韓奇鵬　掲紅東　羅　玲　王凱軍　周傳社　張佩華*　孔志偉　湯少勛

(1.中國科學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，長沙410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410128)

?

谷氨酰胺及其二肽對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

韓奇鵬1,2掲紅東2羅玲2王凱軍2周傳社1*張佩華2*孔志偉1湯少勛1

(1.中國科學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，長沙410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410128)

本試驗(yàn)通過建立過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡模型，研究谷氨酰胺(Gln)、甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln)和丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)對(duì)凋亡細(xì)胞的凋亡率及Bcl-2、Bax基因表達(dá)量的影響。選用60日齡湘東黑山羊的瘤胃上皮傳代細(xì)胞，采用不同濃度[0(對(duì)照組)、100、400、800 μmol/L]的H2O2培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。傳代瘤胃上皮細(xì)胞分為5組，對(duì)照組和1組分別添加0、800 μmol/L H2O2，2組、3組、4組均添加800 μmol/L H2O2，同時(shí)分別添加17.28 mmol/L Gly-Gln(2組)、16.0 mmol/L Gln(3組)、16.0 mmol/L Ala-Gln(4組)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax基因表達(dá)量。結(jié)果顯示：1)與對(duì)照組相比，當(dāng)H2O2濃度增加到800 μmol/L時(shí)，早期凋亡的凋亡率顯著增加(P<0.05)，而晚期凋亡的凋亡率隨著H2O2濃度的增加呈現(xiàn)增加后減少的趨勢(shì)，但相對(duì)于對(duì)照組，都呈顯著增加(P<0.05)。2)與對(duì)照組相比，4組晚期凋亡的凋亡率顯著增加(P<0.05)，試驗(yàn)組早期凋亡的凋亡率均顯著增加(P<0.05)。3)與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組Bcl-2/Bax均顯著增加(P<0.05)；與1組相比，2組、3組和4組Bcl-2/Bax均顯著增加(P<0.05)，且2組顯著高于3組、4組(P<0.05)。綜合得出，Gly-Gln對(duì)H2O2引起山羊瘤胃上皮細(xì)胞早期凋亡具有一定的保護(hù)作用。

湘東黑山羊；瘤胃上皮細(xì)胞；凋亡；凋亡基因

氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)是斷奶家畜常見的機(jī)體狀態(tài)，是導(dǎo)致斷奶家畜生產(chǎn)遭受損失的重大原因之一[1]。近年，畜牧業(yè)集約化生產(chǎn)程度雖不斷提高，但是由于家畜斷奶后采食量的迅速下降后再上升，導(dǎo)致胃腸道內(nèi)血流量大量減少后再升高，進(jìn)而出現(xiàn)“缺血再灌注”的現(xiàn)象，并伴隨產(chǎn)生大量的過氧化氫(H2O2)，H2O2再通過Fenton反應(yīng)和Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧化自由基，對(duì)胃腸組織細(xì)胞造成損傷[2-5]。同時(shí)飼糧中多飽和脂肪酸含量過高、礦物元素(硒、鋅、錳等)缺乏、環(huán)境冷熱變化、電離輻射、藥物和疫苗大量使用等都會(huì)使組織細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，使斷奶家畜處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[6]。

H2O2可使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)源性凋亡和/或線粒體凋亡途徑。如Bcl-2家族的Bax、Bak凋亡前體蛋白被激活，導(dǎo)致線粒體膜發(fā)生易位，但同時(shí)Bcl-2抗凋亡蛋白與被激活的凋亡前體蛋白形成異聚體，進(jìn)而抑制線粒體膜的損傷[7-8]。此外，Bcl-2可抑制細(xì)胞色素C(Cty C)的釋放[9]，阻止脫氧三磷酸腺苷(deoxyadenosine triphosphate,dATP)和凋亡蛋白酶激活因子(apoptosis totic protease activating factor-1,Apaf-1)在胞質(zhì)內(nèi)形成混合物[10]，進(jìn)而抑制半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9的激活，并阻止下游的caspases-3和caspases-7的激活，最終抑制凋亡的發(fā)生[11]。

