付忠華　辛立衛(wèi)　張春光　陳永剛　劉 月

（梨樹縣獸藥監(jiān)察所，吉林梨樹　136500）

NKA1B2基因intron2上C2343T與產(chǎn)奶性狀的關聯(lián)分析

付忠華辛立衛(wèi)張春光陳永剛劉 月

（梨樹縣獸藥監(jiān)察所，吉林梨樹136500）

本研究通過DNA測序和PCR-SSCP分型對930頭荷斯坦牛的NKA1B2基因進行群體遺傳學分析并測定產(chǎn)奶高峰期的產(chǎn)奶性能指標及體細胞數(shù)。在第2內(nèi)含子檢測到新的SNP，C2343T位點存在兩種等位基因（C和T）和三種基因型（CC、CT、TT），都處于Hardy-Weinberg非平衡（P＜0.05）。C2833T位點的SNP對乳蛋白率存在極顯著影響（P＜0.01），對305 d產(chǎn)奶量存在顯著影響（P＜0.05）?；騎替代C對乳脂率、305天產(chǎn)奶量和體細胞評分都具有正效應，對乳蛋白率具有負效應。TT基因型個體產(chǎn)奶量下降率低，乳腺炎抵抗力高的優(yōu)良特征。

Na+-K+-ATP酶基因多態(tài)性產(chǎn)奶性能指標體細胞數(shù)

Na+-K+-ATP酶（NKA），是一類廣泛存在于真核生物細胞膜上的跨膜載體蛋白，是細胞內(nèi)離子轉(zhuǎn)運和能量代謝的重要系統(tǒng)，直接或間接地參與細胞內(nèi)外的離子調(diào)節(jié)，機體的生理活動和體溫調(diào)節(jié)過程[1，2］。P. Vague研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)Na+和K+的平衡主要有NKA來調(diào)節(jié)，NKA活性的降低可引起細胞的離子跨膜轉(zhuǎn)運障礙，能量代謝和物質(zhì)代謝的紊亂[3］。多位學者證實在炎熱的夏季，持續(xù)高溫造成的熱應激可導致奶牛直腸溫度、呼吸頻率、紅細胞鉀、產(chǎn)奶量發(fā)生明顯的變化[4-7］。研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛紅細胞NKA活力與產(chǎn)奶量下降率極顯著負相關[8-9］。在本研究中，我們對荷斯坦牛NKA1B2基因內(nèi)含子2上的SNP進行群體遺傳學分析，從多態(tài)性、基因效應分析對產(chǎn)奶性狀的影響以及對體細胞數(shù)的變化，以其為荷斯坦牛的選育提供理論依據(jù)和參考指標。

1　材料和方法

1.1試驗動物

從規(guī)?；膛鲋须S機挑選具有完整DHI記錄（乳脂率、乳蛋白率、305天產(chǎn)奶量及體細胞數(shù)）的同一胎次中國荷斯坦牛930頭。所有生產(chǎn)數(shù)據(jù)通過Foss 6000乳成分及體細胞聯(lián)機分析系統(tǒng)（Foss MilkScan FT 6000，F(xiàn)ossmatic 5000）檢測獲得。靜脈采血（10mL/頭），ACD抗凝，-20℃保存。

1.2NKA1B2的SNP檢測

根據(jù)牛NKA1B2基因全序列（NCBI登錄號：NC_007317-2），使用Primer5.0軟件，設計2對引物，由上海生工合成（見表1）。然后以DNA池為模板，按照（PCR反應體系均為25μl，包括10×buffer 2.5μl，25 mmol/L Mg2+1.8μl，10 mmol/L dNTPs 0.5μl，10μmol/L上、下游引物各0.8μl，模板DNA 1.0μl，5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.5μl，三蒸水17.1μl。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30s，退火（退火溫度見表1）30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸7min）PCR體系進行反應，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送到北京華大進行測序。

