梁金明，陳 聰，歐志蓮，陳康榮，梁惠明，唐家玉

（湛江中心人民醫(yī)院，廣東湛江524037）

乙型肝炎病毒標志物檢測方法的選擇與應(yīng)用

梁金明，陳 聰，歐志蓮，陳康榮，梁惠明，唐家玉

（湛江中心人民醫(yī)院，廣東湛江524037）

目的探討乙型肝炎病毒定性與定量方法在臨床診治中的應(yīng)用價值和合理選擇。方法收集920例健康體檢者血清，分別用膠體金方法、酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法和時間分辨免疫熒光方法檢測乙型肝炎病毒表面抗原，對陽性標本再用中和確認試驗進行驗證和PCR方法檢測HBV-DNA。結(jié)果920例標本中膠體金法檢出陽性96例，酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢出陽性104例，時間分辨免疫熒光法檢出陽性112例，時間分辨免疫熒光方法與膠體金方法、酶聯(lián)免疫吸附測定方法比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001、P=0.008）；中和確認試驗確認112例標本均陽性；實時熒光定量PCR檢測112例標本HBV-DNA陽性78例。結(jié)論乙型肝炎病毒標志物的日常檢測方法應(yīng)由準確性高的定量方法替代目前常用的定性方法。

乙型肝炎病毒；檢測方法；膠體金方法；酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法；時間分辨免疫熒光方法；聚合酶鏈反應(yīng)

乙型肝炎病毒（HBV）是最常見的一種感染性病毒，因其傳染性及病毒本身的耐受性強，危害比較大，在我國和世界都是一個不可忽視的公共衛(wèi)生問題，特別在發(fā)展中國家，全世界約有4億感染者［1］，在我國也曾有過很多爭議。所以不管是住院病人、門診病人還是體檢，都會檢測乙型肝炎二對半，而對于這個病毒的檢測方法則不勝枚舉，最常見的有酶聯(lián)吸附試驗（ELISA）、時間分辨法免疫熒光方法（TR-FIA）、化學(xué)發(fā)光法（CLIA）、膠體金法（colloidal gold）、分析金標免疫層析法（GICA）等，還有與其相關(guān)的HBV-DNA、前S1抗原、基因分型等。

乙型肝炎病毒檢測方法有定性與定量二類，定性方法中最常用的是ELISA方法，而快速檢測方法或即時檢驗（POCT）也是定性方法，常用的是膠體金方法或分析金標免疫層析檢測技術(shù)；定量方法最常用的是時間分辨免疫熒光方法和化學(xué)發(fā)光方法等。

本研究隨機從體檢人群中選標本920例，分別用快速的膠體金方法、目前最常用的ELISA定性方法和定量的時間分析免疫熒光方法，檢測乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），對陽性標本進行中和確認試驗進行確認及用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測HBV-DNA，對結(jié)果進行分析和比較。

1 材料與方法

1.1 標本收集與處理每周隨機選擇一天在健康體檢者92例，共選10d（共920例），收集當天體檢標本血清，分別用膠體金方法、酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法和時間分析免疫熒光方法檢測乙型肝炎病毒表面抗原，對陽性標本再用中和確認試驗進行驗證和檢測HBV-DNA。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 儀器新波生物EasyCuta 1260，愛康URANUS AE150，達安DA7600PCR分析儀。

1.2.2 試劑艾博生物醫(yī)藥（杭州）有限公司生產(chǎn)的HBsAg膠體金試劑、上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)的HBsAg ELISA定性試劑、蘇州新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的HBsAg時間分辨免疫熒光定量試劑、珠海麗珠試劑股份有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒表面抗原確認試劑、中山大學(xué)達安基因工程股份有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒DNA試劑。

1．3方法收集血清按試劑盒說明及儀器要求操作，分別檢測HBsAg和HBV－DNA。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS 17.0軟件對時間分辨免疫熒光方法分別與膠體金方法和ELISA方法進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種方法檢測結(jié)果時間分辨免疫熒光方法檢測920例標本陽性112例，陰性808例；ELISA方法檢測出陽性104例，陰性816例；膠體金方法檢出陽性96例，陰性824例，結(jié)果見表1；時間分辨免疫熒光方法分別與ELISA方法和膠體金方法比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008、0.00）。

