劉立品，吳桂玲，李文浩，張偉，邢靜亞，張國(guó)權(quán)

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

堿性蛋白酶酶解青稞蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)研究

劉立品，吳桂玲，李文浩，張偉，邢靜亞，張國(guó)權(quán)*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

為深入了解與調(diào)控堿性蛋白酶水解青稞蛋白過(guò)程，準(zhǔn)確控制其水解程度，獲得定向肽組成的酶解產(chǎn)物。采用堿性蛋白酶在溫度55℃、pH10.0條件下酶解青稞蛋白，分析酶濃度、底物濃度對(duì)青稞蛋白水解度的影響，并建立可控酶解動(dòng)力學(xué)方程。結(jié)果表明：青稞蛋白水解度隨著初始底物濃度S0的上升而下降，隨著初始蛋白酶濃度E0的增加而上升，水解速率隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。模型的驗(yàn)證結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值基本吻合，通過(guò)對(duì)E0/S0、反應(yīng)時(shí)間的調(diào)節(jié)可有效控制水解程度，為利用酶解制備青稞活性肽的產(chǎn)業(yè)化實(shí)踐提供指導(dǎo)。

青稞蛋白；堿性蛋白酶；動(dòng)力學(xué)；水解度

青稞（Hordeum Vulgare L.var.nudum Hook.f）是青藏高原的獨(dú)有物種和最具高原特色的農(nóng)作物。其蛋白質(zhì)含量為6.35％～23.40％，平均值為12.43％，低于燕麥和小麥，但高于其他谷類作物［1］。同時(shí)青稞中含有18種氨基酸，人體必需的氨基酸齊全［2-3］，對(duì)于補(bǔ)充機(jī)體每日必需氨基酸的需要有重要意義。因此青稞作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源開始受到越來(lái)越多的關(guān)注。

酶解是提高食物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善各種功能特性和擴(kuò)大蛋白質(zhì)應(yīng)用領(lǐng)域的一種有效手段。酶解后的蛋白質(zhì)具有良好的溶解性、乳化性、貯藏穩(wěn)定性及風(fēng)味特性等，同時(shí)還可獲取具有生物活性的肽，能廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品、飼料產(chǎn)品等行業(yè)［4］。然而過(guò)度酶解會(huì)造成蛋白質(zhì)某些功能特性減弱甚至完全喪失［5］。所以控制蛋白酶解程度對(duì)于獲得理想的目標(biāo)產(chǎn)物至關(guān)重要。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于蛋白質(zhì)酶解的動(dòng)力學(xué)的研究，主要集中在以小麥蛋白［6］、大米蛋白［7-8］為主的植物蛋白以及以乳蛋白［9］和魚蛋白［10-11］為主的動(dòng)物蛋白。但少見(jiàn)青稞蛋白質(zhì)的酶解動(dòng)力學(xué)的報(bào)道。因此，本文以青稞中提取的青稞蛋白為原料，研究了堿性蛋白酶水解青稞蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)機(jī)制，并建立其水解過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型，以期為青稞蛋白質(zhì)的深度開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

北青6號(hào)（青海地區(qū)主要青稞品種）青稞籽粒由西藏農(nóng)牧科學(xué)院研究所提供；堿性蛋白酶（酶活力＞10 000 U/g，實(shí)測(cè)酶活105U/g）：英國(guó)BDH公司；福林酚：美國(guó)sigma試劑公司；鹽酸、氫氧化鈉、甲醛等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；PB-10 pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UV-1700紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；KJELTE2100半自動(dòng)凱氏定氮儀：瑞典富斯-特卡脫公司；79-1型磁力加熱攪拌器：江蘇榮華儀器制造有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1青稞蛋白的提取及酶解

以青稞全粉為原料，采用堿溶酸沉法［12］提取。

取適量青稞蛋白，按一定底物濃度加水配成懸浮液，加1mol/L氫氧化鈉溶液將體系pH值調(diào)至10.0，加入適量堿性蛋白酶，55℃恒溫水解，達(dá)到酶解時(shí)間后，沸水浴滅酶5min，待冷卻至室溫后，4 000 r/min離心10min，取上清液放入冰箱冷藏備用。

1.3.2蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

粗蛋白含量測(cè)定：參照GB/T 5511-2008《谷物和豆類氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算凱氏法》，凱氏定氮法。

1.3.3堿性蛋白酶酶活力的測(cè)定

采用Folin-酚法，參照SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測(cè)定法》和白正晨等［13］的方法。

1.3.4酶解動(dòng)力學(xué)模型的推導(dǎo)