隨著畜牧業(yè)集約化生產(chǎn)和動(dòng)物保健意識(shí)的不斷成熟，一些實(shí)際生產(chǎn)問題有了深入認(rèn)識(shí)。因此，了解氧化應(yīng)激的概念、機(jī)制、內(nèi)外因素作用的機(jī)理等，可使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)[如谷胱甘肽(GSH)、維生素E、谷氨酰胺(Gln)、鎂(Mg)、硒(Se)、維生素C及活性物質(zhì)二氫楊梅素和茶多酚等外源性抗氧化活性物質(zhì)]得到更好的應(yīng)用[12-13]。

飼料中適量添加Gln、丙氨酰谷氨酰胺(alanyl-glutamine,Ala-Gln)和甘氨酰谷氨酰胺(glycyl-glutamine,Gly-Gln)的對(duì)過氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用[12]。但在飼料工業(yè)化生產(chǎn)過程中，Gln的添加量較大、吸收率較低、水溶性較低、穩(wěn)定性較差和易產(chǎn)生有害物質(zhì)(焦谷氨酸和氨)，所以Gln未在實(shí)際生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用[14]。但隨著人們對(duì)二肽及動(dòng)物胃腸道對(duì)二肽消化吸收特點(diǎn)認(rèn)識(shí)的不斷提高，作為Gln供體物質(zhì)的Ala-Gln和Gln替代品的Gly-Gln可彌補(bǔ)Gln單體的缺陷[15]。此外，已成為人類營養(yǎng)研究領(lǐng)域研究熱點(diǎn)的Ala-Gln和Gly-Gln，在臨床醫(yī)學(xué)的全腸胃外營養(yǎng)(TPN)中的研究逐漸成熟，為Ala-Gln和Gly-Gln二肽在飼料生產(chǎn)中廣泛的應(yīng)用提供了理論支撐[16]。

因此,本試驗(yàn)以H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞氧化應(yīng)激，研究Gln、Gly-Gln和Ala-Gln對(duì)細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響，為研究山羊瘤胃上皮細(xì)胞營養(yǎng)代謝和氧化應(yīng)激機(jī)制之間相互關(guān)系提供一定的試驗(yàn)參考。

1　材料與方法

1.1山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞

試驗(yàn)動(dòng)物為3只60日齡健康的湘東黑山羊，體重為(6.4±0.8) kg。頸靜脈放血致死，取出瘤胃組織，去掉內(nèi)容物后用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，待用于樣品采集。

當(dāng)山羊瘤胃上皮原代細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿的80%～90%時(shí)，棄去DMEM/F12完全培養(yǎng)液[含5%胎牛血清(FBS)、10%雙抗、0.1 mg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B]，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞1～2次后，加入1 mL的含0.25%胰蛋白酶(trypsin)+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的消化液，放入含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中消化2～3 min。放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞開始變亮、變圓時(shí)，迅速用含DMEM/F12完全培養(yǎng)液終止消化。將貼壁的細(xì)胞吹打?yàn)閼乙?，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，在4 ℃離心機(jī)中94×g離心5 min，棄去上清液，加入1 mL的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以1∶2進(jìn)行傳代。在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，轉(zhuǎn)移含細(xì)胞的DMEM/F12完全培養(yǎng)液至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)1次，此步為純化過程。

1.2主要試劑與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清(FBS)、DMEM/F12、0.25% trypsin+0.02% EDTA、青霉素均購自Gibico公司；兩性霉素B+慶大霉素(gentamicin/amphotericin solution)購自Thermo公司；Gln、Gly-Gln和Ala-Gln均購自Abcam公司。

