楊小軍，方博文，丁永輝

1西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；2甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局

RP-HPLC法測定防風(fēng)通圣丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、大黃素的含量*

楊小軍1，方博文1，丁永輝2

1西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；2甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局

目的：建立RP-H PLC同時測定防風(fēng)通圣丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素含量的方法。方法：采用高效液相色譜（RP-H PLC）梯度洗脫，在不同波長下測定含量。色譜柱:Zorbax Eclipse X D B-C18鍵合硅膠色譜柱（4.6 m m×150 m m，5 μm）；柱溫為室溫；流動相為乙腈-2%磷酸水溶液，采用梯度洗脫；流速1.0m L/m i n；檢測波長分別為240 nm（梔子苷、芍藥苷），275 nm（黃芩苷、大黃素）。結(jié)果：梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素的進(jìn)樣量分別在0.056～0.56 g（r=0.999 7），0.103 5～1.029 7 g（r=0.999 2），0.207 4～3.128g（r=0.999 3），0.04～0.423g（r=0.999 6）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為99.14%，99.65%，99.03%，99.16%；RSD分別為1.08%，1.01%，0.85%，0.86%。結(jié)論：該方法簡便、快速、靈敏、精密度高、重現(xiàn)性良好、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時測定防風(fēng)通圣丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素的含量。

RP-H PLC；防風(fēng)通圣丸；梔子苷；芍藥苷；黃芩苷；大黃素；含量測定

防風(fēng)通圣丸（水丸)為收載于《中華人民共和國藥典》的成方制劑［1］，由防風(fēng)、荊芥、薄荷、麻黃、大黃、芒硝、梔子、滑石、桔梗、石膏、川芎、當(dāng)歸、白芍、黃芩、連翹、甘草、白術(shù)(炒)17味中藥材組成。其中芍藥苷、黃芩苷、梔子苷及大黃素為處方中主要有效成分。有報(bào)道［2-5］采用高效液相色譜法對防風(fēng)通圣丸(水丸)中黃芩苷和大黃素的含量測定，但同時測定其中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素含量的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用雙波長RP-H PLC法對處方中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素的含量進(jìn)行測定，為提升防風(fēng)通圣丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及含量測定的方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與試藥 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；配置真空脫氣機(jī)(G1322A)；自動進(jìn)樣器(G1329A)；真空二極管陣列檢測器(DAD，G1315B)；四元泵(G1311A)，Zorbox Eclipse XDB-C18鍵合硅膠色譜柱(4.6m m×150m m，5 μm)；Agilent 1200色譜工作站(美國Agilent公司)；AB204-S型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；AP001-0671型抽濾機(jī)；AS3120型雙頻數(shù)控超聲波清洗儀(天津奧特賽斯恩斯儀器有限公司)；DFT-200型萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；甲醇(分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；甲醇(色譜純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，公司)；乙腈(色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；磷酸(分析純，煙臺市雙雙化工有限公司)；水為超純水。梔子苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：749-8801)；芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-201333)；黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110715-201316)；大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110756-200110)；防風(fēng)通圣丸(水丸)(甘肅眾友藥業(yè)制藥有限公司，批號：90903、90904、90905，規(guī)格6g×10丸)。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的制備 取梔子苷對照品、芍藥苷對照品、黃芩苷對照品和大黃素對照品，精密稱定后，分別置于10 m L容量瓶中，加一定量甲醇(分析純)，搖勻，置超聲儀中超聲至全部溶解，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，即得含梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素對照品溶液。然后分別精確量取上述各對照品貯備液按體積1∶1混合，充分搖勻，即得含梔子苷56μg/m L，芍藥苷100μg/m L，黃芩苷106 μg/m L，大黃素49 μg/m L的對照品混合溶液，取適量混合對照品溶液，用微孔濾膜(孔徑∶0.45μm)濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用。

1.2.2 樣品溶液的制備 取防風(fēng)通圣丸約3 g，剪成小塊，精密稱定，置研缽中，以40 m L甲醇分次研磨，定量轉(zhuǎn)移至50 m L具塞容量瓶中，超聲提取1小時，取出放冷至室溫后加甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜(孔徑∶0.45 μm∶有機(jī)系)濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用。