堿性蛋白酶為一種絲氨酸型的內(nèi)切蛋白酶，水解過(guò)程中可生成多種產(chǎn)物，符合雙底物順序反應(yīng)機(jī)理［14-15］。其反應(yīng)式可表示為：

其中k1、k-1、k2分別為酶與底物的結(jié)合常數(shù)、解離常數(shù)和產(chǎn)物生成常數(shù)。

根據(jù)李湘等［16］、林偉鋒等［17］的數(shù)學(xué)推導(dǎo)，蛋白酶有限水解蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)模型可用下式表示：

蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中水解速率的動(dòng)力學(xué)模型：V=aS0exp［-b（DH）］，exp是指以e為底的指數(shù)函數(shù)（1）

蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中水解度的動(dòng)力學(xué)模型：

式中：DH為水解度，％；V0為空白試驗(yàn)加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V1為測(cè)定樣品加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2為水解液總體積，mL；V3為滴定用水解液的體積，mL；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；m為水解液中氨基氮的總量（凱氏定氮法），g。

1.3.6數(shù)據(jù)分析

采用軟件origin8.5對(duì)水解度與水解時(shí)間的方程式（2）進(jìn)行非線性擬合；模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的擬合程度通過(guò)平均相對(duì)誤差（E）進(jìn)行評(píng)估。

式中：V表示反應(yīng)速率，g/（L·min）；DH為水解度，％；E0為初始蛋白酶濃度，g/L；S0為初始底物濃度，g/L；c0為與底物濃度有關(guān)的堿性蛋白酶被鈍化的量的大小；k2為反應(yīng)速率常數(shù)，min-1；km為米氏常數(shù)，min-1，代表酶促反應(yīng)中底物與酶之間結(jié)合力的強(qiáng)弱，km值大則其結(jié)合力弱，km值小則底物與酶之間親和力強(qiáng)［18］。

從動(dòng)力學(xué)模型可知，若a≤0（即E0/S0≤c0），則V≤0，此時(shí)蛋白質(zhì)水解無(wú)法實(shí)現(xiàn)。因此蛋白酶催化水解蛋白質(zhì)，在初始底物濃度S0固定時(shí)，其初始蛋白酶濃度存在一個(gè)最低的臨界酶濃度，即初始蛋白酶濃度應(yīng)滿足E0＞c0S0；同理，當(dāng)初始蛋白酶濃度E0處于一定值時(shí)，初始底物濃度也存在一個(gè)最大的閾值，即初始底物濃度應(yīng)滿足S0＜E0/c0。

由方程（3）可知，a的大小與酶解體系初始底物濃度S0和初始蛋白酶濃度E0有關(guān)，隨著S0的上升而減小，隨著E0的上升而增大；由于k2與水解溫度有關(guān)，因此，a的大小也隨著水解溫度的變化而變化。b的大小則與S0和E0無(wú)關(guān)，但與水解溫度的高低有關(guān)。因此在恒溫水解反應(yīng)中，b的大小應(yīng)為一個(gè)常數(shù)；a的大小只與酶解體系初始底物濃度和初始蛋白酶濃度有關(guān)。

1.3.5水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法［19］。水解度按下式進(jìn)行計(jì)算：

2　結(jié)果分析

2.1酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定

為了確定動(dòng)力學(xué)模型中的各個(gè)參數(shù)，研究水解體系中初始底物濃度S0和初始蛋白酶濃度E0對(duì)水解度的影響。在pH 10.0、反應(yīng)溫度55℃條件下，以青稞蛋白為底物，堿性蛋白酶為催化劑進(jìn)行水解。初始酶濃度為1.2 g/L時(shí)，不同底物濃度（5、10、20、30、40 g/L）對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖1。初始底物濃度為10 g/L時(shí)，不同酶濃度（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L）對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖2。

圖1　初始底物濃度S0對(duì)水解度的影響Fig.1 Effectsof the initialsubstrate concentration on the degreeof hyd rolysis

圖2　初始酶濃度E0對(duì)水解度的影響Fig.2 Effectsof the initialenzyme concentration on thedegreeof hydrolysis