PCR相關(guān)試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；EDTA、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、二溴乙烷(EB)購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；Taq酶、DL2000 DNA marker、dNTP購自Genstar公司；引物購自南京金斯瑞生物科技公司；SYBR Green PCR Mix購自Invitrogen公司；常規(guī)化學(xué)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。

臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)儀購自Thermo公司；電泳儀購自Bio-Rad公司；水平瓊脂糖電泳槽購自北京六一儀器廠；精密pH計(jì)購自雷磁儀器廠；電動(dòng)玻璃勻漿器購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3主要溶液與配制

主要溶液有：還原型5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液；電泳液緩沖液；轉(zhuǎn)膜緩沖液；TBS緩沖液；TBST緩沖液；5×TBE溶液；RNase A母液(10 mg/mL)；Agarose凝膠；無酶水。

H2O2的稀釋：H2O2用無菌、無霉水稀釋至終濃度分別為100、400、800 μm/L。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1H2O2誘導(dǎo)凋亡瘤胃上皮細(xì)胞的凋亡率

取第4代后對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，消化后按1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入2 mL不含PBS的新鮮培養(yǎng)基，分為4組，分別添加0(對(duì)照)、100、400和800 μmol/L H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.2Gln及其二肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡瘤胃上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax基因表達(dá)量的影響

細(xì)胞選擇和前期處理同1.4.1，細(xì)胞分為5組，對(duì)照組和1組分別添加0、800 μmol/L H2O2，2組、3組、4組均添加800 μmol/L H2O2，同時(shí)分別添加17.28 mmol/L Gly-Gln(2組)、16.0 mmol/L Gln(3組)、16.0 mmol/L Ala-Gln(4組)。

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1流式細(xì)胞(flow cytometry,FCM)技術(shù)檢測(cè)瘤胃上皮細(xì)胞凋亡率[膜聯(lián)蛋白-V(annexin V，AV)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)雙染法]

山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞培養(yǎng)于含5% FBS的DMEM/F12中，收集培養(yǎng)24 h的傳代細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，每組重復(fù)3次。步驟如下：1)用不含EDTA的trypsin消化液消化，并收集山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞；2)用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次376×g離心5 min，收集1×105～5×105個(gè)細(xì)胞；3)加入500 μL的結(jié)合緩沖液(binding buffer)懸浮細(xì)胞；4)加入5 μL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑[AV-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒]混勻后，加入5 μL PI，混勻；5)室溫、避光，反應(yīng)5～15 min；6)1 h內(nèi)，上BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀觀察檢測(cè)。

1.5.2Gln及其二肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡瘤胃上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響

1.5.2.1總RNA提取

1.5.2.1.1試驗(yàn)前準(zhǔn)備

將所有提取總RNA所需器械及耗材浸泡于提前配制好的1% DEPC水中過夜，第2天將器械和耗材用報(bào)紙包好，121 ℃ 60 min濕熱滅菌。

1.5.2.1.2Trizol提取細(xì)胞總RNA

總RNA提取步驟如下：1)向細(xì)胞中加入1 mL Trizol充分吹打，混勻后室溫裂解3 min；加入0.2倍體積的三氯甲烷，振蕩，室溫靜置3～5 min。2)12 000×g低溫離心15 min，取上層液相，加入等體積的異丙醇，-20 ℃靜置20 min。3)12 000×g低溫離心15 min，去上清，沉淀中加入1 mL 75%乙醇(無菌1% DEPC水配制)，振蕩混勻。4)12 000×g低溫離心5 min，去上清，空氣干燥5～10 min。加入40 μL無菌1% DEPC水溶解沉淀得到總RNA溶液。5)紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，吸取2 μL總RNA溶液于石英比色皿中，用無酶水定容至100 μL，在260與280 nm處測(cè)其吸光度值(A)，并計(jì)算其濃度及純度(要求達(dá)到1.8～2.0),公式如下：

