張 曉 朱彩平 鄧 紅 張 揚 胡昌耀

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119)

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均勻設(shè)計優(yōu)化超聲協(xié)同酶法提取平菇多糖工藝

張 曉 朱彩平 鄧 紅 張 揚 胡昌耀

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119)

利用均勻設(shè)計法對超聲波輔助纖維素酶提取平菇多糖的工藝進行優(yōu)化。選取pH值、提取溫度、液料比、加酶量、酶解時間、超聲功率及超聲時間7個因素進行單因素試驗，在單因素試驗的基礎(chǔ)之上選擇各個因素的較優(yōu)水平，按照U18(95×62)的混合均勻設(shè)計進行試驗，考察各因素及其交互作用對平菇多糖得率的影響，預(yù)測和驗證最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明：超聲波輔助纖維素酶提取平菇多糖的最佳工藝為：超聲功率120 W，提取溫度25 ℃，液料比22∶1 (mL/g)，pH 7.5，加酶量0.5%，酶解時間6 min，超聲時間69 min。在該條件下，平菇多糖得率為(36.71±0.46)%，該方法提取平菇多糖工藝簡單可行，得率高。

平菇；多糖；超聲波輔助提?。焕w維素酶

多糖(polysaccharides)及其復(fù)合物普遍存在于高等動、植物細胞膜及微生物細胞壁中，是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物，其與蛋白質(zhì)、核酸、脂類構(gòu)成了最基本的4類生命物質(zhì)，對維持生命活動起著至關(guān)重要的作用，而且具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1-3]。平菇(Pleurotusostreatus)又名側(cè)耳，是廣泛栽培的食用菌之一[4]。平菇多糖(PleurotusostreatusPolysaccaride, POP)是從平菇中提取出的一種重要成分，近年來也被證實具有多種生理功效，如增強免疫、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、減輕及治療消化器官潰瘍等[5-8]。

目前，平菇多糖的提取方法主要有熱水浸提法[9]14、微波法[10]、超聲波法[4]和酶法[11]。使用熱水浸提法提取平菇多糖，簡單易行、成本低廉，但是這種方法需要熱水長時間作用，且多糖得率低，此外，大量的提取溶劑也為后續(xù)的濃縮過程增加工作量。微波輔助提取可在短時間內(nèi)迅速提高組織細胞的溫度和壓力至細胞破裂，使細胞內(nèi)含物釋放至溶劑中，具有提取率高、節(jié)能省時的優(yōu)點[9]2；但是，有試驗[12]結(jié)果表明，微波輔助提取的多糖提取率、抗氧化特性和相對分子質(zhì)量均呈現(xiàn)降低趨勢，且隨著時間的延伸，相對分子質(zhì)量逐步降低。超聲波具有“空化現(xiàn)象”、“機械振動”及“熱效應(yīng)”等特性，可破碎被提取原料的細胞壁，加速目標提取物的溶出并進一步強化溶出成分的擴散，提高破碎速度，從而極大地提高提取效率，節(jié)約提取成本，提高得率[13-15]。酶解法具有反應(yīng)條件溫和、不易破壞食用菌多糖立體結(jié)構(gòu)和生物活性、提取率高等優(yōu)點[16]，但是提取時間較長，能量消耗大。由于平菇多糖通常被包裹在平菇細胞壁內(nèi)，因此本試驗擬將超聲波法和纖維素酶法兩種技術(shù)同時應(yīng)用于平菇多糖的提取，并使用混合水平均勻設(shè)計的試驗方法，優(yōu)化超聲波輔助纖維素酶提取平菇多糖的工藝，以期獲得快速、高效且反應(yīng)條件溫和的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

平菇子實體：渭南地區(qū)市售。

1.2 試劑

纖維素酶：β-1，4-葡聚糖葡糖苷水解酶9012-54-8，酶活3 000萬 U/g，上海藍季科技發(fā)展有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市天力化學試劑有限公司。

1.3 儀器

數(shù)顯鼓風干燥箱：GZX-9146型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

搖擺式高速萬能粉碎機：DFY-300型，溫嶺市林大機械有限公司；

分析天平：BS 224 S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

實驗室pH計：PHSJ-3F型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

數(shù)控超聲清洗器：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-C型，太倉市實驗設(shè)備廠(蘇州培英實驗設(shè)備有限公司)；

