梁锏文，李智斌，陳柏銓

（廣東中科天元新能源科技有限公司，廣東廣州510640）

利用JMP軟件優(yōu)化威蘭膠發(fā)酵培養(yǎng)基

梁锏文，李智斌，陳柏銓

（廣東中科天元新能源科技有限公司，廣東廣州510640）

利用統(tǒng)計分析軟件JMP的試驗設計（DOE）功能（包括Plackett-Burman設計、析因設計、中心組合設計，預測刻畫等）對威蘭膠發(fā)酵菌株Alcaligenessp.Y5的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，得到一組最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖52.9 g/L、牛肉膏4.0 g/L、K2HPO4·7H2O 2.2g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO32.0 g/L，吐溫80 0.5 g/L。優(yōu)化后威蘭膠產量由初始的15.72 g/L提高到26.58g/L，提高了69.08％。

JMP；威蘭膠；優(yōu)化；Plackett-Burman設計；析因設計；預測刻畫

威蘭膠（welan gum）是由某些產堿桿菌Alcaligenes sp.以及鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.合成的微生物雜多糖［1］，是美國斯比凱可公司（CPKelco）20世紀80年代繼黃原膠、結冷膠之后開發(fā)的第3代微生物胞外多糖之一，其分子量高達數百萬。它的結構骨架由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重復單元構成，側鏈由單一的L-甘露糖或L-鼠李糖構成［2］，結構見圖1。

圖1　威蘭膠結構式Fig.1 Thestructureofwelan gum

威蘭膠水溶液具有假塑性流體特征，其低濃度水溶液具有很高的粘度，并具有良好的穩(wěn)定性，溫度升高至150℃時，其黏度基本不變，其耐溫極限值比黃原膠高20℃～30℃。威蘭膠水溶液對酸、堿穩(wěn)定，其黏度在pH2～13范圍內基本不受影響［3-4］；威蘭膠溶液具有獨特的剪切稀釋性能，這一點在石油鉆井中發(fā)揮突出的作用［5］。威蘭膠溶液的獨特性質超越其它多糖，可作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、潤滑劑、成膜劑和粘合劑應用于石油、混凝土、食品、油墨等工業(yè)［1，6-8］。目前僅美國Kelco公司商業(yè)化生產威蘭膠，國內尚處于實驗室研究的起步階段。

培養(yǎng)基優(yōu)化的方法很多，除單因素試驗優(yōu)化外，還包括正交設計，均勻設計，響應面優(yōu)化等方法［9］，許多試驗設計優(yōu)化和分析都可借助一些商業(yè)軟件如Design Expert、DPS、SAS、SPSS、Minitab、JMP等來完成。其中JMP是SAS推出的一種交互式可視化統(tǒng)計發(fā)現軟件，作為一款優(yōu)秀的圖形化統(tǒng)計分析軟件，其試驗設計（DOE）內容豐富（包括定制設計、篩選設計、響應面設計、非線性設計、空間填充設計、混料設計、加速壽命設計、擴充設計等），試驗設置非常靈活，試驗分析功能強大（模型擬合、圖形展示、數據挖掘、模擬器等），利用JMP的試驗設計可大大提高試驗效率。本文以分離篩選的威蘭膠發(fā)酵菌株為對象，利用JMP軟件試驗設計（DOE）功能對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行設計優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基配方，并應用于發(fā)酵罐發(fā)酵試驗，驗證實際效果，為進一步擴大試驗提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株與培養(yǎng)基

菌株（產堿桿菌Alcaligenessp.Y5）：廣東省生物液體燃料（中科天元）工程技術研究中心實驗室保藏。

斜面培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0±0.2。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO4·7H2O 2，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0±0.2。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖40，蛋白胨4，K2HPO4·7H2O 2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCO33.0，FeSO4·7H2O 0.01，吐溫80 0.5，pH 7.0±0.2。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)方法

1.2.1.1種子培養(yǎng)

250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基50mL，接種活化好的菌種斜面1環(huán)～2環(huán)，30℃，搖床轉速200 r/min培養(yǎng)18 h～20 h。

1.2.1.2發(fā)酵培養(yǎng)

250mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50mL，按5％（體積分數）的接種量接種培養(yǎng)好的種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，搖床轉速250 r/min培養(yǎng)72 h。