RNA濃度(ng/μL)=A260 nm×稀釋倍數(shù)×40；

RNA純度=A260 nm/A280 nm。

1.5.2.1.3RNA的瓊脂糖凝膠電泳

將配制好的1%變性瓊脂糖凝膠加熱至瓊脂糖溶解，再冷至60 ℃,加入0.5 μL EB(10 mg/mL)，混勻后倒入事先用滅菌1% DEPC水處理的電泳槽中；取2 μL提取的總RNA，按1∶5的比例與上樣緩沖液混勻，170 V恒壓電泳，溴酚藍(lán)前沿遷移至凝膠總長2/3處停止電泳；凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.5.2.1.4反轉(zhuǎn)錄PCR

反轉(zhuǎn)錄PCR體系(30 μL):dNTP(2.5 mmol/L) 6 μL、Primer Mix 3 μL、總RNA 6 μL、5×RT Buffer 6 μL、二硫蘇糖醇(DTT)0.1 mmol/L 3 μL、HiFiScript(200 U/μL) 1.5 μL、無RNA酶水4.5 μL。

1.5.2.2FQ-PCR

1.5.2.2.1引物設(shè)計(jì)

在NCBI上搜索目的基因的序列，運(yùn)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，由南京金斯瑞生物科技公司合成引物，引物參數(shù)見表1。

1.5.2.2.2FQ-PCR體系組成

FQ-PCR體系(30 μL)：模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，水13 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 15 μL。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，每孔(10 μL)為1個(gè)重復(fù)。

1.5.2.2.3FQ-PCR擴(kuò)增程序

擴(kuò)增程序如下：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

細(xì)胞凋亡應(yīng)用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，并用Flowjo軟件進(jìn)行圖像分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)差異顯著性水平定義為P<0.05，P>0.05則無顯著差異。

表1　引物參數(shù)

2　結(jié)果與分析

2.1H2O2誘導(dǎo)凋亡瘤胃上皮細(xì)胞的凋亡率

由表2可以看出，與對(duì)照組相比，當(dāng)H2O2濃度增加到800 μmol/L時(shí)，早期凋亡的凋亡率顯著增加(P<0.05)；而晚期凋亡的凋亡率隨著H2O2濃度的增加呈現(xiàn)增加后減少的趨勢(shì)，但試驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組，都呈顯著增加(P<0.05)。結(jié)果說明，H2O2可以誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡加劇。

2.2Gln及其二肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡瘤胃上皮細(xì)胞的凋亡率的影響

由表3可以看出，與對(duì)照組相比，4組晚期凋亡的凋亡率顯著增加(P<0.05)，1組、3組晚增加，2組降低，但差異均不顯著(P>0.05)；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組早期凋亡的凋亡率均顯著增加(P<0.05)，而2組為試驗(yàn)組中最低。結(jié)果說明，Gly-Gln可緩解H2O2對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞造成早期凋亡。

表2　H2O2誘導(dǎo)凋亡瘤胃上皮細(xì)胞的凋亡率

同行數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3Gln及其二肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的凋亡瘤胃上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax基因表達(dá)量的影響

2.3.1總RNA提取

總RNA提取結(jié)果如圖3所示，提取的總RNA條帶清晰，可用于FQ-PCR操作。

2.3.2FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果

由表4可以看出，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組Bax、Bcl-2表達(dá)量分別顯著升高和降低(P<0.05)。與1組相比較，對(duì)照組、2組、3組和4組Bax表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；2組和4組Bcl-2表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)；2組、3組和4組Bcl-2/Bax均顯著增加(P<0.05)，且2組顯著高于3組、4組(P<0.05)，試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

