代富英，戴雨珂，王海娟，蘇森森，杜昕，潘渠，*

（1.成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，四川成都610500；2.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川成都610500）

中國(guó)泡菜乳桿菌種質(zhì)資源調(diào)查

代富英1，戴雨珂2，王海娟1，蘇森森1，杜昕1，潘渠1，*

（1.成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，四川成都610500；2.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川成都610500）

為了進(jìn)一步探索中國(guó)泡菜中乳桿菌種質(zhì)資源，使用自主研發(fā)的乳桿菌快速檢出方法和16sRNA基因測(cè)序鑒定技術(shù)，對(duì)采自14個(gè)省級(jí)行政區(qū)的81份泡菜樣品進(jìn)行了檢測(cè)。乳桿菌分離率為45.7％，證明中國(guó)泡菜中有豐富的乳桿菌種質(zhì)資源。共分離到7種44株乳桿菌。其中植物乳桿菌菌株占分離乳桿菌菌株總數(shù)的79.5％，表明泡菜中乳桿菌的種類以植物乳桿菌為主。在重慶分離到了2012年在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)的福菜乳桿菌，再次證明了該菌種在自然界中的存在。中國(guó)泡菜中的乳桿菌種質(zhì)資源存在地區(qū)差異，乳桿菌分離率較突出的地區(qū)分別是云南（200％），重慶（125％），江蘇（133％）和東北（100％）。湖南泡菜中可能較為缺乏乳桿菌種質(zhì)資源。

中國(guó)泡菜；乳桿菌；16sRNA；益生菌；種質(zhì)資源

乳桿菌（Lactobacillus）是一種公認(rèn)安全無害的微生物，其特征為革蘭染色陽(yáng)性、無芽胞，能夠分解糖分產(chǎn)生乳酸的一類桿菌。乳桿菌廣泛存在于各類發(fā)酵食品中，目前已經(jīng)從乳制品及泡菜等碳源豐富環(huán)境中分離出一百多種乳桿菌［1］。目前的研究表明乳桿菌有明確的益生作用，市場(chǎng)上已經(jīng)開發(fā)出多種乳桿菌制劑用于維持胃腸道健康和胃腸道疾病治療。進(jìn)一步的研究表明，乳桿菌的益生作用可能通過腦腸軸傳遞到大腦，可以使人保持良好的情緒，有可能將乳桿菌開發(fā)為治療自閉癥、焦慮癥和抑郁癥等精神心理性疾病的藥物［2-3］。

中國(guó)制作泡菜的傳統(tǒng)由來已久，在川渝等地尤為明顯。我們前期的工作表明泡菜中有豐富的乳桿菌資源［4］，可能有乳桿菌新種有待于我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。從周邊喜愛制作泡菜的國(guó)家的研究來看，我們也有理由預(yù)期中國(guó)泡菜中有新的乳桿菌，比如韓國(guó)，在泡菜中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)乳桿菌新種，分別命名為：Lactobacillus koreensis、Lactobacillus yonginensis［5］、Lactobacillus ginsenosidimutans［6］、Lactobacillus kimchicus和Lactobacillus kimchii；日本在泡菜中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)乳桿菌新種和亞種，分別命名為：Lactobacillussenmaizukei、Lactobacillusdelbrueckii subsp.Sunkii［7］、Lactobacillus kisonensis、Lactobacillus otakiensis、Lactobacillus rapi和Lactobacillussunkii。

為了進(jìn)一步探索中國(guó)泡菜中乳桿菌種質(zhì)資源，我們使用自主研發(fā)的乳桿菌快速檢出方法，對(duì)81份泡菜樣品進(jìn)行了檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

乳桿菌PCR快速檢出技術(shù)中的引物序列和克隆細(xì)菌16s RNA基因的通用引物序列由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成；小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)omega公司；DNA連接試劑盒購(gòu)自Promega公司；exTaq酶、TVector pMD 19試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；其它化學(xué)試劑購(gòu)自上海生物工程公司。

Veriti型PCR儀：ABI公司；GenePulser X cellTM型電轉(zhuǎn)化儀、UniversalHood II型凝膠電泳成像儀：美國(guó)BIO-RAD公司；1389型超凈工作臺(tái)、LEGENDMicro17型高速離心機(jī)：Thermo公司；mLINE型移液器：芬蘭Biohit公司。

1.2采樣與分離培養(yǎng)

在四川省采樣50份，在外省采樣31份，共采集泡菜樣品81份，泡菜樣品采集地列表見表1。

表1　泡菜樣品采集地列表Table1 The placesof collection of pickle samples

將泡菜樣品中的液體成分使用接種劃線的方法接種至MRS培養(yǎng)基上，MRS培養(yǎng)基偏酸性，是適合乳桿菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，可以富集乳桿菌。經(jīng)過37℃靜置培養(yǎng)18 h～48 h后，培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落，初步肉眼判斷不同的菌落，每個(gè)樣品分別挑出3個(gè)菌落繼續(xù)劃線分離2次，分離純化泡菜樣品中的細(xì)菌。最后每份泡菜只取3個(gè)菌落進(jìn)行鑒定。

