nucleotide Sequence Variations ofKAP11-1 Gene in 5 Chinese Sheep Populations

ZHU Jianxun,WANG Jiqing,HU Jiang,LIU Xiu,LI Shaobin,YAN Wei,LUO Yuzhu

(College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology,Lanzhou 730070,China)

In order to analyze sequence variations ofKAP11-1 gene,single nucleotide polymorphisms (SNPs) of Oula sheep,Gansu Alpine Merino,Tan sheep,Hu sheep and Qinghai merino sheep (a total of 749 individuals) were detected using PCR-SSCP and DNA sequencing techniques in this study.Population genetics characteristics such as allele frequency,genetic heterozygosity,effective number of alleles and polymorphism information content (PIC) were analyzed simultaneously.The results suggested that four SNPs (c.93C/T,c.240G/A,c.285C/G/A and c.331A/G) inKAP11-1 gene of 5 sheep populations were discovered,and c.331A/G was non-synonymous substitution.Allele Aexhibited the highest frequency (87.70%) among five sheep populations,and it was the most common allele,allele B was the next common with the allele frequency of 11.03%,the frequency of allele C and D were the lowest,which were 0.53% and 0.74% respectively.Population genetics results showed that heterozygosity,effective number of alleles and polymorphic information content of Tan sheep were higher than those of another four sheep populations.KAP11-1 gene is one of the major candidate genes of wool economic traits.The nucleotide sequence variations ofKAP11-1 gene will lead to amino acid changes of KAP11-1,then eventually affect wool fibre structure and wool economic traits.

Sheep;KAP11-1 gene;Nucleotide sequence variations;PCR-SSCP;Single nucleotide polymorphism

2016-06-16

甘肅省創(chuàng)新研究群體計(jì)劃項(xiàng)目(1210RJIA005);國(guó)際科技合作與交流項(xiàng)目(2011DFG33310);甘肅省高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目;甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)自列課題

朱建勛(1988-),男,甘肅通渭人,碩士,主要從事動(dòng)物遺傳育種與牛羊生產(chǎn)系統(tǒng)研究。

羅玉柱(1962-),男,甘肅景泰人,教授,博士，博士生導(dǎo)師,主要從事現(xiàn)代生物技術(shù)與動(dòng)物育種應(yīng)用研究。

Q78;S826

A

1000-7091(2016)05-0101-07

10.7668/hbnxb.2016.05.015