范小菊，劉志強(qiáng)，柯江維，謝淑佩，梁昌達(dá)，段榮

（江西省兒童醫(yī)院，1、血液科；2、檢驗(yàn)科，江西南昌330006）

CD133在小兒急性白血病中的表達(dá)及臨床意義

范小菊1，劉志強(qiáng)2，柯江維2，謝淑佩1，梁昌達(dá)1，段榮2

（江西省兒童醫(yī)院，1、血液科；2、檢驗(yàn)科，江西南昌330006）

目的探討CD133在急性白血?。ˋL）患兒中的表達(dá)及其意義。方法采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定100例AL患兒白血病細(xì)胞膜上CD133的表達(dá)。結(jié)果⑴AL組患兒CD133的表達(dá)率為38.0%，表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。⑵急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）和急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的CD133的表達(dá)率分別為40.0%和37.5%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，T-ALL和B-ALL的CD133陽性表達(dá)率分別為33.3%和38.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AML各亞型間CD133陽性表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑶CD133表達(dá)陽性組的完全緩解（CR）率低于CD133表達(dá)陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑷對(duì)18例初治時(shí)CD133高表達(dá)經(jīng)化療后CR的AL患兒進(jìn)行隨訪，2例CD133陽性AML經(jīng)后續(xù)化療后有1例轉(zhuǎn)陰，1例持續(xù)表達(dá)，但2例分別在化療15個(gè)月、12個(gè)月復(fù)發(fā)，且轉(zhuǎn)陰患兒骨髓復(fù)發(fā)時(shí)CD133再次表達(dá)；16例CD133陽性ALL經(jīng)后續(xù)化療后均轉(zhuǎn)陰，此后有5例分別在21個(gè)月、19個(gè)月、18個(gè)月、16個(gè)月、13個(gè)月骨髓復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)時(shí)CD133再次表達(dá)。結(jié)論AL患兒骨髓細(xì)胞CD133表達(dá)高于正常對(duì)照；檢測(cè)CD133表達(dá)可能有助于AL各亞型的鑒別及療效判斷；CD133高表達(dá)可能是AL的一個(gè)不良預(yù)后因素，以CD133為監(jiān)測(cè)微小殘留病灶（MRD）的標(biāo)記物對(duì)防治復(fù)發(fā)有一定的意義。

CD133；急性白血病；預(yù)后

CD133是人類造血干或祖細(xì)胞膜（HSPC）上新發(fā)現(xiàn)的一種抗原。1997年，Yin AH等［1］首次報(bào)道了此抗原并成功制備識(shí)別該抗原的單克隆IgG抗體，2000年6月第七屆人類白細(xì)胞分化抗原工作組大會(huì)正式將此抗原命名為CD133［2］。CD133抗原是一分子量為120KD的5跨膜糖蛋白，因而它不同于已知的兩個(gè)細(xì)胞表面多跨膜（TM）受體主要家族4-TM和7-TM。CD133不僅分子量不同于其它多個(gè)TM蛋白，而且胞外環(huán)比4-TM、7-TM大1倍，兩者序列尤其TM域不具同源性，表明CD133是一新TM受體超家族成員［3］。

CD133不但在正常HSPC膜上表達(dá)，也在白血病細(xì)胞膜上表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道CD133表達(dá)與部分造血系統(tǒng)腫瘤尤其是成人AL密切相關(guān)，且與白血病FAB分型有關(guān)，但其意義尚不清楚［1-3］。我們通過對(duì)100例AL患兒骨髓白血病細(xì)胞CD133抗原表達(dá)水平的檢測(cè)，以探討它與兒童AL臨床特征的相關(guān)性及其在預(yù)后判斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象100例AL患者均為2012年～2014年在江西省兒童醫(yī)院血液科住院患兒，男65例，女35例，年齡6個(gè)月～14歲，中位年齡3.2歲。其中AML初治組20例（M1 1例、M2 7例、M3 3例、M4 5例、M5 4例）；ALL初治組80例（T-All 9例、B-ALL 71例）。緩解時(shí)間均在半年以內(nèi)，診斷、療效判定的判斷標(biāo)準(zhǔn)符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［4］；對(duì)照組15例為同期住院，診斷免疫性血小板減少癥患兒，其中男9例，女6例，年齡1～14歲，中位年齡2.7歲。骨髓抽取前均征得患兒家屬同意。

100例初治AL患者采用常用一線化療方案，其中M3采用維甲酸20～30mg/m2，分2次/d誘導(dǎo)分化治療。所有患兒均能堅(jiān)持2個(gè)以上療程常規(guī)化學(xué)治療，達(dá)完全緩解或部分緩解者為有效，不緩解者為無效［4］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)中所使用的CD133、CD45、CD34及系列相關(guān)單克隆抗體及同型Ig對(duì)照均購自美國BD公司。

1.3 標(biāo)本制備抽取急性白血病患者化療前及化療中骨髓液3ml，肝素抗凝，同樣抽取對(duì)照組患兒骨髓液3m1，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMMNC），用磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)整濃度為5×106/ml。

