王鐵霖，李晶，楊玉文，趙廷昌

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

煙草野火病菌Pseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1信號(hào)肽預(yù)測(cè)及分析

王鐵霖，李晶，楊玉文，趙廷昌

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

利用SignalP 4.0、 LipoP 1.0 及TMHMM v2.0對(duì)煙草野火病菌Pseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1菌株基因組中信號(hào)肽的數(shù)量、長(zhǎng)度和氨基酸組成進(jìn)行了預(yù)測(cè)及分類。結(jié)果確定其中432個(gè)ORFs (Open reading frame) 所編碼的N 端有信號(hào)肽序列，占全部ORFs的8.81%。其中351條分泌型信號(hào)肽 (SPI)，81條脂蛋白型信號(hào)肽 (SPII)。在分泌型信號(hào)肽中，信號(hào)肽的長(zhǎng)度為11～42個(gè)氨基酸，以長(zhǎng)度為22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽最多。同源性分析結(jié)果顯示，具有相同信號(hào)肽序列的不同蛋白序列之間是高度保守的。該研究提供了野火病原菌致病因子的備選基因，提高該病菌致病因子的篩選效率。

Pseudomonas syringaepv.tabaci；信號(hào)肽；SignalP 4.0；LipoP 1. 0；TMHMM v2.0

煙草野火病是煙草生產(chǎn)上一種重要的葉部細(xì)菌性病害。該病害在苗期、大田期均可發(fā)生，主要危害煙草葉片，也可危害幼莖、蒴果、萼片等器官，給煙草種植業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。大部分病原菌的毒素、細(xì)胞壁降解酶等致病因子為分泌蛋白。而信號(hào)肽在分泌蛋白跨膜、 轉(zhuǎn)運(yùn)及識(shí)別植物受體蛋白過(guò)程中起著非常重要的作用[3-4]。

信號(hào)肽一般由10～40個(gè)氨基酸殘基組成，通常大致分為3個(gè)區(qū)段：其中N端為堿性氨基末端，通常由帶正電荷的氨基酸組成；中間為疏水中心，主要由20個(gè)或以上的中性氨基酸組成；C端為加工區(qū)，含有被信號(hào)肽酶裂解的部位，其中小分子氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸較多[5,6]。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)分離自四川越西縣煙草病樣上的一株致病力很強(qiáng)的煙草野火病菌株 yuexi-1進(jìn)行了全基因組測(cè)序， 結(jié)果顯示其基因組含有 5701個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORFs)。本研究根據(jù)野火病菌株P(guān)seudomonas syringaepv. tabaciyuexi-1的全基因組測(cè)序結(jié)果，利用 3 種在線生物信息學(xué)分析工具 SignalP 4.0、LipoP 1. 0 和 TMHMM v2.0 對(duì)該病菌的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，為該菌株致病因子的篩選提供備選基因。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從Genbank上獲得Pseudomonas syringaepv. tabaciyuexi-1菌株基因組序列(序列號(hào)JWJF00000000) 的fasta 文件和 gb文件。

1.2 預(yù)測(cè)方法

(1) 使用 SignalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 在Gram-negative bacteria選項(xiàng)下預(yù)測(cè) yuexi-1菌株基因組所有ORFs的N端氨基酸序列是否存在信號(hào)肽。(2) 使用 LipoP 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/) 分析N端氨基酸序列，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)類型。(3) 使用TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)執(zhí)行[19～23]。

2 結(jié)果與分析

綜合SignalP 4.0、 LipoP 1. 0和TMHMM Server v.2.0的預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)P. syringaepv. tabaciyuexi-1編碼蛋白基因的序列分析結(jié)果如下：

2.1 信號(hào)肽的數(shù)量和長(zhǎng)度

經(jīng)預(yù)測(cè)，yuexi-1菌株基因組有432個(gè)ORFs具有信號(hào)肽，占全部ORFs的8.81%。信號(hào)肽所在的ORFs長(zhǎng)度最小為41個(gè)氨基酸，最大為1649個(gè)氨基酸，平均長(zhǎng)度為340個(gè)氨基酸，ORFs長(zhǎng)度分布在101～200個(gè)氨基酸范圍內(nèi)數(shù)量最多(圖1) 。

圖1 含信號(hào)肽的ORFs長(zhǎng)度分布Fig. 1 Length distribution of the ORFs containing signals peptides

信號(hào)肽的長(zhǎng)度在11～41個(gè)氨基酸之間，以21～24個(gè)氨基酸居多，其中長(zhǎng)度為22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽最多，共66條，占15.30%(圖2)。

圖2 信號(hào)肽長(zhǎng)度(氨基酸)分布Fig. 2 Length (amino acids) distribution of signal peptide