1.2.3 陰性對照品溶液的制備 梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素分別來源于處方中梔子、芍藥、黃芩及大黃藥材，按防風(fēng)通圣丸(水丸)的處方中各藥味的比例和制備工藝，分別制備缺少梔子、缺芍藥、缺黃芩、缺大黃的陰性對照樣品，按照“1.2.2項(xiàng)”下供試品溶液配制方法制備各陰性對照樣品溶液，即得。

1.3 色譜條件 色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18鍵合硅膠色譜柱(4.6 m m×150 m m，5 μm)；柱溫：室溫；檢測波長：240 nm(梔子苷、芍藥苷)、275 nm(黃芩苷，大黃素)；流動相：乙腈(A)-2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.1 分離度考察 分離度是用來判斷物質(zhì)在色譜柱中的分離情況，常用分離度作為色譜柱分離能力的指標(biāo)，用R表示。其中R=2(tR1-tR2)/(W 1+W 2)。精密吸取上述防風(fēng)通圣丸樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，結(jié)果見表2。

表2 分離度考察結(jié)果

由表2可見，梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5，表明4種待測組分均能與雜質(zhì)完全分離，分離效果良好。

1.3.2 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取對照品混合溶液、供試品溶液、各陰性對照溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果在供試品溶液色譜圖中，有與對照品混合溶液色譜圖中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素保留時間一致的特征峰，保留時間分別為6.71、10.428、19.712、33.512分鐘。并且供試品峰之間基線較平穩(wěn)分離度好，陰性對照樣品色譜圖中相應(yīng)位置上無此特征峰，說明陰性對照樣品對檢測無干擾，結(jié)果表明本法的專屬性良好，見圖1—3。

圖1 在240 nm處的H PLC圖譜

圖2 在275 nm處的H PLC圖譜

圖3 在275 nm處的H PLC圖譜

1.3.3 拖尾因子實(shí)驗(yàn) 檢查待測峰的拖尾因子是為了保證色譜柱的分離效果和測定精度。拖尾因子是通過計(jì)算5%峰高處峰寬與峰頂點(diǎn)至前沿的距離來評價峰形的參數(shù)，用T表示。其計(jì)算公式為：T=W 0.05h/2d1。式中W 0.05h為5%峰高處的峰寬；d1為峰頂點(diǎn)至峰前沿之間的距離。

精密吸取樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10μL，結(jié)果見表3。

表3 拖尾因子計(jì)算結(jié)果

由表3可見，梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素的拖尾因子介于0.95～1.05之間，符合《中國藥典》規(guī)定，峰形良好。

1.3.4 理論板數(shù)計(jì)算 理論板數(shù)N用于評價色譜柱的效能，是色譜的柱效能參數(shù)之一。N取決于固定相的性質(zhì)(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、色譜柱柱長、流動相的種類好流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。若峰形對稱，則N可用下式表示：

式中tR表示保留時間，W h/2表示半高峰寬。

精密吸取上述混合對照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，結(jié)果見表4。

表4 理論板數(shù)計(jì)算結(jié)果

理論板數(shù)梔子苷為17 617，芍藥苷為65 145，黃芩苷為185695，大黃素為129346。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系考察 精密吸取對照品混合溶液2，4，6，8，10，15，20 μL，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以對照品進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4—7。

圖4 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 大黃峰標(biāo)準(zhǔn)曲線

進(jìn)行線性回歸得回歸方程：梔子苷：Y=2 888.0X-8.392 6，r=0.999 7，線性范圍：0.056～0.56 μg；芍藥苷：Y=836.13X-17.338，r=0.999 2，線性范圍：0.103 5～1.029 7，黃芩苷：Y=1767.7X-133.42，r=0.999 3，線性范圍：0.207 4～3.128 μg；大黃素：Y=299.1X-51.945 4，r=0.999 6，線性范圍：0.04～0.423 μg。表明梔子苷，芍藥苷、黃芩苷及大黃素的線性關(guān)系良好，見表5。

表5 梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，進(jìn)樣量10 μL，梔子苷、芍藥苷、黃芩、大黃素峰面積RSD(%)分別為1.23%、0.93%、1.02%和0.90%。表明儀器精密度良好，見表6。