電熱恒溫水浴鍋：HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司；

低速大容量離心機：D.L-4C型，上海安亭科學儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHN-III型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠。

1.4 試驗方法

1.4.1 平菇干粉制備 市售平菇，選取子實體部分，50 ℃烘干，粉碎，過60目篩得干粉，備用。

1.4.2 平菇多糖的提取工藝

平菇干粉→加蒸餾水→調(diào)整pH值→超聲波處理→酶解→沸水浴滅酶→冷卻→離心(4 000 r/min， 20 min)→得上清液，并對沉淀物進行二次提取→合并上清液→在50 ℃下旋蒸濃縮→85%乙醇沉淀→真空抽濾→沉淀→50 ℃干燥至恒重→平菇粗多糖

1.4.3 單因素試驗 選擇7個因素，即pH值、提取溫度、液料比、加酶量、酶解時間、超聲功率及超聲時間進行單因素試驗，以蒸餾水為提取液，分別考察各個單因素對多糖得率的影響。

(1) pH值對平菇多糖得率的影響：設(shè)定液料比30∶1 (mL/g)、加酶量2.0%、酶解時間60 min、提取溫度55 ℃、超聲時間60 min、超聲功率180 W，考察pH值(3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5)對平菇多糖得率的影響。

(2) 提取溫度對平菇多糖得率的影響：設(shè)定液料比30∶1 (mL/g)、pH值5.0、加酶量2.0%、酶解時間60 min、超聲時間60 min、超聲功率180 W，考察溫度 (15，25，35，45，55，65 ℃)對平菇多糖得率的影響。

(3) 液料比對平菇多糖得率的影響：設(shè)定pH值5.0、加酶量2.0%、提取溫度35 ℃、酶解時間60 min、超聲時間60 min、超聲功率180 W，考察液料比(10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1 mL/g)對平菇多糖得率的影響。

(4) 加酶量對平菇多糖得率的影響：設(shè)定pH值5.0、提取溫度35 ℃、液料比30∶1 (mL/g)、酶解時間60 min、超聲時間60 min、超聲功率180 W，考察加酶量(0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%)對平菇多糖得率的影響。

(5) 酶解時間對平菇多糖得率的影響：設(shè)定pH值5.0、提取溫度35 ℃、液料比30∶1 (mL/g)、加酶量0.5%、超聲時間60 min、超聲功率180 W，考察酶解時間(0，5，10，15，20，25，30，35 min)對平菇多糖得率的影響。

(6) 超聲功率對平菇多糖得率的影響：設(shè)定pH值5.0、提取溫度35 ℃、液料比30∶1 (mL/g)、加酶量0.5%、酶解時間10 min、超聲時間60 min，考察超聲功率(100，120，140，160，180，200 W)對平菇多糖得率的影響。

(7) 超聲時間對平菇多糖得率的影響：設(shè)定pH值5.0、提取溫度35 ℃、液料比30∶1 (mL/g)、加酶量0.5%、酶解時間10 min、超聲功率140 W，考察超聲時間(5，20，35，50，65，80，95 min)對平菇多糖得率的影響。

1.4.4 均勻設(shè)計試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行混合水平均勻設(shè)計試驗，得出超聲波輔助纖維素酶提取平菇多糖的最佳工藝。

1.4.5 平菇多糖的得率 按式(1)進行計算：

(1)