1.2.2試驗分析方法

1.2.2.1威蘭膠產量測定

發(fā)酵液經80℃水浴滅活20min，冷卻后加入2倍體積的95％乙醇，劇烈震蕩至出現絮狀沉淀，4℃靜置過夜，8 000 r/min離心20min，棄去上清液，再用95％乙醇洗滌沉淀2次，將沉淀物于60℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.2.2.2黏度的測定

用SNB-1數字粘度計（上海精天），4號轉子，30 r/min，室溫測定發(fā)酵液黏度。

1.2.3試驗優(yōu)化步驟及軟件

首先采用Plackett-Burman試驗設計從眾多發(fā)酵培養(yǎng)基組分中篩選出影響威蘭膠產量的重要影響因子；再通過析因設計對篩選的重要因子進行初步優(yōu)化，確定最佳范圍；最后利用中心組合設計進行高級優(yōu)化，并利用JMP的刻畫器預測出最佳培養(yǎng)基組分及產量，最后對該培養(yǎng)基組分進行驗證。

試驗設計及分析軟件為JMP 9.0試用版。

2　結果與討論

2.1Plackett-Burman設計

Plackett-Burman設計是一種兩水平的試驗優(yōu)化方法，可以用最少的試驗次數達到使因子的主效果得到盡可能精確的估計，適用于從眾多的考察因子中快速有效地篩選出最為重要的幾個因子。本文從初始發(fā)酵培養(yǎng)基組分出發(fā)，各組分及水平設置見表1。利用JMP試驗設計中的篩選設計，響應Y值為威蘭膠產量，添加8個連續(xù)因子，設計類型為Plackett-Burman，添加3個中心點，試驗共15組，所得設計表及結果見表2。

表1　Plackett-Burm an設計中培養(yǎng)基組分及水平設置Table1 M edia componentsand test levels for Plackett-Burm an experim ent

表2　Plackett-Burman試驗及結果Table2 Plackett-Burman experimentand results

Plackett-Burman試驗參數估計見表3。

表3　Plackett-Burman參數估計Table3 Param etersestimatesof Plackett-Burm an experiment

從表3中可以看出，R2=0.990 9，調整R2=0.978 9，失擬P=0.653 7＞0.05，一階模型擬合良好。重要影響因子且為正效應的有葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨和K2HPO4·7H2O（P＜0.05），其中牛肉膏和蛋白胨均為氮源，考慮到成本因素，后續(xù)試驗采用牛肉膏作為氮源；培養(yǎng)基組分中FeSO4·7H2O為重要影響因子（P＜0.05）且為負效應，其低水平為0，故從培養(yǎng)基中剔除；其它因子影響不大，都取低水平進行下一步試驗。

2.2析因設計

從2.1的Plackett-Burman試驗可知發(fā)酵培養(yǎng)基組分中葡萄糖、牛肉膏、K2HPO4·7H2O為正效應，提高各組分用量可以提高威蘭膠產量，由于試驗因素較少，可采用JMP給定的完全析因設計方案，添加3個中心點，試驗共11組，試驗設計及結果見表4。

表4　析因試驗設計及結果Tab le4 Factorialexperim entand results

根據表4試驗結果，進行一階模型擬合，結果見表5。

表5　析因設計一階模型參數估計Table5 Param etersestimatesof first-orderm odel from factorial experim ent

由表5可知，R2=0.566 4，調整R2=-0.445 2，失擬P=0.009 9＜0.05，說明一階模型擬合較差，存在彎曲效應。

重新對表4結果運行篩選腳本（分析-建模-篩選），結果見表6。

表6　析因設計因子篩選結果Table6 Factor screening results from factorialexperiment

從表6中可以看出，影響顯著的因子有葡萄糖X1，K2HPO4·7H2O X4和葡萄糖的二次效應X12，其它因子影響不顯著（其中牛肉膏為負效應，后續(xù)試驗保持低水平）。利用這3個重要因子重新構建模型，結果見表7。

表7　析因設計二階模型參數估計Tab le7 Param etersestimatesof second-orderm odel from factorialexperiment

由表7可知，R2=0.987 7，調整R2=0.982 4，失擬P= 0.356 6＞0.05，說明二階模型擬合良好，二階方程為Y= 25.20+3.43X1-0.51X4-5.78X12。