3　討　論

3.1Gln及其二肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞凋亡率的影響

高濃度氧直接損傷瘤胃上皮細(xì)胞，促使細(xì)胞凋亡或使胃部疾病惡化。大量氧化自由基是引起細(xì)胞損傷的重要原因之一，缺血再灌注、藥物代謝、金屬中毒等會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基[17]，而H2O2作為氧化自由基的主要成分，得到廣泛的應(yīng)用[18-20]。H2O2可導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)制包括：損傷線粒體和耗竭ATP，氧化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞脂質(zhì)及引起DNA損傷，引起細(xì)胞凋亡等[21]。

PI：碘化丙啶；AV-FITC：膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素。LR：凋亡早期；UR：凋亡中期；UL：凋亡晚期/壞死；LL：正常細(xì)胞。下圖同。

PI: propidium iodide; AV-FITC： annexin V-fluorescein isothiocyanate. LR: early apoptosis; UR: middle apoptosis; UL: late apoptosis/necrosis; LL: normal cells. The same as below.

圖1　H2O2誘導(dǎo)凋亡瘤胃上皮細(xì)胞流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

圖3　部分總RNA電泳圖

項(xiàng)目Items對(duì)照組Controlgroup1組Group12組Group23組Group34組Group4SEMP值P?valueBax0．95d3．56a1．82c1．64c2．62b0．18<0．01Bcl?21．04a0．28d0．59b0．39cd0．45c0．04<0．01Bcl?2/Bax1．09a0．08d0．33b0．24c0．18c0．03<0．01

Gln及其二肽是具有特殊藥理學(xué)、無毒副作用的非必需氨基酸[22]。Gln及其二肽可為胃腸上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等分裂較快的組織細(xì)胞，提供合成氨基酸及蛋白質(zhì)所需的氮源[23-24]，為維持黏膜細(xì)胞完整性和功能穩(wěn)定性方面起重要作用[25]?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)Gln及其二肽具有減少疾病或應(yīng)激狀態(tài)下的過氧化損傷，其可能是通過減少氧化應(yīng)激下的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)抗氧化酶防御作用、熱休克蛋白的表達(dá)及誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來發(fā)揮作用[26]。Gln及其二肽在是近20年來外科研究的熱點(diǎn)，雖然在臨床中已獲得廣泛應(yīng)用[27-31]，但其對(duì)于H2O2誘導(dǎo)的山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡的影響卻鮮有報(bào)道。

減少H2O2誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞凋亡率，對(duì)減輕過氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體損傷，改善機(jī)體功能與狀態(tài)具有非常重要的意義。因此，本試驗(yàn)對(duì)于山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果說明，添加Gly-Gln可使H2O2對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷得到緩解。其機(jī)制可能是：1)具有添加量較小、吸收率較高、水溶性較高、穩(wěn)定性較好和不易產(chǎn)生有害物質(zhì)(焦谷氨酸和氨)等優(yōu)點(diǎn)的Gln替代品Gly-Gln，更有助于提高與維持山羊瘤胃上皮細(xì)胞組織中GSH的含量，具有更強(qiáng)的抗氧化、抗凋亡的作用[32-33]。2)Gly-Gln比Gln和Ala-Gln更多地抑制活性氧群的移位，由于活性氧會(huì)直接或間接誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡，因此Gly-Gln一定程度上緩解了H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡。但Gln、Ala-Gln和Gly-Gln之間對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激緩解機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2Gln及其二肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡山羊瘤胃上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax基因表達(dá)量的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家族中促凋亡(Bcl-2)和抑凋亡基因(Bax)的比率決定了線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開放程度，形成調(diào)控細(xì)胞凋亡的樞紐，因此認(rèn)為調(diào)控細(xì)胞死亡的“可變電阻器(rheostat)”是Bcl-2/Bax[34]。在內(nèi)外因素刺激下，Bcl-2和Bax2種調(diào)控因子的平衡決定細(xì)胞了生命，而Bcl-2/Bax是決定細(xì)胞凋亡發(fā)生及凋亡程度的重要因素[35]。

