衛(wèi)月嬌，孟恬宇，孫超峰，蔣永榮，馬舒婷

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安　710061)

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大鼠心房肌增齡性變化對心房顫動發(fā)生率及持續(xù)時間的影響

衛(wèi)月嬌，孟恬宇，孫超峰，蔣永榮，馬舒婷

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安710061)

目的：研究大鼠心房肌縫隙連接蛋白Cx40增齡性改變及增齡導致心房顫動發(fā)生率增高及房顫持續(xù)時間延長的原因。方法：隨機取9～12月齡(青年組)、16～19月齡(中年組)、24～26月齡(老年組)健康雄性SD大鼠，每組24只。每組隨機取12只通過尾靜脈注射乙酰膽堿Ach-氯化鈣混合液0.1 mL/100 g誘發(fā)房顫，監(jiān)測其肢體導聯(lián)心電圖，記錄各組大鼠房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時間。每組余下的12只大鼠麻醉后取心房組織，各組心房肌組織分別用蘇木素一伊紅及馬森染色觀察心房肌細胞及基質(zhì)的改變，運用免疫熒光染色結(jié)合激光掃描共聚焦成像技術及免疫印跡技術檢測Cx40的分布及量的改變。結(jié)果：老年組12只大鼠房顫發(fā)生率(83.3%，10只)及房顫持續(xù)時間均高于其他兩組(P<0.05)，其心房肌細胞肥大，細胞排列稀疏，心肌纖維化明顯。Cx40的表達量隨增齡顯著減少，老年組與青年組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且縫隙連接蛋白的分布由端端排列為主漸趨雜亂。結(jié)論：老年組大鼠心房顫動誘發(fā)率較高及房顫持續(xù)時間長可能與心房組織形態(tài)結(jié)構增齡性重構、心房內(nèi)縫隙連接蛋白Cx 40的數(shù)量減少及分布改變相關。

心房；縫隙連接蛋白40；心房顫動

隨著老齡化社會的到來，心房顫動(房顫)已成為當今社會最常見的心律失常之一，其發(fā)病率高，發(fā)病原因復雜，給臨床治療帶來了很大的難題[1]。老年人中，房顫更為常見，80歲以上的房顫患者約占總患病人數(shù)的三分之一[2]，并且其發(fā)病率呈現(xiàn)隨年齡增長而日趨升高的趨勢。60歲以下人群中，房顫的發(fā)病率僅為1%，而在75～84歲的人群中，房顫發(fā)病率增長至12%[3]。 已有多項研究[4-6]證實，年齡增加是房顫的獨立危險因素。

縫隙連接(gap junction)是相鄰細胞間進行物質(zhì)與能量交換的主要通道，在心肌組織中，縫隙連接主要由縫隙連接蛋白(connexins，Cx)在細胞端端側(cè)的閏盤處組成，是動作電位的形成以及心肌細胞協(xié)調(diào)收縮的基礎[7-8]。目前，特異性表達于哺乳動物心肌組織中的縫隙連接蛋白主要是Cx40、Cx43和Cx45，其中，Cx40被證實與房顫的發(fā)生與維持最為相關[9]。

本實驗通過藥物干預不同年齡段大鼠，觀察各組大鼠房顫發(fā)生率，并檢測各組大鼠心房肌結(jié)構及Cx40的數(shù)量和分布，探討心房肌組織的增齡性變化，為增齡性房顫的治療提供一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑

72只健康雄性SPF級SD大鼠，體重(250±20)g，購自西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)08-018，均符合西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心倫理管理委員會有關動物管理及使用規(guī)定。兔抗Cx40多克隆抗體(Abcam)，兔抗三磷酸甘油醛(GAPDH)單克隆抗體(Abcam)，硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG抗體及辣根過氧化物酶耦聯(lián)羊抗兔IgG抗體均購自萬類生物技術有限公司。

1.2房顫的誘導

實驗大鼠飼養(yǎng)于西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心，自由飲水及飲食，自然12 h光照，適應性喂養(yǎng)1周后按照年齡分為3組：9～12月齡(青年組)、18～21月齡(中年組)、24～26月齡(老年組)，每組24只。10%水合氯醛麻醉后，根據(jù)相關文獻[10]，其中12只大鼠房顫模型的建立通過尾靜脈注射CaCl210 mg/mL+Ach 66 μg/mL 混合液，每天1次，持續(xù)7 d。每組其余12只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)24 h，稱重，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)開胸，迅速摘取心房。

