何碧英

（中山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東中山528400）

水陸二仙丹通過增加精液中PMNE抑制劑含量抑制精子氧化損傷的發(fā)生

何碧英

（中山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東中山528400）

目的評價(jià)水陸二仙丹對男性不育患者精子氧化損傷的影響，并探討其可能的作用途徑。方法將80例不育患者采用隨機(jī)雙盲平行安慰劑對照的方法分為治療組和對照組，每組各40例，兩組均服用抗氧化劑，在此基礎(chǔ)上，治療組服用水陸二仙丹水煎劑，對照組服用安慰劑，療程為3個(gè)月。同時(shí)收集20例健康捐精者的精液作為正常對照組。對精子基本參數(shù)（精子密度、精子活動(dòng)率及正常精子形態(tài)）的變化及精液中超氧化歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）及α1抗胰蛋白酶的水平進(jìn)行比較。結(jié)果①治療前，治療組和對照組的精子密度、精子活動(dòng)率及正常精子形態(tài)均低于正常對照組（P＜0.05）。治療后，治療組和對照組的精子基本參數(shù)（精子密度、精子活動(dòng)率及正常精子形態(tài)）均顯著改善（P＜0.0001），且治療組改善精子基本參數(shù)的程度顯著高于對照組（P＜0.0001）。②治療前，治療組和對照組NE及MDA的水平均明顯高于正常對照組，而α1抗胰蛋白酶和SOD水平均低于正常對照組（P＜0.05）。治療后，治療組和對照組NE和MDA的水平較治療前均顯著降低（P＜0.0001），而α1抗胰蛋白酶及SOD的水平則顯著升高（P＜0.0001），且治療后治療組α1抗胰蛋白酶水平在顯著高于對照組（P＜0.0001），MDA的水平顯著低于對照組（P＜0.0001）。相關(guān)性的分析結(jié)果顯示，MDA水平與NE的水平呈明顯正相關(guān)（r=0.9863，P=0.0003），MDA水平與α1抗胰蛋白酶呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.9670，P=0.0016）。結(jié)論水陸二仙丹可能通過增加精液中NE抑制劑（α1抗胰蛋白酶）含量抑制精子氧化損傷的發(fā)生。

水陸二仙丹；α1抗胰蛋白酶；精子；氧化損傷

不育癥作為影響人們社會(huì)心理及生化的醫(yī)學(xué)臨床問題一直以來備受關(guān)注［1］，引起男性不育的因素很多，其中生殖道中酶系統(tǒng)的失衡是被認(rèn)為是造成男性不育的重要原因，如活性氧（reactive oxy-gen species，ROS）產(chǎn)物和抗氧化劑清除劑之間的失衡、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neurtophil elastase，NE）和其抑制劑的失衡，兩者系統(tǒng)的穩(wěn)定與正常是維持精子發(fā)生必不可少的條件［2，3］。正常生理?xiàng)l件下，ROS在維持男性生殖生理功能如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素的產(chǎn)生、精子獲能、頂體反應(yīng)以及精子活力等方面發(fā)揮著重要作用［4-6］，而中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶則有益于精液中有害病菌的清除及受損組織的再生愈合［2］。在病理?xiàng)l件下，過量的活性氧及高度活化的NE都會(huì)引起精子結(jié)構(gòu)及功能的損傷［7］。水陸二仙丹載于宋代《洪氏集驗(yàn)方》，其由金櫻子和芡實(shí)兩味中藥組成，兩藥配伍，能補(bǔ)腎健脾，具有很好的抗氧化活性［8，9］，男科疾病之陽痿遺精可在辯證的基礎(chǔ)上酌加使用［10］。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察水陸二仙丹對不育患者精子質(zhì)量的影響，并嘗試從NE抑制劑（α1抗胰蛋白酶）及抗氧化酶的角度探討其作用的初步機(jī)制。

1 資料及方法

1.1 資料80例男性不育患者來自2012年10月至2014年12月本院泌尿男科，納入標(biāo)準(zhǔn)：①自愿簽署知情同意書；②患者年齡在23～50歲之間，以降低年齡因素對研究因素的影響；③婚后性生活正常但1年以上不育，性功能無障礙，附睪、睪丸、輸精管等無異常，無家族性遺傳??；④患者未接受過正規(guī)的相關(guān)治療，以排除治療因素對研究因素的影響。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無精子癥；②未按規(guī)定服用藥物；③過敏體質(zhì)或者是對多種藥物過敏。同時(shí)選擇同期我院進(jìn)行查體健康者20例作為正常對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①自愿簽署知情同意書捐獻(xiàn)精子；②年齡在23～35歲之間，③具有生育能力，④未服用影響精子質(zhì)量的藥物。