1.4 免疫熒光法測(cè)定CD133抗原的表達(dá)應(yīng)用免疫熒光法標(biāo)記骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMMNC），用流式細(xì)胞儀測(cè)定骨髓單個(gè)核細(xì)胞膜上CD133的表達(dá)率。根據(jù)國際急性白血病的免疫分型標(biāo)準(zhǔn)，將AL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞膜CD133陽性率≥20%定義為陽性表達(dá)，而骨髓單核細(xì)胞膜CDl33陽性率＜20%定義為CD133陰性表達(dá)［3］。

1.5 形態(tài)學(xué)檢查及細(xì)胞化學(xué)染色骨髓涂片采用常規(guī)瑞氏染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞，原始及幼稚細(xì)胞≥20%定為白血病，并加做過氧化物酶、糖原及非特異性酯酶染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法率的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CDl33表達(dá)水平100例AL患兒有38例表達(dá)CDl33，陽性表達(dá)率為38.0%，15例對(duì)照組無一表達(dá)CDl33，陽性表達(dá)率為0，經(jīng)Fisher精確概率法檢驗(yàn)，AL患兒CDl33陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 病例組與對(duì)照組CD133表達(dá)水平

2.2 CDl33表達(dá)與AL臨床特征的相關(guān)性分析見表2。

表2 AL患兒CD133的表達(dá)與FAB分型的關(guān)系

2.2.1 CDl33與AL FAB分型的相關(guān)性100例AL患者CDl33的表達(dá)率為38.0%，AML和ALL兩組CD133的表達(dá)率分別為40.0%和37.5%，經(jīng)Fisher精確概率法檢驗(yàn)，P值為1.000，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.2 CDl33與AML各亞型間的相關(guān)性在不同亞型的AML中CDl33陽性檢出率分別為0、42.9%、0、60.0%、50.0%，經(jīng)Fisher精確概率法檢驗(yàn)，P值為0.121，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.3 CDl33與ALL亞型間的相關(guān)性B-ALL和T-ALL及其亞型間CDl33的陽性率分別為38.0%和33.3%，經(jīng)Fisher精確概率法檢驗(yàn)，P值為1.000，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 CDl33與臨床療效的關(guān)系

2.3.1 AML患兒CD133的表達(dá)與臨床療效的關(guān)系20例AML患兒經(jīng)誘導(dǎo)化療后，8例CD133陽性患兒有2例獲得CR，CR率25.0%；12例CD133陰性患兒有10例獲得CR，CR率83.3%。經(jīng)Fisher精確概率法檢驗(yàn)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.3.2 ALL患兒CD133的表達(dá)與臨床療效的關(guān)系80例ALL患兒經(jīng)誘導(dǎo)化療后，30例CD133陽性患兒有16例獲得CR，CR率53.3%；50例CD133陰性患兒有47例獲得CR，CR率94.0%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表4。

表3 AML患兒CD133的表達(dá)與臨床療效的關(guān)系

表4 ALL患兒CD133的表達(dá)與臨床療效的關(guān)系

2.4 隨訪對(duì)18例初治時(shí)CD133陽性表達(dá)經(jīng)化療后CR的AL患兒進(jìn)行隨訪，2例CD133陽性AML經(jīng)后續(xù)化療后有1例轉(zhuǎn)陰，1例持續(xù)表達(dá)，但2例分別在化療15個(gè)月、12個(gè)月復(fù)發(fā)，且轉(zhuǎn)陰患兒骨髓復(fù)發(fā)時(shí)CD133再次表達(dá)；16例CD133陽性ALL經(jīng)后續(xù)化療后均轉(zhuǎn)陰，此后有5例分別在21個(gè)月、19個(gè)月、18個(gè)月、16個(gè)月、13個(gè)月骨髓復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)時(shí)CD133再次表達(dá)。

3 討論

目前常用的MRD檢測(cè)方法有RQ-PCR［5，6］和流式細(xì)胞術(shù)，在臨床上流式細(xì)胞術(shù)更為實(shí)用。兒童AML由于缺乏統(tǒng)一的監(jiān)測(cè)標(biāo)志物，MRD的監(jiān)測(cè)存在很大困難，這是兒童AML復(fù)發(fā)率高的原因之一。因此有必要尋找一些廣譜的白血病標(biāo)志物用于兒童白血病MRD的檢測(cè)。

CD133是重要的HSPC的表面標(biāo)志，近年來，發(fā)現(xiàn)其在惡性血液病中高度表達(dá)而受到重視，且研究者不斷發(fā)現(xiàn)血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與CD133關(guān)系密切，但目前在AL中CD133的表達(dá)水平、作用機(jī)制以及對(duì)疾病的進(jìn)展、治療反應(yīng)的影響等生物學(xué)意義，研究尚無定論。本研究示AML和ALL陽性率分別為40.0%和37.5%，兩組陽性率比較無差異（P＞0.05），但明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），說明在AL患兒骨髓細(xì)胞中CD133明顯增高，但表達(dá)無明顯細(xì)胞系別的差異，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7，8］。

