李雪俐，陽(yáng)　瑩，楊曉藝，李建光

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊　830011)

?

薄層色譜法分析苦豆子提取物中生物堿及黃酮類成分

李雪俐，陽(yáng)瑩，楊曉藝，李建光

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011)

目的建立苦豆子提取物薄層質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用硅膠薄層色譜法對(duì)苦豆子提取物中的生物堿類活性成分進(jìn)行鑒別，以甲苯-丙酮-甲醇-氨水(8∶3∶0.2∶0.5)為展開劑，顯色劑為改良碘化鉍鉀試液，白光下檢視；采用聚酰胺薄膜層析色譜法對(duì)苦豆子提取物中的黃酮類活性成分進(jìn)行鑒別，以微乳液為展開劑，先噴2-APB，后噴聚乙二醇400進(jìn)行顯色，紫外燈366 nm下檢視。結(jié)果苦豆子提取物的生物堿供試品色譜圖中，在與苦參堿、槐果堿、槐定堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同的橙色斑點(diǎn)，分離度好；黃酮供試品色譜圖中有很多斑點(diǎn)，但沒有相對(duì)應(yīng)的對(duì)照品。 結(jié)論采用薄層色譜定性鑒別苦豆子提取物的主要生物堿成分為苦參堿、槐果堿、槐定堿；由于缺乏對(duì)照品，不能確定苦豆子提取物中的黃酮類成分具體是哪些物質(zhì)。建立的薄層色譜方法簡(jiǎn)單易行，重現(xiàn)性好，為苦豆子提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

苦豆子；薄層色譜；生物堿；黃酮

苦豆子(Sophora alopecuroides L．)別名苦豆根、苦甘草等，是豆科(Leguminosae)槐屬植物苦豆子的干燥全草、根及種子，生長(zhǎng)于中亞、西亞一帶和我國(guó)西北地區(qū)荒漠較潮濕的地帶[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已發(fā)現(xiàn)苦豆子中含有生物堿、黃酮、有機(jī)酸、氨基酸和多糖等成分[2-4]，并發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、治療乙型肝炎的藥理活性[5-11]。目前，關(guān)于薄層色譜法(TLC法)分析苦豆子成分的研究主要集中在對(duì)生物堿類活性成分的鑒別[12-16]，為建立苦豆子藥材質(zhì)量控制提供了奠定基礎(chǔ)。本研究建立了硅膠薄層色譜法分析苦豆子提取物中的生物堿類活性成分和聚酰胺薄膜層析色譜法分析苦豆子提取物中的黃酮類活性成分的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器LINOMAT 5型半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(瑞士CAMAG)，REPROSTAR 3型薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG)，LINOMAT SYRINGE型 100 μL微量進(jìn)樣針(瑞士CAMAG)，T6型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，BS110S型分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，雙槽展開缸(20 cm×10 cm)，普通硅膠G板(青島海洋化工有限公司)，聚酰胺薄膜 (臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)。

1.2試藥對(duì)照品：苦參堿(南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：JZ20141218)，槐果堿(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：ZL20141128H)，槐定堿(南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：JZ20141022)，氧化苦參堿(南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：JZ20141108)，氧化槐果堿(南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：JZ20140508)，蘆丁(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707)，綠原酸(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B20782)。甲醇、氯仿、氨水、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、甲苯、丙酮、碘化鉀、次硝酸鉍、冰乙酸、鹽酸、聚乙二醇400 、2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯、乙酸乙酯、甲酸、正丁醇、十二烷基硫酸鈉、正庚烷均為分析純?？喽棺铀幉挠尚陆幬镅芯克峁?，經(jīng)新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為L(zhǎng)eguminosae槐屬植物苦豆子的干燥全草[0]。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取苦參堿、槐果堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿25 mg，分別置于25 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，制成l mg/mL對(duì)照品的溶液。取苦參堿、槐果堿、槐定堿對(duì)照品溶液適量，加甲醇制成0.3 mg/mL的生物堿混標(biāo)溶液。取蘆丁、綠原酸對(duì)照品各適量，加甲醇溶解，制成0.l mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備苦豆子藥材粗粉加入一定比例乙醇，回流提取3 次，每次1 h，合并濾液，65℃下減壓回收乙醇，濃縮物經(jīng)HPD500型大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得苦豆子提取物粉末。稱取0.2 g苦豆子提取物粉末，加10 mL甲醇超聲溶解，濾過，取濾液作為供試品溶液。稱取苦豆子藥材粉末0.5 g，加氯仿25 mL、氨水0.3 mL，超聲提取30 min，蒸干，加氯仿2 mL溶解，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.1.3顯色劑的制備改良碘化鉍鉀試液Ⅰ：取碘化鉍鉀試劑2 g，加冰乙酸20 mL，溶解后加50 mL水稀釋，即得碘化鉍鉀試液。取碘化鉍鉀試液1 mL，加0.6 mol/L鹽酸溶液2 mL，加水至10 mL，即得。改良碘化鉍鉀試液Ⅱ[17]：取次硝酸鉍試劑0.85 g，加冰乙酸10 mL與水40 mL溶解后，加碘化鉀溶液(4→10)20 mL，搖勻，即得碘化鉍鉀試液，取碘化鉍鉀試液1 mL，加0.6 mol/L鹽酸溶液2 mL，加水至10 mL，即得。碘化鉍鉀試液：(1)稱取次硝酸鉍試劑0.85 g，加冰乙酸10 mL與水40 mL加熱溶解。(2)稱取碘化鉀8 g，加水30 mL溶解。將(1)和(2)等量混合，即為原液。取原液1 mL，加冰醋酸2 mL和10 mL水，即得。鑒別黃酮類成分的顯色劑[18]：取聚乙二醇400加乙醇制成每1 mL含50 mg的聚乙二醇400乙醇溶液；取2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2-APB)加甲醇制成每1 mL含10 mg的2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯甲醇溶液。顯色時(shí)先噴2-APB，后噴聚乙二醇400。