表6 精密度考察結(jié)果（n=6）

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號的防風(fēng)通圣丸供試品(批號：90903)6份，每份約3g，分別精密稱定，按“1.2”項(xiàng)下的制備方法平行制備供試品溶液6份，按“1.3”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為15μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算各成分含量。

梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素的平均含量分別為0.584 2，0.755 2，5.672 0，0.628 9 m g/g，RSD分別為1.76%，2.21%，0.58%及0.91%。表明方法的重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表7。

表7 重復(fù)性考察結(jié)果（n=6）

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取配制好的同一供試品溶液(批號：90903)，室溫下放置，每2小時進(jìn)樣一次，進(jìn)樣量為15 μL，按“1.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，并記錄各時間下梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素的色譜峰面積，計(jì)算得峰面積RSD依次為1.81%、1.68%、0.58%、1.43%。表明本供試品在24小時內(nèi)基本穩(wěn)定，見表8。

表8 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批號(批號：90903)防風(fēng)通圣丸(水丸)6份，每份約3.0 g，按“1.2”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，分別精密量取上述溶液1.0 m L，置于5 m L容量瓶中，分別加入梔子苷對照品溶液(含梔子苷56 μg/m L)0.15m L、芍藥苷對照品溶液(芍藥苷100 μg/m L)0.2 m L、黃芩苷對照品溶液(黃芩苷106 μg/m L)0.4 m L、大黃素對照品溶液(大黃素49 μg/m L)0.15 m L，混合均勻，按上述含量測定項(xiàng)下的方法進(jìn)行測定，進(jìn)樣量為15 μL，記錄各色譜峰面積。按下式進(jìn)行回收率計(jì)算，結(jié)果見表9。

表9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

回收率(%)=(測得值-樣品中含量)/加入量×100%

2.6 樣品含量測定 分別取3個不同批號的防風(fēng)通圣丸(水丸)各3份，每份約3 g，精密稱定，按“1.2”項(xiàng)下樣品的制備方法平行制備各樣品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量15 μL，在240 nm、275 nm、波長處分別記錄梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素的色譜峰面積，根據(jù)線性回歸方程積計(jì)算防風(fēng)通圣丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及大黃素的含量，結(jié)果見表10。

表10 防風(fēng)通圣丸（大蜜丸）含量測定結(jié)果

其中以防風(fēng)通圣丸(水丸)(批號：90903)計(jì)算，取樣量為2.998 9 g的一組數(shù)據(jù)為例，分別計(jì)算梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素的相關(guān)數(shù)據(jù)。由于樣品待測成分濃度在其線形范圍之內(nèi)，根據(jù)樣品配置過程和梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素的線性回歸方程計(jì)算：

已知：梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素的峰面積分別為：Y=428.7，423.5，3406，1028.7。

1)批號090903樣品中15μL樣品梔子苷含量為：

X=(Y+8.3926)/2888.0 =(483.7+8.3926)/2888.0=0.1704 μg

因此樣品中所含梔子苷為：

m1=0.170 4×50/15/2.9989=0.1682m g/g 2)芍藥苷的含量為：

X=(Y+17.338)/836.13

=(423.5+17.338)/831.43=0.5302μg

因此樣品中所含芍藥苷為：

m2=0.5302×50/15/2.9989=0.5865m g/g 3)黃芩苷的含量為：

X=(Y+133.43)/1767.7

=（3406+133.43)/1767.7=2.0023μg

因此樣品中所含黃芩苷為：

m3=2.0023×50/15/2.9989=2.225m g/g

4)大黃素的含量為：

X=(Y+51.945)/2996.1

=(1028+51.945)/2996.1=0.3686 μg

因此樣品中所含大黃素為：

m4=0.3686×50/15/2.9989=0.4008m g/g

其他組的數(shù)據(jù)算法同上，計(jì)算結(jié)果見表10。

3 討論

3.1 流動相的選擇 實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在不同時間段內(nèi)，改變流動相中乙腈的含量，即隨著乙腈含量的增加，選擇性增強(qiáng)，分離效果較明顯。但是流動相中乙腈的比例過高會導(dǎo)致基線的飄移，拖尾因子的效果較明顯。由于樣品中所測成分的極性不同，因此考慮運(yùn)用梯度洗脫，在不同的時間段內(nèi)，逐漸提高乙腈的比例，使各成分先后出峰，找到最佳的有效成分分離條件。本實(shí)驗(yàn)中最終選擇了乙腈-2%磷酸水溶液作為流動相，采用梯度洗脫程序，可使梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素與其他成分離開，且分離度好，拖尾因子效果較差。