表1 920例體檢者HBsAg膠體金方法、ELISA方法與時間分辨免疫熒光方法檢測結(jié)果

2.2 確認試驗經(jīng)中和確認試驗確認，112例標本均確認陽性。見表2。

2.3 實時熒光PCR檢測112例陽性標本，HBVDNA陽性78例（69.6%）。見表2。

表2 112例陽性標本中和確認結(jié)果與HBV－DNA結(jié)果

3 討論

1971年Engvall和Perlman首次報道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA），這種方法具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，是一種經(jīng)典的免疫檢測方法，是目前最常用的一種方法，各文獻報道［2］和幾十年的使用經(jīng)驗，其敏感性、特異性已落后于現(xiàn)在對檢驗質(zhì)量的要求。隨著檢驗技術(shù)的不斷發(fā)展和日新月異，而對于乙型肝炎病毒的檢測方法已從ELISA這種定性方法發(fā)展到更準確更方便快捷的定量方法，且技術(shù)成熟。而ELISA方法耗時較長，因其方法的性質(zhì)和我國實際情況，ELISA方法檢測步驟從快速的一步法再因為避免鉤狀效應(yīng)（hook effect）改為現(xiàn)在的二步法，一般要2.5h才能得出結(jié)果。另外，從表1結(jié)果可知其漏診率為7.1%，而對于目前醫(yī)患關(guān)系不佳的情況下，檢驗的發(fā)展是更準確更高效。再有，目前新的說法是所有ELISA方法檢測結(jié)果應(yīng)報有反應(yīng)性或無反應(yīng)性，而不能報陽性或陰性。文獻報道免疫靜默感染的乙肝也會導(dǎo)致的常規(guī)ELISA的漏檢［3］。所以，ELISA方法作為常規(guī)的乙型肝炎病毒的常規(guī)檢測方法已不合時宜，而應(yīng)該選擇準確性更高的定量方法。

膠體金方法是快速方法的代表，其成本也比ELISA方法高，膠體金方法其特點是結(jié)果快，一般幾分鐘就可得出結(jié)果，從表1數(shù)據(jù)可知其準確性和漏診率都不及ELISA方法，與其他報道結(jié)論一致［4］。因此，膠體金方法不推薦常規(guī)體檢和篩查，只適合在POCT或急診手術(shù)前急需結(jié)果時使用，但建議最好有其他方法補充檢測以免漏檢。

乙型肝炎病毒定量檢測的方法除了時間分辨免疫熒光方法外，還有化學(xué)發(fā)光方法等。而時間分辨免疫熒光方法是定量方法中最便宜的，所以本研究采用此方法。從表2的確認結(jié)果可以看出時間分辨免疫熒光方法的結(jié)果是可靠的。定量方法除了對乙型肝炎病毒肝炎的治療和療效評估提供可靠的數(shù)據(jù)外，還能對乙型肝炎病毒疫苗接種效果評估。不管是日常體檢篩查還是乙型肝炎患者的隨訪復(fù)查，定量方法能為臨床診斷、療效評估和免疫接種效果提供準確的數(shù)據(jù)，而定性的方法在這一方面是達不到這要求的。毫無疑問，定量方法對于診斷和治療都有顯著的臨床意義和比ELISA、膠體金等方法的靈敏度和特異性都高，與文獻報道結(jié)論相同［5］。需要說明的是，當其結(jié)果陽性數(shù)值在低限時，是否就真的是真陽性，這需要臨床醫(yī)生和檢驗者的注意或進一步確認，這檢測方法雖然是定量，但診斷只能是有或否，在臨界值附近不管是定性還是定量都會出現(xiàn)不同的兩種結(jié)果［6］。且樊璐報道的隱匿性乙肝病毒也不容忽視［7］，所以，日常工作中，對于低含量的陽性標本，最好能建議作確認或跟蹤復(fù)查為好。

