廖春華　袁　安　吳小波*　郭亞惠

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌330045; 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌330045)

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維生素B2對中華蜜蜂工蜂壽命及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

廖春華1,2袁安1*吳小波1**郭亞惠1

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌330045; 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌330045)

本試驗(yàn)旨在研究維生素B2對中華蜜蜂工蜂壽命及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。試驗(yàn)分為工蜂飼養(yǎng)試驗(yàn)和學(xué)習(xí)記憶試驗(yàn)2部分。工蜂飼養(yǎng)試驗(yàn)：將1日齡中華蜜蜂工蜂分成3組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)約200只。對照組(Ⅰ組)飼喂1∶1的糖水，2個(gè)試驗(yàn)組在1∶1糖水的基礎(chǔ)上分別添加100(Ⅱ組)、400 mg/kg(Ⅲ組)的維生素B2，每天記錄各組工蜂的死亡情況，直到全部死亡。工蜂學(xué)習(xí)記憶試驗(yàn)：分組方法同工蜂飼養(yǎng)試驗(yàn)，并按照工蜂飼養(yǎng)方法對1日齡工蜂喂養(yǎng)7 d后，利用吻伸反應(yīng)方法測定工蜂短時(shí)學(xué)習(xí)記憶及長時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力，并通過熒光定量PCR檢測學(xué)習(xí)成功后工蜂學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明：工蜂的平均壽命隨維生素B2添加量的升高而延長，而且試驗(yàn)組(Ⅱ組、Ⅲ組)的平均壽命顯著高于對照組(P<0.05)，但Ⅱ組與Ⅲ組間差異不顯著(P>0.05)。Ⅲ組工蜂的長時(shí)學(xué)習(xí)記憶及短時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力均顯著高于對照組和Ⅱ組(P<0.05)，而且Ⅱ組工蜂的長時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力也顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅲ組工蜂的多巴胺受體基因2(Acdop3)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(AcCREB)相對表達(dá)量均顯著高于對照組和Ⅱ組(P<0.05)，而且Ⅱ組工蜂的Acdop3相對表達(dá)量也顯著高于對照組(P<0.05)。由此得出，維生素B2影響中華蜜蜂工蜂的壽命及學(xué)習(xí)記憶能力，在人工飼喂蜂群時(shí)需要提供適量的維生素B2。

中華蜜蜂；維生素B2；壽命；吻伸反應(yīng)

蜜蜂作為一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，與畜禽等動(dòng)物一樣也存在營養(yǎng)需要。研究蜜蜂營養(yǎng)需要，制訂科學(xué)合理的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，不但有利于蜜蜂的生長發(fā)育，增強(qiáng)蜜蜂抗病能力，而且有利于維持蜂群最佳生產(chǎn)狀態(tài)，提高蜂產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。群勢強(qiáng)是獲取蜂產(chǎn)品高產(chǎn)的基礎(chǔ)，而強(qiáng)群意味著蜜蜂(工蜂)多。強(qiáng)群需要2個(gè)基本要素，即蜜蜂繁殖快和壽命長，達(dá)到個(gè)體的高積累[2]。因此，人工改善蜜蜂的營養(yǎng)條件，使蜜蜂的生存壽命加以延長，必然會給蜂農(nóng)帶來更高的經(jīng)濟(jì)收益。近年來，蜜蜂營養(yǎng)研究取得了階段性成果，主要包括蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期蛋白質(zhì)、維生素A、維生素C、氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)需要，為養(yǎng)蜂飼料生產(chǎn)提供了重要參考資料[3-17]。核黃素(riboflavin)又稱維生素B2，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)化為黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，參與構(gòu)成各種黃素酶的輔基，在生物氧化過程中作為遞氫體，與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝密切相關(guān)[18]，是機(jī)體組織代謝和修護(hù)的必需營養(yǎng)元素。本研究旨在分析維生素B2對中華蜜蜂(Apisceranacerana)工蜂壽命及學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為合理配制蜜蜂飼糧提供一定的理論數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的中華蜜蜂工蜂。