1.2 治療方法80例不育患者均接受服用維生素C、GSH、輔酶Q-10等抗氧化劑的基礎(chǔ)治療，在以上基礎(chǔ)上，隨機(jī)將80例患者分為2組，每組各40例，治療組給予水陸二仙丹水煎劑（本院中藥房煎劑），服用方法為早晚兩次，每次150～200ml。對照組給予安慰劑，服法相同，療程均為3個(gè)月。手淫法收集治療組和對照組治療前及治療4周后的精液樣本。正常對照組同法收集。

1.3 觀察指標(biāo)在SFA-500精液分析系統(tǒng)上進(jìn)行精子密度、精子活動(dòng)率和形態(tài)等基本參數(shù)的分析；采用紫外分光光度法檢測總超氧化歧化酶活力（T-SOD）及丙二醛（MDA）含量（總超氧化歧化酶及丙二醛測定試劑盒購于研域化學(xué)試劑有限公司，操作按試劑盒）；采用ELISA法檢測中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶及α1抗胰蛋白酶的濃度（精漿彈性蛋白酶定量檢試劑盒購于上海勝隆實(shí)業(yè)有限公司，α1抗胰蛋白酶試劑盒購于上海優(yōu)寧維有限公司，操作按試劑盒）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理，各測量指標(biāo)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組數(shù)據(jù)間的比較采用T檢驗(yàn)，采用pearson進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 精子基本參數(shù)的比較治療前，治療組和對照組精子密度、精子活動(dòng)率及正常精子形態(tài)均低于正常對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后，兩組患者精子的基本參數(shù)（精子密度、精子活動(dòng)率及正常精子形態(tài)）較治療前均明顯升高（P＜0.0001），治療前，兩組患者精子的基本參數(shù)無明顯差異（P＞0.05），但治療后治療組改善精子基本參數(shù)（精子密度、精子活動(dòng)率及正常精子形態(tài)）的作用顯著強(qiáng)于對照組，見表1。

表1 精子基本參數(shù)的比較（x±s）

2.2 各組NE、α1抗胰蛋白酶、SOD及MDA水平的比較治療前，治療組和對照組NE及MDA的水平均明顯高于正常對照組，而α1抗胰蛋白酶和SOD水平均低于正常對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后，治療組和對照組患者精液中NE及MDA水平與治療前比較均明顯降低（P＜0.0001），而α1抗胰蛋白酶和SOD水平則顯著升高（P＜0.0001）。治療后，治療組精液中NE及SOD的水平與對照組NE及SOD的水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但治療后治療組α1抗胰蛋白酶的水平顯著高于治療后對照組的水平（P＜0.0001），而MDA的水平則明顯低于治療后對照組MDA的水平（P＜0.0001），相關(guān)性的分析結(jié)果顯示，MDA水平與NE的水平呈明顯正相關(guān)（r=0.9863，P =0.0003），MDA水平與α1抗胰蛋白酶呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.9670，P=0.0016），見表2。

表2 各組NE、α1抗胰蛋白酶、SOD及MDA水平的比較（x±s）

3 討論

生殖系統(tǒng)內(nèi)酶系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)對于精子功能的發(fā)揮是必不可少的條件，酶系統(tǒng)的失衡會(huì)對生殖能力造成不利的影響。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶屬于基質(zhì)金屬蛋白酶超家族，來源于中性粒細(xì)胞中，在正常生理?xiàng)l件下，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶對宿主起保護(hù)的作用，其活性受多種蛋白酶抑制劑的調(diào)控。α1抗胰蛋白酶是中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑中的一種，其大量存在于精漿中，可與NE形成較強(qiáng)的復(fù)合物，進(jìn)而抑制NE的活性，從而保護(hù)精子免受NE的損傷［11，12］。在疾病狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶高度活化，這類降解酶的活化與男性前列腺炎癥、生殖道的感染息息相關(guān)，精液中的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶可破壞精液中的有益成分，如免疫球蛋白結(jié)合因子、內(nèi)氨酰氨基肽酶和膜聯(lián)蛋白I［13-15］。SOD作為細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶，超氧陰離子在其作用下能轉(zhuǎn)化為過氧化氫或者氧，反映機(jī)體本身清除自由基的能力［16］。在正常生理?xiàng)l件下，自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)，而一旦ROS水平過高，造成機(jī)體內(nèi)自由基過量，超過機(jī)體本身的清除能力時(shí)，則會(huì)引起脂質(zhì)過氧化，引起組織、器官或細(xì)胞的損傷，目前，MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其量的高低直接顯示了機(jī)體受氧化損傷的程度，在生殖系統(tǒng)內(nèi)，由于ROS水平過高引起的MDA水平過高也會(huì)對精子功能的發(fā)揮產(chǎn)生不利的影響，進(jìn)而有可能造成不育［17，18］。