表1　引物設計

1.3NKA1B2基因分型

用PCR-SSCP來進行基因分型，方法是把6μlPCR產(chǎn)物加入25μl離心管中，然后再加入9μl變性劑（95%甲酰胺，25 mM EDTA，0.025%二甲苯青，0.025%溴酚藍），98℃變性10min，迅速冰浴5min。變性的DNA用10%PAGE電泳（80×73×0.75 mm），1×TBE buffer，穩(wěn)壓（120V），4℃，電泳10-14h，用0.1%硝酸銀進行染色，根據(jù)PCR-SSCP電泳結(jié)果判斷每一個體的基因型。

1.4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

統(tǒng)計中國荷斯坦奶牛的基因頻率和基因型頻率，計算χ2值、多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和位點的雜合度（H）。在最小二乘法擬合線性模型中用SPSS13.0軟件比較中國荷斯坦奶牛的乳脂率、乳蛋白率、305天產(chǎn)奶量、體細胞評分（SCS）在不同基因型之間的差異。分析中使用固定效應的線性模型是：Yijkil=u +hi+pj+sk+ml+eijkli（其中：Yijkli=耐熱性能觀察值；u =群體均值；hi=基因型的固定效應值；pj=父本的固定效應值；sk=母本的固定效應值；ml=產(chǎn)奶性能效應值；eijkli=隨機殘差效應）。結(jié)果以“平均數(shù)±標準誤”的形式表示。

1.5體細胞評分（SCS）計算

公式是SCS=log2（SCC/ 100）+ 3

1.6基因頻率（P）和基因型頻率（Pi）的計算

公式是p =（2a + c）/2N、q =（2b + c）/2N、pa=a/N、pb=b/ N、pc=c/N。其中p、q是A、B兩個等位基因頻率，pa、pb、pc是AA、AB、BB三種基因型頻率。a為AA基因型個體數(shù)，b為BB基因型個體數(shù)，c為AB基因型個體數(shù)，N為總體個數(shù)。

1.7Hardy-Weinberg平衡定律的適合性χ2檢驗

公式是χ2=[∑（O-E）2］/E。其中O是實際發(fā)生數(shù)，E是理論發(fā)生數(shù)。

1.8遺傳群體雜合度（H）的計算

1.9多態(tài)信息含量（PIC）的計算

1.10有效等位基因數(shù)（Ne）的計算

1.11基因替代效應的計算

公式是顯性效應：d=AB-（AA+BB）/2；加性效應：a=（BBAA）/2；顯性度D=d/a。A基因的平均效應：a1=q[a+d（q-p）］；B基因的平均效應：a2=-p[a+d（q-p）］。A等位基因替代B等位基因的平均效應a=a1-a2=a+d（q-p）。其中p是A等位基因頻率，q是B等位基因頻率，AA、AB、BB是各基因型的最小二乘均值。

2　試驗結(jié)果

2.1擴增產(chǎn)物電泳，測序和分型

PCR擴增經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，都產(chǎn)生了清晰的、能夠準確判斷的目的條帶1438bp和340bp，隨機抽取部分樣本進行兩次重復測序，同時發(fā)現(xiàn)第2內(nèi)含子的C2343T突變，通過PCR-SSCP分型，發(fā)現(xiàn)三種基因型CC、CT和TT，見圖1。

圖1　NKA1B2基因的C2343T位點特征

2.2群體遺傳學分析

PCR-SSCP檢測到C2343T位點具有兩個等位基因（C、T），三種基因型（CC、CT、TT），等位基因頻率和基因型頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（H）、有效等位基因數(shù)（Ne）、卡方（χ2）見表2。

表2　C2343T在荷斯坦牛群體中的遺傳多樣性

2.3NKA1B2不同基因型與產(chǎn)奶性狀的相關分析

由表3可知，荷斯坦牛NKA1B2基因C2343T位點SNP在乳蛋白率上TT基因型個體極顯著高于CC和CT基因型個體，在305天產(chǎn)奶量上CT基因型個體顯著高于TT基因型個體。

