胡英婕

（錦州醫(yī)科大學 醫(yī)療學院，遼寧 錦州 121000）

微波法提取連翹苷的工藝研究

胡英婕

（錦州醫(yī)科大學 醫(yī)療學院，遼寧 錦州 121000）

以連翹葉為原料，連翹苷含量為檢測指標，以提取溶劑、液料比、微波功率、提取時間為因素，采用四因素三水平 L9（34）正交設計優(yōu)選出連翹苷的最佳提取條件。結(jié)果表明，最佳提取條件為用液料比10∶1的75%乙醇微波（300 W）提取3次，每次120 S，得到連翹苷含量為0.52%。提取工藝合理可行，穩(wěn)定可靠。

微波；連翹苷；提取工藝

連翹是中藥臨床常用藥材之一，具有清熱解毒，消腫散結(jié)、疏散風熱之效，常取其果實用藥，2015年版藥典規(guī)定用高效液相色譜測定其主要成分連翹苷的含量。現(xiàn)代藥理和化學成分研究表明，連翹葉具有與果實相似的化學成分，含連翹苷、連翹酯苷A、齊墩果酸、蘆丁等多種有效成分，具有良好的抑菌、抗病毒作用，在治療肺炎、上呼吸道感染等方面有很好的療效［1-2］。

但 2015版藥典尚未收錄連翹葉做藥材，本研究以連翹葉為研究對象，采用微波提取工藝，正交實驗設計摸索出其主要成分連翹苷的最佳提取方案。目前文獻沒有用此方法提取連翹苷的報道，該提取工藝對促進連翹葉用藥及連翹苷單體的開發(fā)和利用具有重要意義。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

連翹葉，采自遼寧中醫(yī)藥大學校園內(nèi)，經(jīng)錦州成大方圓藥店主任中藥師王景清鑒定為木犀科植物連翹的葉子。連翹苷對照品，購自中國藥品生物制品檢定所（批號：120520-201503）；甲醇、乙腈為色譜醇（天津市康科得科技有限公司），乙醇為國產(chǎn)分析純，水為自制重蒸水。

BP211D 型十萬分之一電子分析天平（德國 Satrorius 公司）、KQ-100A 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、NJL07-3型微波提取設備（南京杰全微波設備有限公司）、ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（北京金歐亞科技發(fā)展有限公司）。TU-1800 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。檢測波長：用紫外檢測器對連翹苷對照品溶液進行紫外全程掃描。連翹苷的最大吸收波長在 277 nm 處，故確定連翹苷的檢測波長是 277 nm。F 2200型高效液相色譜儀（溫嶺福立分析儀器公司），流動相/乙腈―水（25∶75），柱溫 35℃，檢測波長 277 nm，體積流量 0.8 mL/min。

1.2 實驗操作

連翹苷供試品溶液的制備 取連翹葉研成粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，用液料比為10∶1的75%乙醇浸泡1 h，置微波提取器中，微波功率300 W，提取3次，每次120 s，搖勻，濾過，濾液即為供試品溶液。

連翹苷對照品儲備液的配制 取 105℃干燥至恒重的連翹苷對照品 5.0 mg，置于 25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解、稀釋至刻度，定容為含連翹苷0.2 mg/mL 的儲備液。

2 結(jié)果與討論

2.1 連翹苷的測定

標準曲線線性范圍考察 精密吸取連翹苷對照品儲備液 0.50、1.50、2.50、3.50、4.50、5.50、6.50 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾后，各進樣 10 μL， 注入高效液相色譜儀。記錄連翹苷對照品的色譜圖，由峰面積測定結(jié)果，得到進樣量（x）和峰面積值（y）的回歸方程：y=1 459 485 x+215 419.0，r=0.999 3。連翹苷進樣量在0.1～1.3 g 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系。

精密度實驗 精密吸取連翹苷對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復進樣6次，得到峰面積值，計算得到連翹苷含量的RSD=0.8%。

重復性實驗 取同一批次樣品制備成6份供試品溶液，分別進樣10 μL，計算得到連翹苷含量的RSD =1.2%。

穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別在0、4、8、16、24 h進樣，得到峰面積值。計算得到連翹苷含量的RSD=1.1%。表明供試品溶液在24 h之內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收率實驗 分別精密吸取一定量的供試品溶液，加入適量的對照品溶液，制備成加樣供試品溶液，平行操作9次，得到峰面積值。計算得到平均回收率為98.85%，RSD=1.2%。