1.2主要試劑及器材

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1工蜂飼養(yǎng)試驗(yàn)

選取群勢相同的中華蜜蜂4群，隔王控制蜂王產(chǎn)卵。將快要出房的封蓋子放入恒溫恒濕箱(34 ℃，相對濕度75%)中羽化。將剛羽化的1日齡工蜂平均分成3組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)約200只，放入恒溫恒濕箱(34 ℃，相對濕度75%)中繼續(xù)飼養(yǎng)。其中對照組(Ⅰ組)飼喂1∶1的糖水，2個(gè)試驗(yàn)組在1∶1糖水的基礎(chǔ)上分別添加100(Ⅱ組)、400 mg/kg (Ⅲ組)的維生素B2，各組糖水現(xiàn)用現(xiàn)配。每24 h更換1次食物，保證足夠的食物。首次飼喂24 h后清除死亡的蜜蜂，之后統(tǒng)計(jì)每天死亡的蜜蜂數(shù)量并及時(shí)清除，直到蜜蜂全部死亡[14]。

1.3.2工蜂學(xué)習(xí)記憶試驗(yàn)

分組方法同工蜂飼養(yǎng)試驗(yàn)，并按照工蜂飼養(yǎng)方法對1日齡工蜂喂養(yǎng)7 d后，用干冰進(jìn)行冷凍處理并固定在U型管中，放入恒溫恒濕箱(37 ℃，相對濕度75%)中饑餓2 h。之后取出工蜂，剔除狀態(tài)不佳的蜜蜂，再進(jìn)行蜜蜂學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練與檢測。蜜蜂訓(xùn)練時(shí)，分別用含有檸檬氣味的糖水和香草氣味的鹽水對每只蜜蜂進(jìn)行正刺激和負(fù)刺激，使蜜蜂將檸檬與糖水和香草與鹽水聯(lián)系起來。每只蜜蜂每隔6 min重復(fù)訓(xùn)練1次，共3次。蜜蜂訓(xùn)練后6和24 h分別進(jìn)行短時(shí)記憶和長時(shí)記憶能力檢測。先給予負(fù)刺激，再給以正刺激，檢測蜜蜂伸吻情況，每只蜜蜂檢測3次，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[19-20]。

1.3.3工蜂記憶相關(guān)基因相對表達(dá)量的測定

1.3.3.1樣品采集

采集工蜂學(xué)習(xí)記憶試驗(yàn)中正確伸吻的蜜蜂，每組采集20只，分別裝入1.5 mL RNase-free的EP管迅速放入液氮中，用于后續(xù)檢測。

1.3.3.2總RNA的提取與cDNA的合成

每個(gè)組取4只蜜蜂，放入含液氮的坩堝中進(jìn)行研磨，研磨成粉末后轉(zhuǎn)入裝有1 mL Trizol的1.5 mL的EP管中，然后對樣品總RNA進(jìn)行提取，提取的總RNA用核酸蛋白測定儀測定OD260/280值和RNA濃度，每個(gè)組測3次，取平均值。

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為50 μL：8 μL總RNA，10 μL Buffer，8 μL dNTP Mixture，1.5 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，3 μL Oligo(dT)，1 μL RNA酶抑制劑，18.5 μL DEPC水。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：體系混勻后，42 ℃反應(yīng)60 min，75 ℃滅活5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-80 ℃。

1.3.3.3熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)及熒光定量PCR

引物設(shè)計(jì)：參照從東方蜜蜂大腦組織中克隆的多巴胺受體基因2(Acdop2，登錄號KC814691)、多巴胺受體基因3(Acdop3，登錄號KC814692)和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(AcCREB，登錄號KC814690)的mRNA序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列(表1)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因。

1.4數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)　果

2.1維生素B2對中華蜜蜂工蜂壽命的影響

試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，工蜂的平均壽命隨著維生素B2添加量的升高而增加，而且試驗(yàn)組(Ⅱ組和Ⅲ組)的平均壽命顯著高于對照組(P<0.05)，但2個(gè)試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。工蜂壽命的中位數(shù)也隨著維生素B2添加量的升高而增加。