由圖1、圖2中可知，在一定初始底物濃度和蛋白酶濃度下，蛋白質(zhì)水解度隨酶解時(shí)間的增加而升高，在同一處理時(shí)間下，水解度隨初始底物濃度的增加而下降，隨初始蛋白酶濃度的增加而上升。這表明底物對(duì)酶的活力可能存在抑制作用［11］；而酶用量的增加可以大大增加酶與底物結(jié)合的幾率，從而增加水解度。對(duì)于同一初始底物濃度，水解速率隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，并趨向于一個(gè)極限值，極限值隨初始底物濃度的增大而呈下降趨勢(shì)。由此推測(cè)在反應(yīng)體系中，底物可能對(duì)酶有抑制作用，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一較大值后，這種抑制作用增強(qiáng)。另外，過(guò)高的底物濃度易造成水解液黏度增大，影響蛋白酶擴(kuò)散，從而對(duì)水解反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用［20］。對(duì)于同一初始酶濃度，水解速率隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，并趨向于一個(gè)極限值，極限值隨初始酶濃度的增加而提高。即體系水解速率隨反應(yīng)時(shí)間和水解度的增加而減小，這可能歸因于：1）隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，水解體系中可作用肽鍵的濃度下降；2）產(chǎn)物中的某些組分可能與酶的活性部分結(jié)合，對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致體系整體反應(yīng)速率較之反應(yīng)初始階段有明顯的下降趨勢(shì)；3）隨著底物濃度的增加，體系中有效底物與酶結(jié)合時(shí)阻礙作用增大［16］。

利用軟件origin8.5對(duì)水解度與水解時(shí)間的方程式進(jìn)行非線性擬合，求得動(dòng)力學(xué)參數(shù)a和b，結(jié)果如表1所示。

表1　青稞蛋白質(zhì)酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table1 Valuesof kinetic param eters for hyd rolysisof hulless barley protein

由表1可知，動(dòng)力學(xué)參數(shù)a隨著初始底物濃度S0的增加而減小，隨著初始蛋白酶濃度E0的增大而增大。動(dòng)力學(xué)參數(shù)b在不同的初始底物濃度和初始蛋白酶濃度條件下，其數(shù)值都相差很小，接近一個(gè)常數(shù)。因此在一個(gè)恒溫水解反應(yīng)中，b可以看作是一個(gè)常數(shù)，取其平均值0.490，這與模型推導(dǎo)所得結(jié)論一致。

2.2酶解反應(yīng)速率常數(shù)的確定

由方程（3）可知，參數(shù)a依賴于酶解反應(yīng)速率常數(shù)k2，對(duì)a值與E0/S0值作圖，確定k2，并驗(yàn)證方程的擬合情況，如圖3所示。

圖3　參數(shù)a值與初始酶濃度/初始底物濃度的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship between parameter a and thevaluesof initialenzym e concentration/initialsubstrate concentration

由圖3得到的線性關(guān)系式可知，a值隨著E0/S0值關(guān)系曲線所對(duì)應(yīng)的方程為

酶解反應(yīng)速率常數(shù)k2=8.935 8min-1；c0=2.34×10-3。由此可知，在溫度55℃、pH10.0條件下，不同初始底物濃度所對(duì)應(yīng)的臨界初始蛋白酶濃度為E0=2.34× 10-3S0，不同初始酶濃度所對(duì)應(yīng)的臨界初始底物濃度為S0=427.55E0。即當(dāng)E0≤2.34×10-3S0或S0≥427.55E0時(shí)，水解速率為負(fù)數(shù)，水解反應(yīng)不會(huì)發(fā)生。因此，堿性蛋白酶可控酶解青稞蛋白的水解反應(yīng)需滿足：E0＞2.34×10-3S0；S0＜427.55E0。

將a值和b值代入方程V=aS0exp［-b（DH）］中，可得到堿性蛋白酶酶解青稞蛋白的動(dòng)力學(xué)模型分別為：

水解速率的動(dòng)力學(xué)模型：V=（8.935 8E0-0.020 9S0）exp（-0.49DH）

水解度的動(dòng)力學(xué)模型：DH=2.041ln［1+（4.38E0/S0-0.010 2）t］

從動(dòng)力學(xué)模型可知，水解速率隨著初始蛋白酶濃度的增加而上升，但隨著水解度的上升而下降，這與圖1和圖2中的試驗(yàn)結(jié)果相符。由圖3可知，a值與E0/S0值有良好的線性關(guān)系，與由反應(yīng)機(jī)理推導(dǎo)所得的公式一致，再次證明動(dòng)力學(xué)模型的有效性。

2.3蛋白酶失活速率常數(shù)的確定

將a與b相乘得到關(guān)系式：

式中：k4為水解反應(yīng)過(guò)程中堿性蛋白酶的失活常數(shù)。參數(shù)ab值與k4呈線性關(guān)系，對(duì)ab值與E0/S0值作圖得到的線性關(guān)系式為：

青稞蛋白水解過(guò)程中堿性蛋白酶的失活常數(shù)為k4=3.564 7min-1，失活常數(shù)越小，底物及產(chǎn)物抑制作用越強(qiáng)［21］。為提高蛋白酶的酶解效率，可通過(guò)分析堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物組成，分離出抑制性強(qiáng)的產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)。