MRS培養(yǎng)基配方：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、酵母粉4 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、檸檬酸二銨2 g、去離子水1 L、115℃高溫滅菌20min［8］。

1.3革蘭染色初步鑒定

革蘭染色為陽(yáng)性，菌體為桿狀，觀察不到芽胞的菌株進(jìn)入下一步鑒定。隨乳桿菌菌種不同其桿狀長(zhǎng)短有別，短桿狀與球狀極易混淆。當(dāng)實(shí)驗(yàn)菌株的菌體不呈典型球狀時(shí)，均認(rèn)為是短桿狀。

1.4PCR檢出

對(duì)已通過革蘭染色初步鑒定的菌株使用乳桿菌PCR快速檢出技術(shù)（專利號(hào)：ZL201110205040.6）［9］，檢出其中的乳桿菌菌株，為避免漏檢，對(duì)首次檢測(cè)為陰性的菌株復(fù)檢一次。

1.5測(cè)序鑒定

PCR擴(kuò)增乳桿菌菌株16s RNA基因［4］，克隆后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。根據(jù)16sRNA基因序列，將乳桿菌菌株鑒定到種。

2　結(jié)果與討論

2.1革蘭染色結(jié)果

通過MRS培養(yǎng)基上的劃線分離和革蘭染色鑒定，從81份泡菜樣品分離了94株菌株。其中有65株革蘭陽(yáng)性無芽胞桿菌菌株，6株革蘭陽(yáng)性有芽胞桿菌菌株，15株革蘭陽(yáng)性無芽胞球菌菌株，7株酵母菌菌株，1株革蘭陰性桿菌菌株。65株革蘭陽(yáng)性無芽胞桿菌菌株進(jìn)入下一步鑒定。

分離到的革蘭陽(yáng)性無芽胞桿菌大多數(shù)為較粗較長(zhǎng)的桿菌，少數(shù)為短桿型。在MRS培養(yǎng)基上，這些革蘭陽(yáng)性無芽胞桿菌均長(zhǎng)出乳白色的圓形、突出、光滑的小菌落。

2.2PCR檢出和16sRNA基因測(cè)序結(jié)果

利用乳桿菌PCR快速檢出技術(shù)，對(duì)革蘭染色鑒定為革蘭陽(yáng)性無芽胞桿菌的65菌株進(jìn)行鑒定，初步檢出乳桿菌數(shù)目為55株。再通過16s RNA基因全長(zhǎng)測(cè)序鑒定后，上述55株乳桿菌菌株除4株被鑒定為魏斯氏菌外，其余51株均吻合已有的乳桿菌16sRNA基因序列特征，其中有7株菌株的16sRNA基因序列100％相同，并來自同一泡菜樣品，應(yīng)算作同一菌株，因此此次共分離乳桿菌菌株44株，81份泡菜樣品中分離的乳桿菌種類和數(shù)量表見表2（魏斯氏菌是革蘭陽(yáng)性的短桿菌，是乳桿菌屬近緣菌屬，我們的乳桿菌PCR快速檢出技術(shù)無法區(qū)別）。

表2　81份泡菜樣品中分離的乳桿菌種類和數(shù)量表Table2 The speciesand amountof Lactobacillussp.isolated from Chinesepicklesam ples

本次調(diào)查的81份泡菜樣品中有37份樣品分離到乳桿菌，乳桿菌分離率為45.7％。相比上一次初步調(diào)查（36.5％），乳桿菌分離率有所上升。兩次調(diào)查都證明泡菜中富含乳桿菌種質(zhì)資源。分離的44株乳桿菌菌株分別屬于7個(gè)種，分別是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、清酒乳桿菌（Lactobacillussakei）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、食品乳桿菌（Lactobacillusalimentarius）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、福菜乳桿菌（Lactobacillus futsaii）和彎曲乳桿菌（Lactobacilluscurvatus）（表2）。分離的44株乳桿菌菌株中有35株是植物乳桿菌菌株，占分離乳桿菌菌株總數(shù)的79.5％。該結(jié)果表明泡菜中乳桿菌的種類以植物乳桿菌為主，符合植物乳桿菌與植物伴生的特點(diǎn)。福菜乳桿菌是2012年在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)的乳桿菌新種［10］，本次調(diào)查，我們?cè)谥貞c分離到了3株福菜乳桿菌，再次證明了該菌種在自然界中的存在，并將其分布從臺(tái)灣擴(kuò)展到了重慶。

2.3分離乳桿菌菌株在中國(guó)的分布

中國(guó)共34個(gè)省級(jí)行政區(qū)，我們從傳統(tǒng)上喜愛制作泡菜的地區(qū)采集泡菜樣品，在14個(gè)省級(jí)行政區(qū)采取了81份泡菜樣品。8個(gè)行政區(qū)分離出了乳桿菌，分別是：四川19株，云南10株，重慶5株，江蘇4株，貴州1株，北京3株，遼寧1株，吉林1株。