2.2維生素B2對中華蜜蜂工蜂學(xué)習(xí)記憶能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，Ⅲ組工蜂的短時(shí)學(xué)習(xí)記憶和長時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力均顯著高于對照組和Ⅱ組(P<0.05)，而且Ⅱ組工蜂的長時(shí)記憶能力也顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3維生素B2對中華蜜蜂工蜂學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，Ⅲ組工蜂的Acdop3和AcCREB相對表達(dá)量均顯著高于對照組和Ⅱ組(P<0.05)，而且Ⅱ組的Acdop3相對表達(dá)量也顯著高于對照組(P<0.05)。2個(gè)試驗(yàn)組的Acdop2相對表達(dá)量與對照組差異不顯著(P>0.05)。

3　討　論

蜜蜂營養(yǎng)對于蜜蜂正常生長與繁殖起著重要的作用，也一直受到廣大蜂農(nóng)的關(guān)注。蜂農(nóng)經(jīng)常在飼糧中添加各種維生素，其中包括維生素B2。維生素B2是自然界分布廣泛的一種維生素，它能夠參與構(gòu)成各種黃素酶的輔基，在生物氧化過程中作為遞氫體，與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝密切相關(guān)。當(dāng)蜜蜂生命周期中缺乏維生素B2時(shí)，必然影響機(jī)體的生物氧化，使代謝發(fā)生障礙。本試驗(yàn)通過在飼糧中添加不同濃度的維生素B2來分析維生素B2對中華蜜蜂工蜂壽命及學(xué)習(xí)記憶能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂工蜂的平均壽命隨著維生素B2添加量的增加而升高，主要原因在于維生素B2參與了蜜蜂體內(nèi)的生物氧化，提高體內(nèi)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝能力，有利于蜜蜂個(gè)體的生長發(fā)育，延長蜜蜂個(gè)體的壽命，從而增加了蜜蜂的群勢，提高了蜜蜂的生產(chǎn)力。

表2　維生素B2對中華蜜蜂工蜂壽命的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in the same column with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Date columns with the same letters mean no significant difference (P>0.05), while with different letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1維生素B2對中華蜜蜂工蜂短時(shí)學(xué)習(xí)記憶(A)和長時(shí)學(xué)習(xí)記憶(B)能力的影響

Fig.1Effects of vitamin B2on short-term (A) and long-term(B) learning memory abilities of worker bees forApisceranacerana

圖2　維生素B2對中華蜜蜂工蜂學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

蜜蜂的學(xué)習(xí)記憶能力與蜜蜂出巢試飛以及采集花蜜、花粉后的歸巢能力密切相關(guān)。蜜蜂的記憶能力越強(qiáng)，其出巢后正確歸巢能力就越強(qiáng)，從而能提高獲取天然原料的能力，增加蜂產(chǎn)品的產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)：Ⅲ組工蜂的短時(shí)學(xué)習(xí)記憶和長時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力均顯著高于對照組和Ⅱ組，而且Ⅱ組工蜂的長時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力也顯著高于對照組，說明維生素B2能提高蜜蜂的學(xué)習(xí)記憶能力，而且以高濃度維生素B2的效果更好。另外，學(xué)習(xí)記憶是一種行為過程。AcCREB的主要功能是調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞間的聯(lián)系，影響神經(jīng)元的發(fā)育和再生，并參與機(jī)體內(nèi)記憶能力[22]。多巴胺是動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)控昆蟲的多種行為和生理過程，包括學(xué)習(xí)記憶等，其中，Acdop3激活后能引起腦部環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的變化，引起記憶的產(chǎn)生[23]。本研究發(fā)現(xiàn)：Ⅲ組工蜂記憶相關(guān)基因Acdop3和AcCREB的相對表達(dá)量均顯著高于對照組和Ⅱ組，而且Ⅱ組的Acdop3相對表達(dá)量也顯著高于對照組，說明維生素B2影響著蜜蜂習(xí)記憶相關(guān)基因的表達(dá)，而且飼喂高濃度維生素B2飼糧的蜜蜂的記憶相關(guān)基因的相對表達(dá)量最高，這與蜜蜂學(xué)習(xí)記憶能力結(jié)果一致，進(jìn)一步說明蜜蜂飼糧中維生素B2的濃度影響著蜜蜂學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的表達(dá)以及其學(xué)習(xí)記憶能力。另外，2個(gè)試驗(yàn)組和對照組蜜蜂的Acdop2相對表達(dá)量差異不顯著，可能是該基因的表達(dá)與蜜蜂的運(yùn)動(dòng)行為有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步研究與分析。