利用JMP的刻畫器功能，以最大化期望（威蘭膠產量最大化）進行預測，如圖2所示。

圖2　析因設計威蘭膠產量預測Fig.2 Forecastofwelan gum production from factorialexperiment

由圖2所示，當培養(yǎng)基中葡萄糖為53.0 g/L，K2HPO4·7H2O為2.0 g/L，預計威蘭膠產量達到最高，為（26.22±0.83）g/L（期望值為0.857 9）。

2.3中心組合設計

通過析因試驗的初步優(yōu)化結果可知葡萄糖和K2HPO4·7H2O為重要影響因子，且濃度分別為53.0g/L、2.0 g/L時，預計威蘭膠產量達到最高，故在此基礎上進行中心組合設計，設計表及結果見表8。

表8　中心組合設計及結果Table8 Central compositon design and results

中心組合設計參數估計和方差分析見表9和表10。

由表9、表10可知，R2=0.973 1，調整R2=0.939 4，失擬P=0.169 5＞0.05，說明模型擬合良好，二階方程為Y=26.56+0.01X1+1.13X4-0.16X1X4-1.55X12-1.17X42。

表9　中心組合設計參數估計Tab le9 Parametersestimatesof centralcom positon design

表10　中心組合設計方差分析Table10 Analysisof varianceof centralcom positon design

再次利用JMP刻畫器進行預測，如圖3和圖4。

圖3　中心組合設計威蘭膠產量預測Fig.3 Forecastofwelan gum production from centralcom positon design

圖4　響應面圖Fig.4 Responsesurfacesp lot

由圖2和圖3可知，當培養(yǎng)基中葡萄糖為52.9g/L，K2HPO4·7H2O為2.2 g/L，預計威蘭膠產量為（26.83± 0.72）g/L（期望值為0.949 1），另外，從圖2可以看出，當葡萄糖含量超過52.89 g/L時，產量不再提高，而呈下降趨勢，這可能有二方面原因，一是過高的葡萄糖濃度抑制了威蘭膠的合成，二是威蘭膠發(fā)酵過程中黏度升高，影響了培養(yǎng)基中氧的傳遞，氧成為威蘭膠發(fā)酵的限制因子［10］，導致產量不再增高。

通過上述優(yōu)化步驟，最終得出的威蘭膠發(fā)酵配方為（g/L）：葡萄糖52.9，牛肉膏4.0，K2HPO4·7H2O 2.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCO32.0，吐溫80 0.5。經過3次平行驗證試驗威蘭膠產量為（26.58±0.16）g/L，與預測值進行均值比較P=0.593 1＞0.05，無顯著性差異，證明了與JMP預測結果相符。

3　結論

通過單因素試驗，Plackett-Burman設計，析因設計，中心組合設計以及利用JMP軟件的預測刻畫功能，得到最佳威蘭膠發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖52.9 g/L、牛肉膏4.0 g/L、K2HPO4·7H2O 2.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCO32.0 g/L，吐溫80 0.5 g/L。優(yōu)化后威蘭膠產量由初始的15.72 g/L提高到26.58 g/L，提高了69.08％。

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Optim ization of Fermentation Media for Welan Gum Using JMP

LIANG Jian-wen，LI Zhi-bin，CHEN Bai-quan
（Guangdong Zhongke Tianyuan New Energy Scienceand Technology Co.，Ltd.，Guangzhou 510640，Guangdong，China）

The statistical analysis soft ware JMP（its function include sPlackett-Burman design，Factorialdesign，Central compositon design，Prediction Profiler etal.）wasapplied to optimize the fermentationmedium ofwelan gum by Alcaligenes sp.Y5.The optimal composition of themedium was determined as glucose 52.9 g/L，beef extract4.0g/L，K2HPO4·7H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO32.0g/L，Tween800.5g/Lbyusing theoptimised medium，thewelan gum production increased from 15.72 g/L to26.58 g/L，with an increaseof69.08％.

JMP；welangum；optimization；Plackett-Burmandesign；Factorialdesign；Predictionprofiler

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.024

梁锏文（1980—），男（漢），碩士，研究方向：工業(yè)微生物。

2015-11-04