本試驗(yàn)從細(xì)胞凋亡角度出發(fā)，在細(xì)胞傳代培養(yǎng)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用FQ-PCR針對(duì)Gln及其二肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡山羊瘤胃上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果說明，H2O2能誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡，Gly-Gln可降低促凋亡基因Bax表達(dá)量，而抑制凋亡基因Bcl-2的增加，這與凋亡率的結(jié)果相一致。但是對(duì)于Gln、Gly-Gln和Aln-Gln影響B(tài)cl-2和Bax基因表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。可能由于Gln、Gly-Gln和Aln-Gln能增加GSH的含量[36]，或是Gln、Gly-Gln和Aln-Gln能增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減輕H2O2過氧化損傷作用[37]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Gly-Gln和Aln-Gln二肽使H2O2誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的Bcl-2基因表達(dá)顯著增加，這可能是一種機(jī)體代償性反應(yīng)。如果大量的細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)被破壞，不能維持Bcl-2蛋白結(jié)構(gòu)，機(jī)體代償性反應(yīng)不充分，而添加Gly-Gln和Aln-Gln二肽將使細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)的破壞減輕，有助于膜上Bcl-2蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，促進(jìn)代償反應(yīng)的發(fā)生。

4　結(jié)　論

Gly-Gln對(duì)H2O2引起山羊瘤胃上皮細(xì)胞早期凋亡具有一定的保護(hù)作用。

[1]田剛,陳代文,鄭萍,等.氧化應(yīng)激與仔豬健康及其營養(yǎng)調(diào)控[J].飼料工業(yè),2012,33(14):58-66.

[2]張旭,戴朝六,崔凱,等.丙氨酰-谷氨酰胺二肽保護(hù)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].消化外科,2004,3(4):261-266.

[3]黎君友,孫丹,呂藝,等.腸缺血再灌注對(duì)小腸屏障、吸收、通透和傳輸功能的影響[J].世界華人消化雜志,2004,12(2):464-466.

[5]BRUNI A,QUINTON V M,WIDOWSKI T M.The effect of feed restriction on belly nosing behaviour in weaned piglets[J].Applied Animal Behaviour Science,2008,110(1/2):203-215.

[6]方允中,楊勝,伍國耀.自由基、抗氧化劑、營養(yǎng)素與健康的關(guān)系[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào),2003,25(4):337-343.

[7]GOPING IS,GROSS A,LAVOIE J N,et al. Regulated targeting of Bax to mitochondria[J].The Journal of Cell Biology,1998,143(1):207-215.

[8]CHENG E H,WEI M C,WEILER S,et al.Bcl-2,Bcl-XLsequester BH3 danain-only molecules preventingBax-andBak-mediated mitochondrial apoptosis[J].Molecular Cell,2001,8(3):705-711.

[9]YANG J,LIU X,BHALLA K,et al.Prevention of apoptosis byBcl-2:release of cytochrome c from mitochondria blocked[J].Science,1997,275(5303):1129-1132.

[10]ZOU H,LI Y,LIU X,et al.An APAF-1 cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9[J].Journal of Biological Chemistry,1999,274(17):11549-11556.

[11]KELEKAR A,THOMPSON C B.Bcl-2-family proteins:the role of the BH3 domain in apoptosis[J].Trends in Cell Biology,1998,8(8):324-330.

[12]王海燕,曹婧然,謝穎,等.谷氨酰胺強(qiáng)化腸內(nèi)營養(yǎng)對(duì)ICU患者氧化應(yīng)激狀態(tài)影響的臨床研究[J].臨床誤診誤治,2013,26(9):97-99.

[13]趙嬌.葡萄籽原花青素緩解氧化應(yīng)激仔豬肝臟損傷及可能機(jī)制研究[D].碩士學(xué)位論文.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[14]李幼生,黎介壽.谷氨酰胺二肽的研究進(jìn)展[J].中華胃腸外科雜志,2002,5(3):232-233.