4　結(jié)　論

維生素B2影響中華蜜蜂工蜂的壽命及學(xué)習(xí)記憶能力，在日常飼喂蜂群時(shí)需要提供適量的維生素B2。

[1]王穎,馬蘭婷,胥保華.蜜蜂營養(yǎng)需要研究的必要性及策略[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2011,23(8):1269-1272.

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*Contributed equally

**Corresponding author, associate professor, E-mail: wuxiaobo21@163.com

(責(zé)任編輯菅景穎)

Effects of Vitamin B2on Lifespan and Learning Memory Ability of Worker Bees forApisceranacerana

LIAO Chunhua1,2YUAN An1*WU Xiaobo1**GUO Yahui1

(1. Honeybee Research Institute, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

The objective of this experiment was to explore the effects of vitamin B2on lifespan and learning memory ability of worker bees forApisceranacerana. The experiment included two parts: worker bees’ feeding and learning memory trails. Worker bees’ feeding trail: one-day-old worker bees forApisceranaceranawere distributed into 3 groups with 5 replicates in each group and about 200 bees in each replicate. The worker bees in control group (group Ⅰ) were fed a 1∶1 sweet water, and those in two experimental groups were fed 1∶1 sweet water supplemented with 100 (group Ⅱ) and 400 mg/kg vitamin B2(group Ⅲ), respectively. The death status of worker bees in each group was recorded daily until all the bees died. Worker bees’ learning memory trail: grouping method was the same as worker bees’ feeding trail, and one-day-old worker bees forApisceranaceranawere fed 7 days by the feeding method and the abilities of short-term and long-term learning memory of worker bees were tested by proboscis extension reflex (PER) method. After learning success, the relative expression levels of the learning memory related genes were tested by real time quantitative PCR method. The results showed as follows: the average lifespan of worker bees was prolonged with the increase of vitamin B2supplemental level. The average lifespan of worker bees in experimental groups (groups Ⅱ and Ⅲ) was significantly higher than that in control group (P<0.05), and there was no significant difference between the two experimental groups (P>0.05). The abilities of short-term and long-term learning memory of worker bees in group Ⅲ were significantly higher than that in control group and group Ⅱ (P<0.05), while the ability of long-term learning memory of worker bees in group Ⅱ was significantly higher than that in control group (P<0.05). Moreover, the relative expression levels of dopamine receptor gene 3 (Acdop3) and cAMP responsive element binding protein (AcCREB) in group Ⅲ were significantly higher than those in control group and group Ⅱ (P<0.05), while the relative expression level ofAcdop3 in group Ⅱ was significantly higher than that in control group (P<0.05). In conclusion, dietary vitamin B2affects the lifespan and learning memory ability of worker bees forApisceranacerana. So, the suitable amount of vitamin B2in the artificial diet of honeybee colonies should be provided.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3346-3351]

Apisceranacerana; vitamin B2; lifespan; PER

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.039

2016-03-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360587)

廖春華(1992—)，男，四川德陽人，碩士研究生，研究方向?yàn)轲B(yǎng)蜂學(xué)。E-mail: 398376812@qq.com

S816

A

1006-267X(2016)10-3346-06

*同等貢獻(xiàn)作者

**通信作者：吳小波，副教授，碩士生導(dǎo)師， E-mail: wuxiaobo21@163.com