1.3心電圖監(jiān)測

每次尾靜脈注射后各組大鼠均記錄肢體導聯(lián)心電圖30 min。

房顫時間測定:以出現(xiàn)典型的房顫波f波及P波消失為房顫開始標志, 以f波消失P波出現(xiàn)，出現(xiàn)竇性心律為房顫終止標志。

1.4心房組織病理學觀察

心房組織病理形態(tài)HE染色：取大鼠心房組織常規(guī)石蠟切片，經(jīng)脫水，HE染色，二甲苯透明、中性樹膠封片等步驟，普通光鏡下觀察。

心房組織膠原纖維Masson染色：取大鼠心房組織常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水，重鉻酸鉀媒染劑浸泡組織約12 h，自來水和蒸餾水依次沖洗，Weigert蘇木精染核10 min，流水充分沖洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗至返藍，Masson麗春紅酸性復紅液染10 min，蒸餾水快速沖洗，1%磷鉬酸水溶液分化5 min，苯胺藍液復染3 min，0.2%冰醋酸浸洗，95%酒精、無水乙醇各脫水20 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，普通光鏡下觀察。

1.5Western-blot檢測Cx40蛋白

將提取的心房組織用液氮快速處理，加入裂解液及蛋白酶抑制劑后冰上充分研磨勻漿，多次離心后提取組織蛋白，Bradford方法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液(loading buffer)后煮沸變性。使用10%的分離膠和4%的濃縮膠，每孔上樣量20 μg，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂奶粉溶液(溶于Tris-HCl緩沖鹽-Tween緩沖液，TBST)搖床上室溫封閉1 h，分別將膜轉(zhuǎn)入溶于TBST的兔抗Cx40單克隆一抗(1∶800)和兔抗GAPDH單克隆一抗(1∶1 000)中，4 ℃冰箱孵育過夜，TBST室溫洗膜15 min×3次。室溫下加羊抗兔二抗(1∶5 000)搖床孵育2 h，同前洗膜3次，TBS(Tris-HCl緩沖鹽溶液)洗膜15 min×1次以洗掉Tween，ECL發(fā)光液浸泡5 min后凝膠成像系統(tǒng)攝像分析。

1.6免疫熒光染色及激光共聚焦掃描成像

大鼠新鮮心房組織4%多聚甲醛中固定24 h，30%蔗糖脫水48 h，使用OCT進行包埋，在-25 ℃恒冷切片機上切成6 μm厚的組織切片，將組織貼于多聚賴氨酸載玻片。玻片放入PBS緩沖液中漂洗5 min×3次，4%牛血清37 ℃溫箱封閉30 min。將封閉液甩干后加入兔抗Cx40多克隆一抗(1∶100)， 4 ℃冰箱過夜。次日將切片用PBS緩沖液漂洗5 min×3次，加入FITC標記的羊抗兔IgG抗體(1∶400，避光)，37 ℃溫箱孵育1 h，PBS緩沖液浸洗5 min×3次，含DAPI封片劑封片。使用激光共聚焦顯微鏡(Olympus)掃描488 nm波長的熒光，將圖片處理后進行分析。

1.7統(tǒng)計學分析

2　結(jié)果

2.1心電圖監(jiān)測結(jié)果

與青年組(25%，3只)和中年組(41.7%，5只)相比，老年組共有10只大鼠成功誘發(fā)房顫，房顫發(fā)生率為83.3%，與其他兩組相比顯著升高且P<0.05。

青年組和中年組在給予干預后的中后期僅有部分大鼠誘發(fā)出房顫，而老年組在給予干預當天即有大鼠成功誘發(fā)出房顫，直至第七7天，房顫持續(xù)時間達到穩(wěn)定，且與其他兩組比較，持續(xù)時間明顯升高，P<0.05(表1)。

表1　各組大鼠平均房顫持續(xù)時間的比較

*P<0.05，與青年組和中年組比較。

2.2心房組織病理學觀察

根據(jù)圖1可見，青年組及中年組大鼠心房組織細胞形態(tài)結(jié)構基本正常，細胞間排列緊密，無明顯結(jié)締組織增生，而老年組大鼠心肌細胞肥大，排列紊亂，細胞間結(jié)締組織明顯增生，符合心肌組織增齡退行性改變。

2.3各組大鼠心房肌Cx40的表達差異

根據(jù)圖2的結(jié)果，青年組與老年組大鼠心房組織的Cx40量沒有明顯差別，而老年組大鼠Cx40的量與其他兩組相比明顯減少(P<0.05)。

2.4各組大鼠心房肌Cx40的分布改變

如圖3所示，隨著年齡的增長，Cx40的分布由典型的端端分布變?yōu)辄c團狀的雜亂分布，這為房顫的發(fā)生及維持提供了病理結(jié)構基礎。

3　討論

根據(jù)我們的研究所示，老年大鼠房顫發(fā)生率高于其他兩組且房顫持續(xù)時間較長，這可能與老年大鼠心房肌組織病理學改變以及Cx40的表達量及分布改變相關。目前，眾多研究已證實房顫的發(fā)生和維持與心房重構密切有關。心房重構包括結(jié)構重構和電重構，早期以電重構為主，表現(xiàn)為離子通道及縫隙連接蛋白功能的改變，可以被逆轉(zhuǎn)；而心房晚期重構則表現(xiàn)為結(jié)構重構，即心肌細胞肥大及排列紊亂、間質(zhì)纖維化和心房擴張等，一旦發(fā)生很難被逆轉(zhuǎn)[11-13]，并且會成為其他心臟疾病的結(jié)構基礎。因此，抑制心房重構已成為臨床上防止房顫復發(fā)、改善患者預后的重要目標。