[15]鄭燕斌,董娜,單安山.谷氨酰胺二肽生物學(xué)功能及在動(dòng)物營養(yǎng)中的應(yīng)用[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2011,23(8):1264-1268.

[16]王志華,蔡金芳,汪偉,等.丙氨酰-谷氨酰胺在重度顱腦損傷治療中的應(yīng)用價(jià)值研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2011,14(3):277-279.

[17]葉煦亭,沙繼宏,湯瑩,等.生物細(xì)胞氧化應(yīng)激模型探討[J].電子顯微學(xué)報(bào),2000,19(3):207-208.

[18]蔡善榮,鄭樹,張?zhí)K展,等.過氧化氫誘導(dǎo)腸上皮干細(xì)胞DNA氧化損傷模型的建立[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2006,35(4):366-369,376.

[19]廖德榮,劉啟功,程燕子,等.血管內(nèi)皮生長因子對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制[J].中國動(dòng)脈硬化雜志,2006,14(6):483-486.

[20]鄭延松,李源,張珊紅,等.用低濃度過氧化氫建立心肌細(xì)胞氧化損傷模型[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,22(20):1849-1851.

[21]張麗,李亮,李克忠,等.谷氨酰胺抑制過氧化氫誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2007,45(11):1106-1109.

[22]葉均安,王冰心,孫紅霞,等.谷氨酰胺二肽對(duì)日本對(duì)蝦血清生化指標(biāo)、肝胰腺細(xì)胞凋亡及腸黏膜形態(tài)的影響[J].海洋與湖沼,2009,40(3):347-352.

[23]戴定威,李敏.谷氨酰胺對(duì)體外培養(yǎng)人小腸上皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用[J].氨基酸和生物資源,1997,19(3):1-3.

[24]姜俊,周小秋.谷氨酰胺對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用[J].飼料工業(yè),2004,25(2):31-33.

[25]CHOMCZYNSKI P,SACCHI N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Analytical Biochemistry,1987,162(1):156-159.

[26]曹婧然,謝穎,李輝,等.谷氨酰胺在氧化應(yīng)激疾病中的作用及其機(jī)制的研究[J].臨床誤診誤治,2013,26(9):102-104.

[27]蔡文訓(xùn),張衛(wèi)星,羅華.谷氨酰胺腸外營養(yǎng)對(duì)危重病患者的營養(yǎng)作用[J].中國基層醫(yī)藥,2006,13(6):904-906.

[28]戴定威,吳圣楣,戚秋芬,等.谷氨酰胺對(duì)缺氧復(fù)氧損傷人小腸上皮細(xì)胞谷胱甘肽的影響[J].中國病理生理雜志,1999,15(2):128-130.

[29]王軍軍,王鳳來,印遇龍,等.斷奶和谷氨酰胺對(duì)仔豬腸道氧化狀態(tài)與基因表達(dá)的影響[C]//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.廣州:中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì),2008.

[30]陳恒燦,馬黎,陳克嶙,等.丙氨酰谷氨酰胺二肽對(duì)早期斷奶仔豬抗氧化能力及腸道保護(hù)的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(2):251-259.

[31]席鵬彬,林映才,蔣宗勇,等.谷氨酰胺二肽對(duì)斷奶仔豬生長、免疫、抗氧化力和小腸黏膜形態(tài)的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2007,19(2):135-141.

[32]CAO Y H.FENG Z L,HOOS A,et al.Glutamine enhances gut glutathione production[J].Journal of Parenteral and Enteral Nutrition,1998,22(4):224-227.

[33]SUH G J,YOUN Y K,SONG H G,et al.The effect of glutamine on inducible nitric oxide synthase gene expression in intestinal ischemia-reperfusion injury[J].Nutrition Research,2003,23(1):131-140.

[34]KORSMEYER S J,SHUTTER J R,VEIS D J,et al.Bcl-2/Bax:a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death[J].Seminars in Cancer Biology,1993,4(6):327-332.

