楊　敏，劉孟吉

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林　吉林　132001）

超聲波提取羊耳菊黃酮類(lèi)化合物的工藝研究

楊敏，劉孟吉

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132001）

為了研究羊耳菊最佳工藝，試驗(yàn)采用超聲的方法來(lái)提取羊耳菊中黃酮類(lèi)化合物，確定最佳的提取工藝條件。試驗(yàn)采用單因素和正交試驗(yàn)，分析乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間及提取溫度等四個(gè)因素對(duì)黃酮類(lèi)化合物含量的影響，優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果表明：乙醇濃度60%，料液比為1：10、提取時(shí)間為10min、提取溫度為60℃，黃酮含量可以達(dá)到69.82mg/g。優(yōu)選提取工藝簡(jiǎn)單可行，速度快，可提高葛花人參中有效成分的收率。

羊耳菊；超聲波；黃酮類(lèi)化合物；提取工藝

羊耳菊（Inula cappa（Buch-Ham）DC.），系菊科旋覆花屬植物，亞灌木，根狀莖粗壯［1］。具有除風(fēng)散寒，行氣止嘔，止汗，止瀉，止血的功效。臨床上用于治療感冒發(fā)燒、喉炎、咳嗽咳血、虛癆、心悸、月經(jīng)不調(diào)及產(chǎn)后流血等癥，療效肯定，具有很高的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值［2］。其主要化學(xué)成分為黃酮類(lèi)化合物。黃酮類(lèi)化合物因其結(jié)構(gòu)和來(lái)源的不同，溶解性差異也很大，因此應(yīng)根據(jù)其極性和溶解性來(lái)選擇合適的提取溶劑［3］。本試驗(yàn)采用超聲提取方法，以黃酮類(lèi)化合物的含量主要考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法探討了不同提取條件對(duì)黃酮含量的影響，為羊耳菊抗炎活性藥理研究奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與儀器

1.1材料

羊耳菊在吉林大藥房購(gòu)買(mǎi)，由武曉琳老師鑒定為羊耳菊。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所供紫外法含量測(cè)定用）；95%乙醇溶液 （天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；氫氧化鈉（分析純）；亞硝酸鈉（分析純）；硝酸鋁（分析純）

1.2儀器

766-2型遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱 （南通科學(xué)儀器廠）；ALC-310電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；LG-08A型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) （天津市泰斯特儀器有限公司）；試驗(yàn)篩（新鄉(xiāng)市同心機(jī)械有限責(zé)任公司）；UY-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （日本島津）；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；SY-360超聲波清洗機(jī)（上海寧商超聲儀器有限公司）。

2　試驗(yàn)方法

2.1工作曲線回歸方程的建立

將蘆丁干燥至恒重，制成標(biāo)準(zhǔn)樣品，精密稱(chēng)取蘆丁10mg，用60%的乙醇溶解并稀釋至50mL。作為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。精密量取0，1，2，3，4，5mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，分別置100mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶 1mL，混勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以試劑空白作參比，用分光光度法分別在500nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2羊耳菊中黃酮類(lèi)化合物的提取

2.2.1提取物的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取羊耳菊粉末4g，加入60%乙醇溶液80mL，在溫度為60℃、頻率35KHZ、功率360W的情況下提取15min，減壓抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容至刻度，備用。

2.2.2樣品黃酮含量測(cè)定

精確量取0.5mL樣品液至25mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液1mL，搖勻，放置6min，加10% Al（NO3）3溶液1mL，搖勻，放置6 min，加4%NaOH溶液10mL，然后用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min。用分光光度法在波長(zhǎng)為500nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中黃酮類(lèi)化合物含量［4］。

2.3單因素試驗(yàn)

2.3.1乙醇濃度對(duì)黃酮提取效果的影響

改變乙醇溶液濃度其他條件不變，分別加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液80ml進(jìn)行提取，測(cè)定吸光度值，計(jì)算黃酮含量。

2.3.2料液比對(duì)黃酮提取效果的影響

改變料液比其他條件不變，用不同的料液比（1：3、1：6、1：9、1：12、1：15）進(jìn)行提取，測(cè)定吸光度值，計(jì)算黃酮含量。

2.3.3超聲波提取時(shí)間對(duì)黃酮提取效果的影響

改變提取時(shí)間其他條件不變，分別提取10min、15min、20min、25min、30min。測(cè)定吸光度值，計(jì)算黃酮含量。

2.3.4超聲波提取溫度對(duì)黃酮提取效果的影響

改變提取溫度其他條件不變，分別用提取溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃進(jìn)行提取，測(cè)定吸光度值，計(jì)算黃酮含量。

2.4正交試驗(yàn)

以乙醇為浸提溶劑，采用超聲波提取法，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)考察溶劑濃度、提取時(shí)間、料液比、溫度這4個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以黃酮含量為考察標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選出最佳提取條件。選L9（34）作正交試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