式中：

R——平菇多糖的得率，%；

m1——平菇粗多糖的質(zhì)量，g；

m2——平菇干粉的質(zhì)量，g。

1.4.6 試驗統(tǒng)計與分析 使用Excel 2010版對單因素試驗進行分析，DPS 12.01版對U18(95×62)混合水平均勻設(shè)計試驗進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH值對平菇多糖得率的影響 由圖1可知，當pH<5.0時，平菇多糖的得率隨著pH值的增大而提高，在pH=5.0時，平菇多糖得率達到最大值，這是因為不同的pH值對所加入的纖維素酶產(chǎn)生了不同的影響，過酸不利于酶活性的發(fā)揮，在此變化過程中纖維素酶的活性由弱到強，至5.0時達到其最適酸堿度因而活性最強。當pH>5.0時，平菇多糖的得率隨著pH值的增大而減小，是由于過堿的外部環(huán)境亦不利于酶活性作用的發(fā)揮，外部環(huán)境酸堿度逐漸偏離其最適pH值，導(dǎo)致得率逐漸降低。所以，提取液的pH值不能過于偏離本試驗所加入纖維素酶的最適酸堿度，否則不利于纖維素酶發(fā)揮活性作用分解平菇組織中的纖維素，輔助多糖溶出，導(dǎo)致得率降低。因此，pH值以5.0為宜。

圖1 pH值對平菇多糖得率的影響

2.1.2 提取溫度對平菇多糖得率的影響 由圖2可知，在一定溫度范圍內(nèi)，平菇多糖得率隨溫度的升高而升高，至35 ℃時得率達到最大值。這主要是由于不同的溫度對纖維素酶發(fā)揮其活性作用產(chǎn)生了不同程度的影響，溫度過低，不利于纖維素酶發(fā)揮其活性作用；隨著溫度不斷升高至其最適溫度，纖維素酶的活性不斷增大，而35 ℃基本接近于纖維素酶的最適溫度。當提取溫度繼續(xù)升高時，多糖得率逐漸降低，這是由于溫度過高也會破壞酶的活性，甚至會導(dǎo)致酶失活。從35 ℃到55 ℃，得率降低比較緩慢，這是因為在此范圍內(nèi)的溫度變化對酶的影響較小；而從55 ℃到65 ℃，得率降低趨勢明顯，這是因為65 ℃已經(jīng)接近于滅活溫度，使酶的活性急劇降低。因此，提取溫度以35 ℃為宜。

圖2 提取溫度對平菇多糖得率的影響

2.1.3 液料比對平菇多糖得率的影響 由圖3可知，液料比從10∶1 (mL/g)增加到30∶1 (mL/g)時，平菇多糖得率隨著提取液比例的增大而增大，當液料比為30∶1 (mL/g)時多糖得率達到最大，這是因為提取液所占比例由小變大時，溶劑與浸提物的接觸變得更加充分，能夠在相同的時間內(nèi)溶出更多的水溶性多糖，使得率增大；當液料比達到30∶1 (mL/g)時，多糖溶解基本飽和。之后，隨著提取液比例的增大多糖得率減小，由于提取液體積繼續(xù)變大，會消耗更多的時間和能量，同時也會增加超聲波穿透介質(zhì)(即提取液)粉碎細胞的阻力，使得細胞被粉碎程度下降，從而降低有效成分的得率[3]。因此，液料比以30∶1 (mL/g)為宜。

2.1.4 加酶量對平菇多糖得率的影響 由圖4可知，加酶量從0.1%增加至0.5%，平菇多糖得率逐漸增大，至0.5%時多糖得率達到最大值，這是因為纖維素酶可以破壞細胞壁，輔助多糖溶出，具有高效性，隨著酶量加大，平菇細胞壁被愈加充分地分解，得率提高，當加酶量達到0.5%時，底物濃度正好飽和，得率最高。加酶量從0.5%增至0.7%，多糖得率逐漸降低，可能是酶的高效性使多糖更加迅速溶出，而溶出的多糖在超聲的過程中結(jié)構(gòu)被破壞，以及加酶量過高出現(xiàn)反饋抑制。因此，加酶量以0.5%為宜。

圖3 液料比對平菇多糖得率的影響

圖4 加酶量對平菇多糖得率的影響

2.1.5 酶解時間對平菇多糖得率的影響 由圖5可知，隨著酶解時間的延長平菇多糖的得率逐漸提高，至10 min時平菇多糖得率最大，原因是隨著酶解時間的延長，纖維素酶與平菇細胞壁的作用更加充分，細胞壁被破壞的程度更加徹底，平菇細胞組織內(nèi)水溶性多糖更容易溶出，得率隨之提高；酶解時間延長至10 min時多糖得率達到最大值。之后，平菇多糖得率隨著酶解時間的繼續(xù)延長而逐漸降低，這是由于隨著酶解時間的繼續(xù)延長，已經(jīng)溶出的部分多糖在超聲波機械剪切作用下結(jié)構(gòu)被破壞。因此，酶解時間以10 min為宜。