2.2 氨基酸種類分析

經(jīng)LipoP 1. 0分析，根據(jù)信號(hào)肽氨基酸組成及切割位點(diǎn)信號(hào)肽識(shí)別序列的不同將信號(hào)肽分為4種類型：第一類信號(hào)肽酶I型 (SPI) 信號(hào)肽最為典型[7-9]；第二類為信號(hào)肽酶II型 (SPII)，通常在脂蛋白中出現(xiàn)[10]；第三類為IV型菌毛 (Type IV pilin peptidase)；第四類通常與細(xì)菌素和信息素的合成有關(guān)，由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)[11-13]。

對(duì)P. syringaepv. tabaciyuexi-1菌株中的432條信號(hào)肽分類結(jié)果表明，共有351條SPI型信號(hào)肽和81條SPII型信號(hào)肽。

2.2.1 信號(hào)肽酶I型( SPI型)

SPI型信號(hào)肽通常在從分泌蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜途中或轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜后，被切割[14,15]。此類信號(hào)肽中存在分泌類信號(hào)肽 (Sec-type)，其典型結(jié)構(gòu): N-端由2～3個(gè)帶正電荷的氨基酸 (K或R) 組成，也有的由5～11個(gè)帶正電荷的氨基酸組成。N-domain 由平均19個(gè)氨基酸構(gòu)成。C-domain (切割位點(diǎn)前3 位的氨基酸) 的典型結(jié)構(gòu)為A-X-A (A 為丙氨酸， X 指任意一種氨基酸)。

在預(yù)測(cè)得到的351條SPI型信號(hào)肽中，200條信號(hào)肽具有A-X-A的典型結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度在11～41個(gè)氨基酸之間。另一類信號(hào)肽具有典型的雙精氨酸結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)分泌蛋白參與雙精氨酸 (Tat) 轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，這一類信號(hào)肽具有RR-X-## ( X為任意氨基酸，## 指疏水氨基酸) 的保守序列[16-18]。在P. syringepv.tabaciyuexi-1菌株的基因組中， 有 27 條信號(hào)肽具有RR-motif 的保守區(qū)段，其長(zhǎng)度在17-42個(gè)氨基酸之間。其中17 條信號(hào)肽的C-domain 中出現(xiàn)A-X-A 典型結(jié)構(gòu) (表1)。如表 1 所示， 這些信號(hào)肽參與ABC蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等多種不同分泌途徑和相關(guān)酶合成代謝途徑。

表1 具有典型A-X-A結(jié)構(gòu)的RR-motif型信號(hào)肽Tab. 1 RR-motif signal peptides with the typical structure of A-X-A

2.2.2 脂蛋白型信號(hào)肽

SPII型信號(hào)肽也稱為脂蛋白信號(hào)肽，其典型結(jié)構(gòu)C-domain為: L-(A /S) -(A /G)，在切割位點(diǎn)后+ 1位氨基酸為半胱氨酸(C)，這樣就形成了保守的L-(A /S)-(A /G)-C的Li-pobox典型結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使脂蛋白被切割后依然能夠錨定在質(zhì)膜上。該類信號(hào)肽通常比分泌型信號(hào)肽短。

在P. syringaepv.tabacistrain yuexi-1中，共有81個(gè)脂蛋白型信號(hào)肽，其長(zhǎng)度在14～36個(gè)氨基酸之間。其中有 37 (1.32%) 條信號(hào)肽具有Li-pobox典型結(jié)構(gòu)（表2）。

表2 煙草野火病菌yuexi-1菌株基因組脂蛋白類型信號(hào)肽Tab. 2 Lipoprotein signal peptide in P. syringaepv.tabaci strain yuexi-1

續(xù)表2

續(xù)表2

在P.pv. tabaciyuexi-1菌株的基因組中，存在不同的分泌蛋白具有相同信號(hào)肽序列的現(xiàn)象。據(jù)統(tǒng)計(jì)，共30條SPI型信號(hào)肽和2條SPII型信號(hào)肽(表3)存在這種情況，而這些分泌蛋白具有類似的功能描述并參與相同生物過(guò)程。我們對(duì)含有相同信號(hào)肽序列的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其中8 組分泌蛋白，ORF 的編號(hào)分別為：peg.886 與peg.2670，peg.3721 與peg.3724， peg.3810、peg.4062與peg.4068， peg.3812、peg.4064 與 peg.4070， peg.4111 與 peg.4113，peg.170 與peg.4165， peg.2692 與 peg.2779， peg.2796 與 peg.2803，核酸序列比對(duì)的一致性在 99%～100%，可能為多拷貝基因。其它含有相同信號(hào)肽的蛋白序列的長(zhǎng)度和同源性的差異很大，但有功能相近，這些分泌蛋白序列呈現(xiàn)很高的同源性并高度保守，因此判斷這一類基因?yàn)槠叫羞M(jìn)化的同源基因。