中國(guó)泡菜分南北兩系，南方以四川泡菜為代表，流行于云貴川渝四地，北方以東三省的朝鮮族辣白菜為代表。川渝兩地為南派泡菜發(fā)源地，我們?cè)谶@兩個(gè)地區(qū)密集采樣，采集了54份泡菜樣品，分離出3種24株乳桿菌，占總分離乳桿菌株數(shù)的54.5％。在四川分離的乳桿菌最多。在北派泡菜發(fā)源地東北地區(qū)僅采集了2份泡菜樣品，其乳桿菌分離率達(dá)到了100％。乳桿菌分離率較突出的地區(qū)還有3個(gè)，分別是云南（200％），重慶（125％）和江蘇（133％）。在湖南采樣6份，都沒有分離到乳桿菌菌株，分離到的是4株魏斯氏菌菌株。魏斯氏菌也是乳酸菌，能像乳桿菌一樣發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸。可能湖南泡菜的酸化過程主要是魏斯氏菌在起作用，湖南泡菜中可能較為缺乏乳桿菌種質(zhì)資源。

分離的7種乳桿菌菌種的分布情況為：云南4種，重慶3種，江蘇2種，四川1種，貴州1種，北京1種，遼寧1種，吉林1種。較為突出的是云南和重慶，可以肯定兩地的泡菜中存在豐富的乳桿菌種質(zhì)資源。四川雖然分離到了最多的乳桿菌菌株，但都是植物乳桿菌，表明四川的泡菜中乳桿菌的含量雖然豐富，但種類可能比較單一。

已有的文獻(xiàn)都表明四川與云南地區(qū)乳桿菌種質(zhì)資源豐富［11］。我們的研究進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。北派泡菜中乳桿菌研究起步較晚，但取得了很好的成果，發(fā)現(xiàn)了5種新的乳桿菌：牡丹江乳桿菌（Lactobacillusmudanjiangensis）、松花江乳桿菌（Lactobacillus songhuajiangensis）、嫩江乳桿菌（Lactobacillus nenjiangensis）、黑龍江乳桿菌（Lactobacillus heilongjiangensis）和香坊乳桿菌（Lactobacillusxiangfangensis）［12-14］。

3　結(jié)論

我們的研究表明，中國(guó)泡菜中存在豐富的乳桿菌種質(zhì)資源，其種類以植物乳桿菌為主，分布上存在地區(qū)差異。湖南泡菜中可能較為缺乏乳桿菌種質(zhì)資源。云南和重慶地區(qū)的泡菜中有豐富的乳桿菌種質(zhì)資源，進(jìn)一步的調(diào)查可能發(fā)現(xiàn)乳桿菌新種。乳桿菌是益生菌，是一種寶貴的資源，對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中蘊(yùn)含的乳桿菌種質(zhì)資源有進(jìn)一步發(fā)掘的必要。

［1］Endo A，Irisawa T，F(xiàn)utagawa-Endo Y，etal.Lactobacillus faecis sp. nov.，isolated from animal faeces［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2013，63（12）：4502-4507

［2］Bravo JA，F(xiàn)orsythe P，Chew M V，etal.Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in amouse via the vagusnerve［J］.Proc Natl Acad SciUSA，2011，108（38）：16050-16055

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［4］楊四佳，王穎，李宇婷，等.泡菜中乳桿菌的快速檢出和乳桿菌質(zhì)粒資源的初步調(diào)查［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，32（6）：639-644

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Investigation on Lactobacillus Germp lasm Resources of Chinese Pickle

DAI Fu-ying1，DAI Yu-ke2，WANG Hai-juan1，SU Sen-sen1，DU Xin1，PAN Qu1，*
（1.Department of Pathogenic Biology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China；2.Department of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China）

For investigation on Lactobacillus germplasm resources of Chinese pickle，81 samples of Chinese pickle from 14 provinces were collected，and Lactobacillus strains from these samples were isolated using 16 s RNA gene sequencing and rapid-detection PCR technology for Lactobacillus which was designed by our selves.The isolating rate of Lactobacillus strains was 45.7％，which showed there had rich Lactobacillus germplasm resources in Chinese pickle.7 Lactobacillus sp.and 44 Lactobacillus strainswere detected.79.5％ of isolated Lactobacillus strainswere Lactobacillusplantarum strainswhich indicated the dominance Lactobacil－lussp.in Chinese picklewas Lactobacillusplantarum.3 Lactobacillus futsaii strainswere isolated in Chongqing，whichwas first found atTaiwan in 2012.Thereare regionaldifferences in thegermplasm resourcesof Lactobacillus in Chinese pickle.The isolation rate of Lactobacillus strains ismore prominent in Yunnan（200％），Chongqing（125％），Jiangsu（133％）and Northeast region（100％）.Hunan pickles may be lack of Lactobacillus germplasm resources.

Chinesepickle；Lactobacillus；16sRNA；probiotic；germplasm resources

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.038

國(guó)家自然科學(xué)基金（31170007）；四川省教育廳科技基金重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZA0219）；成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（CYXK2012005）；成都醫(yī)學(xué)院科研基金項(xiàng)目（CYZ13-019）

代富英（1978—），女（漢），講師，碩士，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專業(yè)。

潘渠（1973—），男（漢），副教授，博士，主要從事益生菌研究。

2015-11-04