2.1.6 超聲功率對平菇多糖得率的影響 由圖6可知，在100～140 W時，平菇多糖得率隨超聲功率的增大逐漸提高，這是因為隨著超聲功率的增大，超聲波對平菇細胞壁的破壞作用逐漸增強，細胞內(nèi)水溶性多糖的溶出更加徹底，得率也隨之提高；當超聲功率達到140 W時，多糖得率達到最大值；而在超聲功率從140 W增至200 W的過程中，平菇多糖得率逐漸降低，可能的原因主要有兩方面：① 超聲功率過大，超聲波產(chǎn)生的機械剪切力過強，導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞；② 當超聲功率大于140 W時，超聲作用進一步加速了提取液的流動，從而減少了物料在超聲場中的有效停留時間，破壁作用也隨之減弱[3]。因此，超聲功率以140 W為宜。

圖5 酶解時間對平菇多糖得率的影響

圖6 超聲功率對平菇多糖得率的影響

2.1.7 超聲時間對平菇多糖得率的影響 由圖7可知，在一定時間范圍內(nèi)，平菇多糖得率隨著超聲時間的增大而提高；當超聲時間達到50 min時，多糖得率達到最大值；之后，隨著超聲時間的繼續(xù)延長，平菇多糖的得率緩慢降低。這是因為剛開始時，提取液中不含多糖，隨著超聲的進行和超聲時間的延長，超聲波不斷破壞平菇的細胞壁，平菇細胞中的水溶性多糖逐漸溶出，進入提取液中；超聲時間為50 min時，細胞內(nèi)多糖得到相當充分的溶出，多糖得率最大；之后，隨著超聲時間的繼續(xù)延長，已經(jīng)溶出的多糖持續(xù)地暴露在超聲波產(chǎn)生的機械剪切力之下，部分多糖結(jié)構(gòu)被破壞，所以多糖得率有所下降。因此，超聲時間以50 min為宜。

圖7 超聲時間對平菇多糖得率的影響

2.2 均勻設(shè)計試驗

2.2.1 均勻設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇超聲功率、提取溫度、液料比、pH、加酶量、酶解時間及超聲時間7個因素的較優(yōu)水平，按照U18(95×62)設(shè)計進行混合水平均勻試驗，因素與水平表見表1。

2.2.2 均勻試驗結(jié)果及分析 采用DPS 12.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)點，降低數(shù)據(jù)點的中心偏差和相關(guān)性，從而提高擬合數(shù)據(jù)的準確度。按照優(yōu)化之后的數(shù)據(jù)點，每次提取平菇干粉5.0 g?；旌暇鶆蛟囼灲Y(jié)果見表2。

采用DPS 12.01版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗結(jié)果進行分析，并采用多因子及互作項逐步回歸的方法對試驗?zāi)Ｐ瓦M行擬合，得擬合方程：

y=-19.423 7-0.522 5X2+6.629 4X4+13.275 2X5+0.935 9X7+0.002 7X1X2-0.027 5X1X5-0.002 4X1X7-0.018 4X2X4+0.010 2X2X5+0.000 8X2X7+0.000 5X3X4-0.805 8X4X5+0.019 6X4X6-0.04X4X7-0.089X5X7-0.003 2X6X7。

(2)

復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.999 999，決定系數(shù)R2=0.999 998，剩余標準差SSE=0.001 2，調(diào)整相關(guān)系數(shù)Ra=0.999 983，調(diào)整決定系數(shù)Ra2=0.999 966。說明所得方程可以較好地擬合平菇多糖提取過程，方程有意義。

由表3可知：提取溫度、pH、加酶量及超聲時間對平菇多糖得率具有極顯著影響；超聲功率、液料比和超聲時間對得率的影響不顯著，超聲功率分別與提取溫度、加酶量、超聲時間的交互作用、液料比與pH的交互作用、酶解時間與超聲時間的交互作用對平菇多糖得率的影響均有極顯著差異；此外，提取溫度分別與pH、加酶量、超聲時間的交互作用，pH分別與加酶量、酶解時間、超聲時間的交互作用，加酶量與酶解時間的交互作用對得率的影響具有極顯著差異。