水陸二仙丹由金櫻子和芡實(shí)由金櫻子和芡實(shí)兩味中藥組成，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥的應(yīng)用中，其可用于男科疾病之陽痿遺精，而現(xiàn)代藥理研究顯示，金櫻子和芡實(shí)均有很好的抗氧化活性，因此，本實(shí)驗(yàn)從氧化應(yīng)激角度求證水陸二仙丹對不育癥的作用。結(jié)果顯示：在80例不育患者中，精液中的SOD水平明顯低于正常對照組，而MDA的水平則明顯高于正常對照組，提示精子處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)，經(jīng)抗氧化劑及水陸二仙丹治療后，兩組SOD水平較治療前均顯著升高，MDA的水平則顯著降低，且經(jīng)水陸二仙丹治療后的改善程度優(yōu)于抗氧化劑的治療，提示水陸二仙丹具有明顯的抗氧化活性?，F(xiàn)有的報(bào)道認(rèn)為，精液中NE水平的過高會(huì)引起ROS的產(chǎn)生，造成生殖系統(tǒng)的氧化損傷［3］，基于這些報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測了兩組患者治療前后NE及α1抗胰蛋白酶的水平，結(jié)果表明：在80例不育患者中，精液中的α1抗胰蛋白酶水平明顯低于正常對照組，NE的水平則明顯高于對照組，α1抗胰蛋白酶水平相對于NE過低，α1抗胰蛋白酶盡管只是NE抑制劑的一種，但其在精液中大量存在，進(jìn)而能反映精液中NE抑制劑的水平。經(jīng)治療后，治療組和對照組α1抗胰蛋白酶的水平較治療前均顯著升高，且治療后治療組α1抗胰蛋白酶的水平則明顯高于對照組，提示增加精液中α1抗胰蛋白酶的水平是水陸二仙丹作用的一個(gè)環(huán)節(jié)。NE的活性受多種蛋白酶抑制劑的調(diào)控，并與蛋白酶抑制劑處于動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)，而α1抗胰蛋白酶是中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑中的一種，本研究結(jié)果表示治療后NE的水平則顯著降低，但治療后治療組和對照組NE的水平無明顯差別，其中原因可能是NE的活性還受其他強(qiáng)蛋白酶抑制劑的調(diào)控。相關(guān)性的分析結(jié)果顯示，MDA水平與NE的水平呈明顯正相關(guān)，MDA水平與α1抗胰蛋白酶呈顯著負(fù)相關(guān)。同時(shí)，精子的基本參數(shù)（精子密度、精子活動(dòng)率及正常精子形態(tài)）均得到了顯著的改善。以上結(jié)果表明，水陸二仙丹可能通過增加精液中NE抑制劑含量抑制精子氧化損傷的發(fā)生，改善不育患者精子的質(zhì)量，為水陸二仙丹應(yīng)用于不育癥的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

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Shuilu Erxian pill inhibits sperm oxidative damage via increasing the level of neutrophil elastase inhibitor in semen HE

Biiying.
Department of Laboratory Medicine，Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhongshan Guangdong 528400，China.

Objective To evaluate how Shuilu Erxian pill affects sperm oxidative damage in infertile man.Methods 80 patients were randomly divided into two equal groups and all were given antioxidant therapy.On basis of this，patients in treated group were given Shuilu Erxian pill，while patients in control group were given placebo for three months.At the same time，the sperm from 20 healthy donor were considered as normal control group.Sperm characteristics（sperm density sperm motility and normal sperm morphology）and levels of superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），neurtophil elastase as well as α1 antitrypsin were compared.Results①Before treatment，the sperm density，sperm motility and normal sperm morphology in the treatment group and the control group were lower than those in the normal control group（P＜0.05）.After treatment，these sperm characteristics in the treatment group and the control group were markedly improved better（P＜0.0001），which was more obvious in treated group（P＜0.0001）.②Before treatment，levels of NE and MDA in the treatment group and the control group were significantly higher than the normal control group，and levels of α1 antitrypsin and SOD were lower than the normal control group（P＜0.05）.After treatment，the levels of NE and MDA in two groups were significantly decreased（P＜0.0001）while the levels of α1 antitrypsin and SOD were increased（P＜0.0001）.Moreover the level of α1 antitrypsin in treated group was significantly higher than that in control group（P＜0.0001）.And MDA level in treated group was obviously lower than that in control group（P＜0.0001）.Further correlation analysis showed that MDA displayed positive correlation with NE（r=0.9863，P=0.0003）and negative correlation with α1 antitrypsin（r=0.9670，P=0.0016）.Conclusion Shuilu Erxian pill may inhibited sperm oxidative damage via increasing the level of neutrophil elastase inhibitor in semen.

Shuilu Erxian pill；α1 antitrypsin；sperm；oxidative damage

R446.19，R698+.2，R711.6

A

1674-1129（2016）05-0583-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.015

2015-09-25；

2016-07-06）

何碧英，男，1982年4月生，主管技師，本科，主要從事臨床方向研究。hebiying10h@163.com