樣品測定 精密吸取不同批次供試品溶液，進樣6次，得到峰面積值。計算得到連翹苷含量的RSD= 1.3%。

2.2 連翹苷提取的單因素分析

根據(jù)相關文獻［3-6］，考察單因素對連翹苷提取效果的影響。

2.2.1 提取溶劑的考察

表1是分別用50%乙醇、75%乙醇、純水、50%甲醇、75%甲醇五種提取溶劑，得到的連翹苷含量，結(jié)果表明，提取溶劑對連翹苷的含量有影響，75%乙醇的提取效果較好。

表1 提取溶劑的考察結(jié)果

2.2.2 提取時間的考察

圖1是每次提取時間分別為60、90、120、150、180 s，得到連翹苷含量的曲線圖。由圖1可知，提取時間對連翹苷的含量有影響，每次提取時間為120 s效果最好。

圖1 提取時間對含量的影響

圖2 液料比對含量的影響

2.2.3 液料比的考察

圖2是液料比分別為8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1時，得到連翹苷含量的曲線圖。由圖2可知，液料比增加，連翹苷的得率也會增加。但液料比為10∶1、11∶1、12∶1得到的連翹苷含量無明顯變化，考慮成本，選擇最適宜液料比為10∶1。

2.2.4 微波功率的考察

圖3是不同提取功率（200、300、400、500 W），得到連翹苷含量的曲線圖。結(jié)果表明提取功率對連翹苷的含量有影響，功率為300 W效果較好。

圖3 微波功率對含量的影響

圖4是分別浸泡0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，得到連翹苷含量的曲線圖。結(jié)果表明浸泡時間對連翹苷的含量有影響，浸泡時間為1h效果好些，浸泡時間過長，不僅后期過濾困難，提取效果反而不好。

圖4 浸泡時間對含量的影響

2.2.6 原料粒度的考察

圖5是藥材粉碎分別過10目（1號篩）、24目（2號篩）、50目（3號篩）、65目（4號篩）、80目（5號篩），得到連翹苷含量的曲線圖。結(jié)果：原料粒度對連翹苷的含量有影響，但50目（3號篩）、65目（4號篩）、80目（5號篩）測得連翹苷含量基本相同，而過65目（4號篩）和80目（5號篩），藥材過碎，后期過濾增加難度，故選擇過50目（3號篩）即可。

圖5 原料粒度對含量的影響

2.2.7 提取次數(shù)的考察

圖6是分別提取1、2、3、4次，得到連翹苷含量的曲線圖。結(jié)果表明提取3次和提取4次，連翹苷含量相差不大，考慮成本，選擇提取3次。

圖6 提取次數(shù)對含量的影響

2.3 正交試驗設計

(3)應該盡可能結(jié)合兩漢時期某兩組聲母的語音關系來確定方言特點。語音發(fā)展是有傳承性的。如果某兩組聲母混用仍集中表現(xiàn)在兩漢時期某一特定方言區(qū)的作品中，則說明這一現(xiàn)象可能是某種方言特點的延續(xù)。具體而言，郭店楚簡語音材料反映出的聲母相近關系如果集中體現(xiàn)于兩漢時期楚人的作品之中，則很可能說明這一特點即楚方言的聲母特點。反之則非。

由單因素分析結(jié)果可知，提取溶劑、液料比、微波功率、提取時間均會對連翹苷含量有影響，設計正交實驗四因素三水平表，如表2所示。

表2 連翹苷提取正交試驗因素及水平表

取連翹葉研成粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，置微波提取器中，分別按照 L9（34）正交表設計提取方案進行 3 次重復試驗，搖勻，濾過，即為供試品溶液。供試品溶液微孔濾膜過濾后，進樣 10 μL，將峰面積值代入標準曲線回歸方程，計算連翹苷含量，結(jié)果如表3所示。連翹苷提取結(jié)果方差分析表如表4所示。

表3 連翹苷提取 L9（34）正交實驗結(jié)果表

續(xù)表3

表4 連翹苷提取結(jié)果方差分析表

以連翹苷含量為評價指標，由極差 R 值大小可知，各因素影響作用主次為：D＞C＞B＞A。方差分析結(jié)果表明：A、B、C、D 因素影響均較大，均具顯著意義（P＜0.01）。根據(jù)正交實驗結(jié)果，連翹苷最佳提取方案為：A3B3C2D1。即用液料比10∶1的75%乙醇微波（功率300 W）提取3次，每次120 s。

綜上所述，連翹苷提取方案為：取連翹葉研成粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，用液料比為10∶1的75%乙醇浸泡1 h，置微波提取器中，微波功率300 W，提取3次，每次120 s，搖勻，濾過，濾液即為供試品溶液。供試品溶液微孔濾膜過濾后，進樣10 μL，峰面積帶入標準曲線回歸方程，計算連翹苷含量。