3　結(jié)果與分析

3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用Excel軟件進(jìn)行線性回歸分析，得線性回歸方程，繪制蘆丁濃度C與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)得值最小二乘法進(jìn)行線性回歸，分析得回歸方程y= 1.0412x+6.1×10-3，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，說(shuō)明其線性關(guān)系良好。

3.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1乙醇濃度對(duì)黃酮提取影響結(jié)果

圖1　乙醇濃度對(duì)總黃酮提取的影響曲線

由圖1可見(jiàn)總黃酮含量隨著乙醇濃度增加而逐漸增長(zhǎng)，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)黃酮提取率反而降低。這是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大，會(huì)使提取品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。所以設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)乙醇濃度三個(gè)水平為50%、60%、70%。

3.2.2料液比對(duì)黃酮提取的影響結(jié)果

圖2　料液比對(duì)黃酮提取的影響

由圖2可以看到黃酮含量隨料液比增加變化不大，極差僅為0.81，料液比在1：25時(shí)黃酮含量最高。所以將料液比不作為考察因素，將其作為空白組?？紤]實(shí)際操作中料液比過(guò)小時(shí)，提取劑太少不利于過(guò)濾分離，提取劑太多過(guò)濾時(shí)間太長(zhǎng)。所以選擇料液比在1：9。

3.2.3超聲波提取時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響結(jié)果

圖3　提取時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響

由圖3可知10～15min時(shí)黃酮含量增加明顯，之后黃酮含量變化不大。由此可以看出，15min之后再延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)黃酮含量影響不大。造成提取物在超聲作用達(dá)到一定時(shí)間后，黃酮含量增加緩慢或呈下降趨勢(shì)的原因可能是在長(zhǎng)時(shí)間超聲作用下，黃酮含量逐漸向極限值靠近，致使提黃酮含量增幅降低。同時(shí)超聲作用時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。所以選擇提取時(shí)間為10、15、20min為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

3.2.4超聲波提取溫度對(duì)黃酮提取的影響結(jié)果

圖4　超聲波提取溫度對(duì)黃酮提取的影響

有圖4可見(jiàn)當(dāng)溫度在60℃時(shí)黃酮含量達(dá)到最大值，之后黃酮含量反而降低。這可能是因?yàn)殡S著溫度的提高，雜質(zhì)的溶出也相應(yīng)增加，致使黃酮含量的提取逐漸降低。所以選擇50、60、70℃為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

3.3正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由單因素試驗(yàn)可看出料液比對(duì)黃酮含量影響不大，因此將料液比作為空白組。即以乙醇濃度（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、提取溫度（因素C）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，因素水平安排表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　正交試驗(yàn)因素與水平安排表

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)正交試驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理（表3）考慮A、B、C三因素在三個(gè)水平上的變化，得出最佳提取條件，由極差分析可以看出，影響提取羊耳菊中黃酮類(lèi)化合物含量的因素主次順序?yàn)锳＞C＞B。從平均黃酮含量看，A2B1C2提取條件最好，即乙醇濃度為60%、提取時(shí)間為10min、提取溫度為60℃的時(shí)候提取條件最好。

表3　方差分析

由表3方差分析可知，乙醇濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響非常顯著，提取溫度對(duì)黃酮含量比較顯著。由此得出結(jié)論3種因素顯著性的強(qiáng)弱依次為：乙醇濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間。因此提取條件最好，即乙醇濃度為60%、提取時(shí)間為10min、提取溫度為60℃的時(shí)候提取條件最好。

3.4最佳工藝試驗(yàn)驗(yàn)證

取三份羊耳菊粉末各4.00g，按照最佳提取條件平行操作測(cè)定吸光度，并計(jì)算平均黃酮含量為67.32mg/g，3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)計(jì)算RSD=0.797%。實(shí)驗(yàn)工藝條件重現(xiàn)性好，因此以正交實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)組合為最佳提取工藝條件，見(jiàn)表4。

表4　驗(yàn)證試驗(yàn)

4　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)是以羊耳菊為原料，利用超聲波對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取工藝進(jìn)行研究。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察不同因素對(duì)羊耳菊提取液中黃銅類(lèi)化合物含量的影響。最佳工藝條件為：乙醇濃度為60%，料液比為1：9、提取時(shí)間為10min、提取溫度為60℃，黃酮含量可達(dá)69.82mg/g。其中乙醇濃度對(duì)黃酮提取影響最為顯著。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，與傳統(tǒng)的回流浸提法相比較，超聲波法提取法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，提高了有效成分的提取率、原料的利用率。

［1］ 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志（第75卷）［M］.北京：科學(xué)出版社，1985：271.

［2］ 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物資源開(kāi)發(fā)研究所，等編著.中藥志（Ⅳ）（第二版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1988：368.

［3］ 李勝華.超聲波提取魚(yú)腥草葉總黃酮優(yōu)化工藝研究［J］.食品科學(xué)，2006，27（12）：270-273.

［4］ 喬俊纏.線葉菊總黃酮含量測(cè)定［J］.中草藥，1998，29（7）：453-454.

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