老年人中房顫發(fā)生率較高，發(fā)達國家75歲以上的人群中，房顫的患病率高達 10%，甚至更高。因此，增齡性改變是房顫發(fā)生的重要危險因素。根據(jù)我們的研究結(jié)果，老年大鼠的心房肌組織出現(xiàn)細胞肥大，細胞排列疏松、紊亂，心肌間質(zhì)纖維化明顯且脂肪異常堆積等退行性改變，這些心肌組織的結(jié)構改變導致由肌纖維構成的心肌框架失去原本正常的傳導功能，不僅如此，位于心肌細胞端端側(cè)閏盤處的縫隙連接蛋白隨著細胞結(jié)構的紊亂而發(fā)生錯位，導致端端側(cè)電流傳導受阻而增加側(cè)側(cè)傳導，易于形成心房內(nèi)折返[11-13]，而折返是房顫發(fā)生與維持的經(jīng)典機制。

縫隙連接作為心肌細胞間電與化學信號傳遞的重要通道，在維持電與機械偶聯(lián)，確保心肌同步收縮方面起著重要作用[7-8]。增齡性衰退引起的縫隙連接蛋白的分布及表達量的變化都可以改變心房肌正常的激動傳導方式，使心肌各向異性(橫向與縱向傳導速度之比)傳導增加，心房肌正常激動傳導方式發(fā)生改變，房顫易感性增加[14-15]。本實驗發(fā)現(xiàn)，在老年大鼠中，心房組織Cx40的表達量明顯下降，且分布由端端連接漸趨雜亂點團狀分布，這種不規(guī)則分布促發(fā)多子波折返的出現(xiàn)，為房顫發(fā)生準備了病理基礎。Zhang等[16]在動物模型中發(fā)現(xiàn)，房顫動物心房肌Cx40 表達量較對照組相比明顯下降。由此可以看出，Cx40的改變可以誘發(fā)房顫，而房顫的發(fā)生又可以反過來加劇Cx40的改變，從而形成惡性循環(huán)，使陣發(fā)性房顫逐漸變?yōu)槌掷m(xù)性房顫，增加了治療難度。

總結(jié)起來，老年人房顫發(fā)生率遠高于其他年齡人群與心房肌組織的增齡退行性改變有極大關系。目前已發(fā)現(xiàn)可以增強縫隙連接通道的電傳導，改善心肌細胞間電偶聯(lián)，有效改善傳導速度的生物活性物質(zhì)[17]，能否將此種物質(zhì)運用于臨床，有效地預防增齡性房顫，仍值得我們?nèi)ド钊胙芯俊?/p>

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(學術編輯：劉濤)

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Aging-related changes in rats and their effect on the high incidence rate and duration of atrial fibrillation in aged rats

WEI Yue-jiao，MENG Tian-yu，SUN Chao-feng，JIANG Yong-rong，MA Shu-ting

(DepartmentofCardiovasology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061，Shaanxi，China)

Objective：To investigate the aging-related changes in gap junction protein-connexin 40(cx40)in rats and their effect on the high incidence rate and duration of atrial fibrillation in aged rats.Methods：The 72 healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3age groups(n=24，each),9-12 months(young-adult)，16-19 months(middle-adult) and 24-26 months(aged).Atrial fibrillation was induced by injecting mixed Ach-CaCl2solution into the caudal veins of SD rats which are selected randomly,12 rats in each group.The incidence rate and duration of atrial fibrillation was recorded by monitoring their limb-lead Electroa rdiogram(ECG)．The remaining 12 rats in each group take the atrial tissue after anesthesia,morphological changes of atrial myocardium were observed under optical microscope in Hematoxylin(HE) and Masson’s stain．The Cx40 protein expression was assessed by Western-Blot and the distribution of Cx40 was observed by confocal immunofluorescence microscopy.Results：The incidence rate(83%，n=10) and duration of atrial fibrillation was much higher and longer in aged group than in other two groups (allP<0.05)，and the aged group showed that atrial muscle cells were enlarged,the cells arranged sparse,and the myocardial fibrosis was obvious.The expression amount of Cx40 decreased as age increased compared with the young-adult,the difference was statistically significant(P<0.05),and the distribution of Cx40 changed from end-to-end to disordered arrangement.Conclusion：For aged rats,the high incidence rate and long duration of atrial fibrillation may be associated with atrial myocardium reconstruction,disarrangement of gap junction proteins and decreased expression amount of Cx40．

Atrium；Connexin 40；Atrial fibrillation

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.05.07

國家自然科學基金資助項目(81270236)

2016-05-19

衛(wèi)月嬌(1990-)，女，住院醫(yī)師。E-mail：zgxlj@126.com

孫超峰，E-mail:csun1@163.com

時間：2016-10-2511∶31

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20161014.1716.014.html

1005-3697(2016)05-0648-04

R541.7；R363

A