2.4 最佳工藝驗證試驗

取3批藥材進行驗證實驗，得到連翹苷的含量分別為0.55%、0.53%、0.59%，表明本提取工藝穩(wěn)定、可靠，且提取效果較好。

2.5 不同方法提取連翹苷工藝的比較

文獻優(yōu)選提取連翹葉中連翹苷的方法有超聲提取和加熱回流提取兩種方法，和本實驗優(yōu)選的微波提取方法做比較。

2.5.1 超聲提取法

取連翹葉研成粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，用液料比為10∶1的水浸泡1 h，置錐形瓶中超聲提取3次，每次30 min，過濾。再微孔濾膜過濾后，進樣，計算得到連翹苷的含量為4.77%。

2.5.2 加熱回流提取

取連翹葉研成粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，用液料比為10∶1的75%乙醇浸泡1 h，置燒瓶中回流提取3次，每次提取30 min，過濾。再微孔濾膜過濾后，進樣，計算得到連翹苷的含量為4.86%。

2.5.3 微波提取法

取連翹葉研成粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，用液料比為10∶1的75%乙醇浸泡1 h，置微波提取器中，微波功率300 W，提取3次，每次120 s，搖勻，濾過，濾液即為供試品溶液。供試品溶液微孔濾膜過濾后，進樣10 μL，將峰面積值帶入標準曲線回歸方程，計算連翹苷含量為0.54%。

結(jié)果表明：微波提取法所得到的連翹苷含量高，且提取時間短，安全節(jié)能。由于藥典還沒有把連翹葉收錄為藥材，沒有連翹苷含量的準確數(shù)據(jù)，故所測得含量值越大，表明提取效果越好。

3 結(jié)論

1）微波提取優(yōu)點是對提取物具有較高的選擇性，提取率高，提取速度快，溶劑用量少，安全節(jié)能，設備簡單，為現(xiàn)代中藥材提取的先進方法。

2）連翹苷經(jīng)最佳工藝提取后，用高效液相色譜測定連翹苷的含量。實驗色譜條件下，在其對照品出峰保留時間處，有相應色譜峰，且連翹苷峰與雜質(zhì)峰較好分離，連翹苷峰理論塔板數(shù)不低于4 000，分離度＞1.5。

3）由連翹苷含量結(jié)果知，連翹葉中所含連翹苷的含量比連翹高3倍以上，且含有連翹酯苷A、齊墩果酸、蘆丁等其他有效成分，進一步尋找這些成分的提取純化方法，會為將來連翹葉用藥提供更有力的理論依據(jù)。

［1］ 原江峰, 王大紅, 何靈美, 等. 連翹葉提取物抑菌作用以及穩(wěn)定性研究［J］. 食品工業(yè)科技, 2013, 34（5）: 57-59.

［2］ 秦臻, 徐軍, 張立偉. 連翹及連翹葉體外抑菌作用研究［J］. 食品工程, 2013, 6（2）: 49-52.

［3］ 李飛鶴, 杜杰, 陳廷貴, 等. 連翹苷快速提取純化工藝研究［J］. 食品工程, 2014, 4（2）: 32-35.

［4］ 姬雪禮, 李文烈, 鄭曉杰, 等. 高效液相色譜法同時測定連翹葉中連翹酯苷A和連翹苷含量［J］. 中國藥業(yè), 2014, 23（7）: 33-34.

［5］ 楊隸華, 黃蘭, 鄭顯輝, 等. 不同產(chǎn)地連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A的含量測定［J］. 臨床醫(yī)學工程, 2013, 20（3）: 288-289.

［6］ 歐陽麗娜, 李蘭林, 吳雪, 等. 正交設計優(yōu)選竹節(jié)參總皂苷微波提取工藝的研究［J］. 中草藥, 2010, 41（10）: 1639-1642.

Investigation on Microwave Extraction Technology of Phillyrin

HU Ying-jie
（Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China）

The extraction process was optimized by L9（34） orthogonal test with forsythia suspense leaves as material, the content of phillyrin as detect index, and extraction solvent, liquid to material ratio, microwave power and extraction time as influential factors. The optimal extraction conditions was microwave （300 W） extracting 3 times by 75% ethyl alcohol （liquid material ratio 10∶1）, 120 S. The content of phillyrin was 0.52%. The optimal extraction process was steady and reliable.

microwave； phillyrin； extraction technology

R284.2

A

1009-220X（2016）05-0007-06

10.16560/j.cnki.gzhx.20160515

2016-06-30

胡英婕（1971～），女，講師，碩士；主要從事藥物有效成分的化學分析的研究。jzykdxylxyhyj@126.com