同時，由DPS 12.01版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)得到最優(yōu)因素組合：超聲功率107.43 W，提取溫度25.38 ℃，液料比22.12∶1 (mL/g)，pH值7.5，加酶量0.5%，酶解時間5.13 min，超聲時間68.99 min。

表1 混合水平均勻設(shè)計試驗因素與水平表

表2 混合水平均勻設(shè)計試驗方案及試驗結(jié)果

表3 數(shù)據(jù)模型因素的相關(guān)性分析

2.2.3 最佳工藝的確定及驗證 以DPS 12.01版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)給出的最優(yōu)因素組合為基礎(chǔ)，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，為方便實際操作將最佳工藝參數(shù)調(diào)整如下：超聲功率120 W，提取溫度25 ℃，液料比22∶1 (mL/g)，pH 7.5，加酶量0.5%，酶解時間6 min，超聲時間69 min。按照如上條件，進行3次驗證實驗，平菇多糖的得率為(36.71±0.46)%?？芍?，本試驗所得得平菇多糖提取工藝簡單可行，得率高。

2.3 不同提取方法的比較

將平菇多糖的不同提取方法進行比較(見表4)可發(fā)現(xiàn)，超聲波協(xié)同酶法提取平菇多糖，得率大幅度提高；提取時間較單純超聲提取和單純酶法提取稍長，但與熱水浸提相比大為縮短；液料比接近其它方法的一半，可大幅減少提取液的消耗，縮短濃縮時間，減少污水排放；提取溫度為室溫25 ℃，不用加熱，可減少能源消耗。由此可見，超聲波協(xié)同酶法提取平菇多糖，可提高提取得率，減少原料消耗，縮短提取時間，降低能耗。

3 結(jié)論

本試驗以混合水平均勻試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，得到超聲波輔助纖維素酶法提取平菇多糖的最佳工藝條件：超聲功率120 W，提取溫度25 ℃，液料比22∶1(mL/g)，pH 7.5，加酶量0.5%，酶解時間6 min，超聲時間69 min，平菇多糖的平均得率為36.71%。與傳統(tǒng)方法相比，本試驗方法不僅大幅提高了多糖得率，縮短了提取時間，還節(jié)能減排，可為平菇多糖的開發(fā)利用及其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

表4 不同提取方法之間的比較

本研究提供了一種平菇多糖超聲協(xié)同酶法輔助提取的高效方法，但該方法所得平菇多糖的純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性還有待進一步研究。

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Optimization of ultrasonic assisted cellulase extraction process of Pleurotus ostreatus polysaccharide by uniform design

ZHANG XiaoZHUCai-pingDENGHong李 云LIYunZHANGYangHUChang-yao

(CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710119,China)

The Ultraction-cellulase synergistic extraction process ofpleurotusostreatuspolysaccharide(POP) was optimized by uniform design method. Extraction temperature, pH, solvent/material ratio, cellulase dosage, enzymolysis time, ultrasonic power and ultrasonic time were selected to carry out the single factor tests. According to the experimental results, better levels of these factors were chosen to implement the U18(95×62) mixed uniform design experiment to optimize the technology. The effects of the seven single factors as well as their interactions on the POP yield were investigated. The optimal process parameters were predicted and verified by using regression analysis. The optimal extraction conditions of POP were concluded as follows, i. e. extracting at 25 ℃, solvent/material ratio 22, pH 7.5, using 0.5% cellulase, enzymolyzed for 6 min, and ultrasonically treated for 69 min with 120 W. Under these conditions, the yield of the POP was up to (36.71±0.46) %. This optimized extraction process was feasible and effective.

pleurotus ostreatus; polysaccharide; ultrasonic assisted extraction; cellulase

國家自然科學基金項目(編號：31301598)；陜西省自然科學基金項目(編號：2012JQ3014)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(編號：GK201402042)；國家留學基金項目(編號：201406875010)

張曉，女，陜西師范大學在讀碩士研究生。

朱彩平(1979-)，女，陜西師范大學副教授，博士。

E-mail：zcaiping@snnu.edu.cn

2016-03-28