[35]王衛(wèi)東.Bcl-2/Bax比率與細(xì)胞“命運(yùn)”[J].中國腫瘤生物治療雜志,2007,14(4):393-396.

[36]劉國平,朱聞溪,楊廣順,等.谷氨酰胺對(duì)大鼠肝門阻斷后肝臟Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響及其保護(hù)作用[J].中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2008,11(4):297-300.

[37]PORTELLA A O V,MONTERO E F S,DE FIGUEIREDO L F P,et al.Effects of N-Acetylcysteine in hepatic ischemia-reperfusion injury during hemorrhagic shock[J].Transplantation Proceedings,2004,36(4):846-848.

(責(zé)任編輯王智航)

Effects of Glutamine and Its Dipeptides on Apoptosis and Apoptosis Related Gene Expressions Induced by Hydrogen Peroxide in Ruminal Epithelial Cells of Goats

HAN Qipeng1,2JIE Hongdong2LUO Ling2WANG Kaijun2ZHOU Chuanshe1*ZHANG Peihua2*KONG Zhiwei1TANG Shaoxun1

(1. Key Laboratory for Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Hunan Research Center of Livestock & Poultry Sciences, South-Central Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science of Ministry of Agriculture, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China； 2. Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

This study was conducted to investigate the effects of glutamine (Gln), glycyl-glutamine (Gly-Gln) and alanyl-glutamine (Ala-Gln) on apoptosis rate and gene expressions ofBcl-2 andBaxof apoptosis cells according to establish apoptosis models for ruminal epithelial cells of goats induced by hydrogen peroxide (H2O2). Subculture ruminal epithelium cells of 60 day-oldXiangdongblack goats were selected and cultured with different concentrations [0(control group), 100, 400 and 800 μmol/L] of H2O2, and flow cytometry (FCM) technique was used to detected cell apoptosis. Subculture ruminal epithelium cells were divided into 5 groups, control group and group 1 were cultured with 0 and 800 μmol/L H2O2, and groups 2, 3 and 4 were cultured with 800 μmol/L H2O2, meanwhile with 17.28 mmol/L Gly-Gln (group 2), 16.0 mmol/L Gln (group 3) and 16.0 mmol/L Ala-Gln (group 4). FCM technique was used to detected cell apoptosis, and gene expressions ofBcl-2 andBaxwere detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The results showed as follows: 1) compared with control group, when the concentration of H2O2reached 800 μmol/L, apoptosis rate of early apoptosis significantly increased (P<0.05); apoptosis rate of late apoptosis firstly increased and then decreased with the increasing of H2O2concentration, while compared with control group, experimental groups were all significantly increased (P<0.05). 2) Compared with control group, apoptosis rate of late apoptosis in group 4 significant increased (P<0.05), and apoptosis rate of early apoptosis in experimental groups were all significantly higher than that in control group (P<0.05). 3) Compared with control group,Bcl-2/Baxin experimental groups was significantly increased (P<0.05); compared with group 1,Bcl-2/Baxin groups 2, 3 and 4 was significantly increased (P<0.05), and group 2 was significantly higher than groups 3 and 4 (P<0.05). In conclusion, Gly-Gln plays protection role in early apoptosis induced by H2O2in ruminal epithelium cells of goats.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3301-3310]

Xiangdongblack goat; ruminal epithelium cell; apoptosis; apoptosis gene

s: ZHOU Chuanshe, professor, E-mail: zcs@isa.ac.cn； ZHANG Peihua, associate professor, E-mail: peiqin41-@163.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.034

2016-04-10

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31372342)；國家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD14B17)；中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃(STS計(jì)劃)課題(KFJ-EW-STS-071)

韓奇鵬(1988—)，男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營養(yǎng)。E-mail: 18711069677@163.com

周傳社，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: zcs@isa.ac.cn；張佩華，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: peiqin41-@163.com

S826

A

1006-267X(2016)10-3301-10