本研究還發(fā)現(xiàn)在不同亞型的AML中，以M2、M4、M5亞型的CD133陽性檢出率較高，而在M1、M3亞型中則未檢出，但經(jīng)比較無顯著性差異，與部分文獻(xiàn)報(bào)道的CD133水平與AML亞型存在一定的相關(guān)性［3，9-11，16］不一致，但與部分文獻(xiàn)［8，12］報(bào)道的CD133表達(dá)與FAB亞型無明顯的特定關(guān)系一致，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，究其原因，可能與本研究標(biāo)本量少有關(guān)，以后還會(huì)加大樣本量來研究。

在初治AL患兒CD133表達(dá)水平與療效中，CDl33陽性表達(dá)組的完全緩解率低于陰性表達(dá)組（P＜0.05），提示初發(fā)時(shí)CDl33陽性表達(dá)者對(duì)常規(guī)化療反應(yīng)差、CR率低，可考慮開始就給予較強(qiáng)方案或骨髓移植治療；而初發(fā)時(shí)CDl33陰性表達(dá)者化療反應(yīng)好、易緩解，給予常規(guī)方案就可，以減輕化療帶來的不良并發(fā)癥。因此推測(cè)CD133的表達(dá)對(duì)AL的治療、療效及預(yù)后判斷有一定的指導(dǎo)作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［13-15，17］。

本研究還對(duì)18例初治時(shí)CDl33陽性表達(dá)經(jīng)化療后CR的AL患兒進(jìn)行了隨訪，2例CD133陽性AML經(jīng)后續(xù)化療后有1例轉(zhuǎn)陰，1例持續(xù)高水平表達(dá)，但2例分別在15個(gè)月、12個(gè)月骨髓復(fù)發(fā)，且轉(zhuǎn)陰患兒骨髓復(fù)發(fā)時(shí)CD133再次表達(dá)；16例CD133陽性ALL經(jīng)后續(xù)化療后均轉(zhuǎn)陰，此后有5例分別在21個(gè)月、19個(gè)月、18個(gè)月、16個(gè)月、13個(gè)月骨髓復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)時(shí)CD133再次表達(dá)。提示CD133能反映白血病細(xì)胞的負(fù)荷及疾病的進(jìn)展，但由于我們的病例數(shù)少，觀察時(shí)間較短，因此若要獲得更詳實(shí)確切的結(jié)論，還須擴(kuò)大樣本數(shù)量、加強(qiáng)隨訪監(jiān)測(cè)和進(jìn)一步觀察分析。

作為一種新的膜糖蛋白，CD133的發(fā)現(xiàn)為研究造血干細(xì)胞的生理特征及選擇更為原始的造血干細(xì)胞提供了一個(gè)新的熱點(diǎn)。盡管目前CD133在急性白血病治療中的價(jià)值尚無定論，相信隨著研究的不斷深入，它在白血病的預(yù)后、基因治療、免疫治療及HSPC移植方面會(huì)顯示出更重要的價(jià)值。

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The expression of CDl33 in children with acute leukemia and its clinical significance

FAN Xiaoju1，LIU Zhiqiang2，KE Jiang-wei2，et al.
1.Department of Heamatology；2.Clinical Laboratory，Jiangxi Children's Hospital，Nanchang 330006，China.

Objective To evaluate the expression of CDl33 and its clinical significance in acute Leukemia（AL）patients. Methods The expression of CDl33 in Leukemic blasts from 100AL patients were detected by flow-cytometry.Results⑴The positive rates of CDl33 in AL group were 38.0%，which was significantly higher than that in control group.⑵The positive rates of CDl33 in AML and ALL patients were 40.0%and 37.5%，respectively，and there was no significant difference；The positive rates of CDl33 in T-ALL and B-ALL patients were no significant difference（33.3%，38.0%，respectively）.The expression of CD133 in AML subtypes was no significant difference.⑶The expression of CD133 positive group of complete remission（CR）rate is lower than the expression of CD133 negative groups，the difference was statistically significant.⑷18 AL cases who were high expression of CD133 and were CR after chemotherapy were followed up，2 AML cases relapse and express high level of CD133 after chemotherapy，including CD133 negative and CD133 persistent expression case，the relapse time were 15 and 12 months after chemotherapy，respectively.16 ALL cases were negative of CD133 after chemotherapy，5 relapse cases express high level of CD133 again，the relapses time were 21，19，18，16 and 13 months after chemotherapy，respectively.Conclusions AL had significantly higher CDl33 expression compared to normal control.The detection of CDl33 expression might help to identify AL type and predict therapeutic outcomes；The high expression of CDl33 may be an adverse prognostic factor in AL，CD133 may be a useful marker for MRD in AL.

CD133；Acute leukemia；Prognosis

R733.71

A

1674-1129（2016）05-0550-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.004

2016-05-09；

2016-08-24）

江西省衛(wèi)計(jì)委立項(xiàng)課題（20123144）

范小菊，女，1979年2月生，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事兒童急性白血病的治療與研究