HBV-DNA是反映體內(nèi)乙型肝炎病毒的復(fù)制水平，當體內(nèi)只是攜帶乙型肝炎病毒，而病毒本身不活躍或不復(fù)制時，其水平是檢不出的，從表2數(shù)據(jù)中可以看出，只36%經(jīng)確認的標本其HBV-DNA水平是高出檢測下限。因此HBV-DNA也只適用于抗病毒治療或療效評估的指標。而對于HBVDNA在感染窗口期可檢測這一說法，還要進一步分析，因為在窗口期其病毒含量是否達到檢測限很難說，在窗口期內(nèi)是否被機體免疫清除也是未知的。而這樣的闡述不是說HBV-DNA檢測在窗口其沒必要，而是要辨證及發(fā)展的看待窗口期HBV-DNA結(jié)果。HBV-DNA低于檢測下限的標本也不能說明未感染HBV或不攜帶乙型肝炎病毒，因為如果HBV病毒沒有復(fù)制時，是檢測不出的，也要考慮到PCR方法也有其局限性［8］，田耘博等報道的不同核酸（NAT）檢測方法結(jié)果也不一致［9］，所以，對于在窗口期診斷，低于檢測下限不能排除沒感染，必須要隨訪復(fù)查。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，新型的PCR檢測［10］］也開始應(yīng)用。

乙型肝炎病毒有多種亞型［11，12］，任何一種試劑都不可能檢測全部的亞型。同時也要考慮試劑間的差異，因每一個廠家或品牌試劑所選擇的抗體包被物或亞型都有可能不同，不管是什么方法、項目，主要試劑廠家不同，其結(jié)果都有可能不一致。而隨著科技的不斷發(fā)展和完善，對于乙型肝炎的治療和檢測項目也會發(fā)展更多項目或方法，如現(xiàn)在的超敏HBV-DNA［13］，將更好為乙型肝炎的治療提供更方便更優(yōu)質(zhì)的檢驗項目或方法。對一些少見類型的乙型肝炎病毒、二對半結(jié)果組合少見尤其是病毒含量低，或感染早期（窗口期）、免疫清除過程等原因的特殊例子已有文獻的相關(guān)報道［14，15］。

乙型肝炎病毒相關(guān)檢測還有前S1抗原，與乙型肝炎病毒的傳染性和病毒復(fù)制有關(guān)［16］，這一指標是感染乙型肝炎病毒最早出現(xiàn)，但消失也快，因此在清除病毒過程中檢測前S1抗原更優(yōu)于HBsAg。而對于基因分型主要應(yīng)用于乙型肝炎的耐藥治療，而傳統(tǒng)的突變位點向日漸成熟的表型耐藥檢測并發(fā)揮更加廣泛的作用［17］。

綜上所述，隨著科學(xué)技術(shù)的日新月異，乙型肝炎病毒標志物的檢驗方法應(yīng)與時俱進。為了更好的在乙型肝炎的診斷、治療等方面特別是早發(fā)現(xiàn)早治療方面考慮，減少漏診率和避免醫(yī)療糾紛，應(yīng)盡早由準確性更高的定量方法替代目前常用ELISA方法。

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The selection and application of detection method of hepatitis B virus markers

LIAN Jinming，CHEN Cong，OU Zhilian，CHEN Kangrong，LIANG huiming，TANG Jiayu.

Central People's Hospital of Zhanjiang，Guangdong Zhanjiang 524037，China.

Objective To investigate the application value and reasonable choice of the qualitative and quantitative methods in clinical diagnosis and treatment of HBV.Methods The research was collected 920 cases of health check-up，detected the HBsAg with colloidal gold，ELISA and TR-FIA method，then the positive samples retested by neutralization confirmatory and tested HBVDNA by PCR.Results The colloidal gold method detected positive 96 cases，the ELISA method were positive 104 cases and the TR-FIA method were positive 112 in the 920 cases.Differences had statistical significance by TR-FIV with colloidal and ELISA methods（P＜0.001，P=0.008）.Conclusions The routine detection method of hepatitis B virus markers should be replaced by the high accuracy of quantitative methods.

HBV Detection method Colloidal gold ELISA TR-FIA PCR

R446.62，R512.6+2

A

1674-1129（2016）05-0568-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.010

2016-05-13；

2016-07-09）

湛江市科技攻關(guān)項目（編號：2014B01109）

梁金明，男，1974年2月生，主任技師，醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)，主要從事免疫學(xué)檢驗及分子診斷。郵箱：13828252013@139.com