3.2 檢測波長的選擇 本實(shí)驗(yàn)中3種物質(zhì)在240 nm波長處都有吸收，梔子苷和芍藥苷有最大吸收波長，而黃芩苷和大黃素的吸收很小，幾乎測不到，故而本實(shí)驗(yàn)測定過程中選擇雙波長的檢測模式，梔子苷和芍藥苷在240 nm波長處有最大吸收波長，而黃芩苷和大黃素在275 nm波長處均有最大吸收波長，在該色譜條件下，色譜峰不拖尾，分離度好，陰性無干擾。

3.3 提取溶劑、提取方法及提取時間的選擇 提取溶劑和處理方法對防風(fēng)通圣丸(水丸)中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素的含量測定有較大影響。在選擇溶劑時用過甲醇，乙醇、甲醇和水的混合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用甲醇提取時，所測物質(zhì)的含量較高，其他成分干擾較少，所以本次實(shí)驗(yàn)制備樣品溶液時采用甲醇進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)中還考察了30、40、50、60分鐘超聲提取法，對不同提取時間下的樣品溶液分別進(jìn)樣比較發(fā)現(xiàn)，40、50分鐘超聲提取后所測的梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和大黃素的量基本相同，為了節(jié)約時間和減少雜質(zhì)的含量，選擇40分鐘作為提取時間。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：96-616.

［2］黃山君，楊琪偉，石燕紅，等.一測多評法測定白芍中芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷的含量［J］.中國中藥雜志，2011，36（6）:780-783.

［3］李姝梅，陽敬，熊磊，等.高效液相色譜法測定柴藿顆粒中黃芩苷的含量［J］.兒科藥學(xué)雜志，2012，18（3）:43-45.

［4］肖林林，溫建東，吳堅(jiān).RP-H PLC法測定小柴胡湯丸中黃芩苷的含量［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2011，5（22）:66-67.

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Contents of Jasminoidin，Peoniflorin，Baicalin and Emodin in FangFeng TongSheng Pills Determined by RP-HPLC Method

YANG Xiaojun1，F(xiàn)ANG Bowen1，DING Yonghui2
1 Chemical Engineering Institute of Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730124，China；2 Gansu Food and Drug Administration

Objective:To establish the determination methods for the contents of jasminoidin，peoniflorin，baicalin and emodin in FangFeng TongSheng pills simultaneously by RP-HPLC.Methods:The contents were determined under different wavelengths by adopting RP-HPLC as gradient elution.Chromatographic column:Zorbax E-clipse XDB-C18bonded silica gel column（4.6 mm×150 mm，5 μm）；column temperature was room temperature；mobile phase:acetonitrile-2%phosphoric acid aqueous solution，gradient elution was adopted；flow rate 1.0mL/min；detection wavelengths were 240nm（jasminoidin and peoniflorin）and 275nm（baicalin and emodin）respectively.Results:Jasminoidin，peoniflorin，baicalin and emodin were in better linear relationship when their sample sizes were between 0.056 and 0.56g（r=0.999 7），0.103 5 and 1.029 7g（r=0.999 2），0.207 4 and 3.128 g（r=0.999 3），0.04 and 0.423 g（r=0.999 6），average recovery rates were 99.14%，99.65%，99.03%and 99.16%；RSD was 1.08%，1.01%，0.85%and 0.86%respectively.Conclusion:The method，simple，rapid，sensitive，reproducible and of high precision and accurate results，could be used for content determination of jasminoidin，peoniflorin，baicalin and emodin in FangFeng TongSheng pills simultaneously.

RP-HPLC；FangFeng TongSheng pills；jasminoidin；peoniflorin；baicalin；emodin；content determination

R927

A

1004-6852（2016）09-0027-08

2016-02-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號21402153）。

楊小軍（1982—），男，碩士學(xué)位，講師。研究方向：藥物分析。