圖4　參數(shù)ab值與初始酶濃度/初始底物濃度的線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship between parameter ab and thevaluesof initialenzyme concentration/initialsubstrate concentration

2.4動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證

把可控酶解的動(dòng)力學(xué)模型的計(jì)算結(jié)果與實(shí)際水解結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，可以驗(yàn)證動(dòng)力學(xué)模型的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。圖中選擇初始底物濃度10 g/L、初始酶濃度分別為0.6、0.8 g/L條件下獲得的水解度與酶解動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算得到的水解度進(jìn)行作圖比較，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　水解動(dòng)力學(xué)模型的驗(yàn)證Fig.5 Validation on kinetic hydrolysismodel

如圖5所示，動(dòng)力學(xué)模型的計(jì)算值與實(shí)測(cè)值在酶解初始階段相當(dāng)吻合，但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，其計(jì)算值與實(shí)測(cè)值有一定的差異。這可能是由不同肽鏈長(zhǎng)度的酶解產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)速率的抑制作用大小存在差異引起的。采用平均相對(duì)誤差對(duì)實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值之間的擬合程度進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明，當(dāng)初始底物濃度為10 g/L、初始酶濃度為0.6 g/L時(shí)，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的平均相對(duì)誤差為4.31％；初始底物濃度為10 g/L、初始酶濃度為0.8 g/L時(shí)，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的平均相對(duì)誤差為3.62％。兩體系所考查數(shù)據(jù)的總平均相對(duì)誤差為3.97％，動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)吻合，這說(shuō)明所建立的動(dòng)力學(xué)模型具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3　結(jié)論

采用堿性蛋白酶在溫度55℃、pH10.0條件下對(duì)青稞蛋白進(jìn)行水解，水解度隨著初始底物濃度S0的上升而下降，隨著初始酶濃度E0的增加而上升。水解速率動(dòng)力學(xué)模型為：V=（8.935 8E0-0.0209S0）exp（-0.49DH）；水解度的動(dòng)力學(xué)模型為：DH=2.041ln［1+（4.38E0/S0-0.010 2）t］。

堿性蛋白酶水解青稞蛋白過(guò)程中，不同初始底物濃度所對(duì)應(yīng)的初始蛋白酶濃度應(yīng)滿足：E0＞2.34×10-3S0；不同初始酶濃度所對(duì)應(yīng)的初始底物濃度應(yīng)滿足：S0＜427.55E0；可控酶解過(guò)程中堿性蛋白酶的失活常數(shù)k4= 3.371 3min-1，水解動(dòng)力學(xué)模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值相比較，總平均相對(duì)誤差為3.97％，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值非常吻合，可用來(lái)指導(dǎo)和優(yōu)化酶解反應(yīng)。

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Kinetic Studies on Hulless Barley Protein Hydrolysis by Alkaline Protease

LIU Li-pin，WUGui-ling，LI Wen-hao，ZHANG Wei，XING Jing-ya，ZHANG Guo-quan*
（College of Food Scienceand Engineering，North west A＆amp;FUniversity，Yangling 712100，Shaanxi，China）

In order to understand and control the hydrolysis process of alkaline protease on hulless barley protein，and obtain the targetpeptides from enzymolysis productsby controlling the degree ofhydrolysis accurately，effects of enzyme concentration and substrate concentration on the degree of hydrolysis of hulless barley proteinwere studied，and the kineticsequation of limited hydrolysiswasalso established through the enzymatic hydrolysisofhullessbarley protein by alkaline protease at55℃and pH10.0.The results showed thathydrolysis degreeofhullessbarley proteinwas increasedwith the initialenzyme concentration（E0）increasing，while decreased alongwith the initial substrate S0concentration increasing.Hydrolysis rate was decreased with the extension ofhydrolysis time.The verification of themodelshowed thatpredicted valuesagreedwellwith theexperimentaldata.Therefore，hydrolysisdegree can beeffectively controlled through theadjustmentof E0/S0ratio and reaction time.These results could be used as the guidance to industrial production ofhullessbarley active peptidesbymeansofenzymatic technology.

hullessbarleyprotein；alkalineprotease；kinetic；degreeofhydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.005

西藏農(nóng)牧科院農(nóng)業(yè)研究所委托項(xiàng)目（CARS-05-05B）

劉立品（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

張國(guó)權(quán)（1968—），男（漢），教授，博士，研究方向：谷物品質(zhì)評(píng)價(jià)及淀粉工程技術(shù)。

2015-12-23