表3　NKA1B2基因不同基因型的產(chǎn)奶性狀的最小二乘均值和標準誤

2.4NKA1B2基因產(chǎn)奶性狀的基因效應值

由表4可知，荷斯坦牛NKA1B2基因C2833T位點的SNP由基因T替代C可以使乳脂率提高0.038，乳蛋白率降低0.253，305天產(chǎn)奶量提高350.866，體細胞評分提高0.016。

表4　NKA1B2基因的C/T替代效應

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)荷斯坦奶牛C2343T的突變位于內(nèi)含子，歸巢時可能在基因的轉(zhuǎn)錄及mRNA剪切中調(diào)節(jié)DNA分子的移動[10，11］。該位點的等位基因頻率和基因型頻率在群體內(nèi)差異明顯，C 等位基因頻率大于0.5，在荷斯坦牛群中的純合性較好；該位點的PIC在0.25到0.5之間，屬于中度多態(tài)，變異程度較大，有望獲得更多的遺傳進展；該位點的H比較低，在群體內(nèi)的遺傳變異較小，基因資源和遺傳多樣性不夠充足和豐富；該位點的Ne比較低，群體在發(fā)生選擇、突變或遺傳漂變時，群體保持其等位基因的能力較差；χ2檢驗，該位點處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)，基因頻率和基因型頻率在世代遺傳中將發(fā)生改變，不能處于遺傳平衡狀態(tài)。這些結(jié)果與品種（群體）的起源演化、育種歷史及所處生態(tài)條件有關，可能原因是：①試驗群體較小。②全球性的乳用型荷斯坦牛在自然和人工選擇的作用下，由于生長的自然生態(tài)環(huán)境和社會經(jīng)濟條件的不同，遺傳結(jié)構(gòu)已發(fā)生了較大的突變和變異，形成了不同的生態(tài)品種——中國荷斯坦牛。③進口的冷凍胚胎和種公牛遷移進入中國荷斯坦牛群體中，彼此摻入外來基因，導致基因流動，改變了中國荷斯坦牛群體的基因頻率。④對優(yōu)良種公牛的高度選擇和冷凍精液定性分離以及人工授精技術的應用，有選擇性地打破了群體的隨機交配。

研究顯示在荷斯坦牛群中，CT基因型在乳脂率和305天產(chǎn)奶量上具有優(yōu)勢，TT基因型在乳蛋白率上具有優(yōu)勢；T等位基因?qū)θ橹省?05天產(chǎn)奶量和體細胞評分具有正效應，對乳蛋白率具有負效應。SNP對產(chǎn)奶性狀影響不同的原因可能是：①樣本量差異導致基因型數(shù)量上的差異。②承受的人工選擇壓力不同導致環(huán)境適應性的差異。③飼料來源和飼養(yǎng)模式造成產(chǎn)奶性狀的差異。④特殊經(jīng)濟性狀的選擇差異。SNP對產(chǎn)奶性狀的影響和基因替代效應都表明在生產(chǎn)實踐中不能同時提高所有的產(chǎn)奶性狀[12，13］。所以CT基因型個體，T基因型個體在試驗的牛群中分布頻率都不高，因此在生產(chǎn)中，根據(jù)不同的生產(chǎn)目的，及早干預有利基因型在荷斯坦奶牛群體中的頻率，加快高乳蛋白或高乳脂的荷斯坦牛群的組建。

4　結(jié)論

本研究測序發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦牛NKA1B2基因的第2內(nèi)含子存在新的SNP位點C2343T，PCR-SSCP分型發(fā)現(xiàn)3種基因型CC、CT和TT，都與產(chǎn)奶性狀及體細胞數(shù)存在相關，且TT基因型個體相對具有優(yōu)越的產(chǎn)奶性能和良好的乳腺炎抵抗性。因此，NKA1B2基因C2343T可能作為荷斯坦牛產(chǎn)能性能評定的分子遺傳標記，但仍需加大樣本量和試驗研究論證。

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