表3 相同序列信號(hào)肽Tab. 3 Signal peptides with the same sequences

3 討論

本研究運(yùn)用 3 種生物信息學(xué)分析軟件對(duì)P.syringaepv. tabaci yuexi-1 菌株的全基因組序列進(jìn)行分析。P. syringaepv. tabaciyuexi-1 菌株中共有432條信號(hào)肽，其中351條SPI型信號(hào)肽和81條SPII型信號(hào)肽。通過(guò)比較分析，SPII 型信號(hào)肽與 SPI 型信號(hào)肽存在以下不同：首先，脂蛋白的信號(hào)肽，其 C 端包含 Lipobox 共識(shí)序列L-(A /S)-(A/G)-C，其結(jié)構(gòu)比分泌信號(hào)肽更保守(表 2)，說(shuō)明在脂蛋白的修飾過(guò)程中，多肽變化極少。另外，SPI型信號(hào)肽平均長(zhǎng)度為26 個(gè)氨基酸，SPII 型信號(hào)肽的平均長(zhǎng)度為 20 個(gè)氨基酸左右，較 SPI 型信號(hào)肽短。

煙草野火病菌 yuexi-1 有較強(qiáng)的致病力，其基因組測(cè)序的完成， 使得從全基因組水平分析和研究該菌株的信號(hào)肽和分泌蛋白成為可能。本研究中，結(jié)合多種生物信息學(xué)軟件，優(yōu)化預(yù)測(cè)方法，對(duì)基因組中具有信號(hào)肽的分泌蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，使預(yù)測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，為該菌株基因組特征的描述及該病菌致病機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。前期報(bào)道，細(xì)菌的大多數(shù)分泌蛋白中其致病性關(guān)系密切。其中, 參與 Tat 分泌途徑的RR-motif信號(hào)肽與植物病原細(xì)菌的致病性關(guān)系尤為密切。Rodríguez等利用生物信息學(xué)軟件對(duì)Dickeya dadantii3937的全基因組序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，并篩選假定 Tat 底物進(jìn)行突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TatC 突變體的致病力降低[24]。梨火疫病菌 （Erwinia amylovora） Tat途徑中的分泌蛋白參與病菌的生長(zhǎng)速度、 致病力生理特性[25]。本研究中，在 yuexi-1信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果中， 得到 26 條與Tat 系統(tǒng)相關(guān)的信號(hào)肽。同時(shí)，在分析分泌蛋白功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)得到的信號(hào)肽中存在參與 III 型分泌系統(tǒng)等與致病力關(guān)系密切的分泌系統(tǒng)，以上所得到的這些信號(hào)肽所對(duì)應(yīng)的基因是否也與其致病力等密切相關(guān)也需要進(jìn)一步證實(shí)。

盡管本研究利用結(jié)合多種軟件，提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，但預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際分泌到菌體外的蛋白在數(shù)量和種類上有一定的差距，在預(yù)測(cè)信號(hào)肽蛋白中，哪些是真正的分泌蛋白、分泌狀態(tài)及其功能需進(jìn)一步驗(yàn)證。后期研究工作中，結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)感興趣的分泌蛋白進(jìn)行功能驗(yàn)證，提高驗(yàn)證分泌蛋白功能效率。

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Analysis of coding region for proteins containing signal peptides ofPseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1 strain

WANG Tielin, LI Jing, YANG Yuwen, ZHAO Tingchang
State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

This paper predicted and analyzed the number, length and amino acid components in the genome ofPseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1, a strain of tobacco fi re blight pathogen, by using SignalP 4.0, LipoP 1.0 and TMHMM v2.0. Results showed that 432 ORFs(8.81% of all the ORFs) contained N- terminal signal peptides, of which 351 signal peptides were SPI type and 81 signal peptides were SPII type. Among the SPI peptides, length was between 11 to 42 amino acids and the majority was 22 amino acids in length. In addition,the proteins that share the same signal peptide sequences were highly conserved in the homologue analysis. This study provided candidate genes for virulence factors of the tobacco fi re blight pathogen, and promoted the efficiency for screening the virulence factors.

Pseudomonas syringaepv.tabaci; signal peptide; SignalP 4.0; LipoP 1. 0; TMHMM v2.0

王鐵霖，李晶，楊玉文,等. 煙草野火病菌Pseudomonas syringaepv. tabaciyuexi-1信號(hào)肽預(yù)測(cè)及分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2016,22（1）

煙草病蟲(chóng)害檢測(cè)與綜合治理重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題經(jīng)費(fèi)（項(xiàng)目號(hào)：bc2011 ）；中國(guó)煙草總公司科技重點(diǎn)項(xiàng)目 （項(xiàng)目號(hào) 110201202002 ）

王鐵霖，博士，Email：wtl82@163.com

趙廷昌，研究員，Email：zhaotgcg@163.com

2015-04-23

：WANG Tielin, LI Jing, YANG Yuwen, et al. Analysis of coding region for proteins containing signal peptides ofPseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1 strain [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(1)