2.2苦豆子提取物中生物堿類成分TLC條件的建立

2.2.1顯色劑的選擇選用改良碘化鉍鉀試液為顯色劑。

2.2.2展開系統(tǒng)的選擇將硅膠板放人105℃烘箱活化30 min，分別吸取對(duì)照品溶液各2 μL，苦豆子提取物供試品溶液3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以不同的展開系統(tǒng)分別展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液，晾干后白光下檢視。苦豆子提取物中未檢視到氧化苦參堿和氧化槐果堿，檢視出苦參堿、槐果堿和槐定堿。通過圖中斑點(diǎn)數(shù)目、分離度和拖尾情況確定甲苯-丙酮-甲醇-氨水=8∶3∶0.2∶0.5為最佳展開系統(tǒng)，見圖1。

2.2.3不同檢視方式的考察分別吸取生物堿混標(biāo)溶液5 μL和苦豆子提取物供試品溶液3 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇-氨水(8∶3∶0.2∶0.5)為展開系統(tǒng)，展開，取出，晾干，噴以顯色劑，晾干，分別在白光、紫外光254 nm和366 nm處檢視，見圖2。

1：苦參堿；2：槐果堿；3：槐定堿；4：氧化苦參堿；5：氧化槐果堿；6：提取物

圖1苦豆子提取物的TLC圖

2.2.4不同點(diǎn)樣量的考察分別吸取生物堿混標(biāo)溶液和苦豆子提取物供試品溶液2、3、5、6、8、10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇-氨水(8∶3∶0.2∶0.5)為展開系統(tǒng)，展開，取出，晾干，噴以顯色劑，白光下檢視。通過斑點(diǎn)顏色和分離度確定混標(biāo)溶液(每1 mL各含0.3 mg的混合對(duì)照品溶液)和供試品溶液(每1 mL含20 mg的供試品)點(diǎn)樣量分別為6 μL 和8 μL，見圖3。

圖2 不同檢視方式下苦豆子提取物TLC圖

圖3　對(duì)照品和苦豆子提取物不同點(diǎn)樣量TLC圖

2.2.5苦豆子提取物與藥材中生物堿的指征分別吸取生物堿混標(biāo)溶液6 μL，苦豆子提取物供試品溶液2 μL，苦豆子藥材供試品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇-氨水(8∶3∶0.2∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴顯色劑，晾干，白光下檢視。苦豆子提取物與藥材供試品色譜圖中，在與苦參堿、槐果堿、槐定堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上均顯相同的橙色斑點(diǎn)，見圖4，Rf值見表1。

混標(biāo)：A：槐果堿；B：苦參堿；C：槐定堿

名稱混標(biāo)提取物藥材0.330.340.340.260.270.270.24Rf值0.220.220.170.130.120.080.090.08

2.3苦豆子提取物中黃酮類成分的TLC條件建立

2.3.1苦豆子提取物中黃酮類成分的硅膠薄層色譜研究將硅膠板放入105 ℃烘箱活化30 min，吸取生物堿混標(biāo)溶液和苦豆子提取物供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=10∶1.1∶1.1∶2.6及甲苯-乙酸乙酯-甲酸=9∶7∶3展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，噴以顯色劑，在105 ℃加熱5 min，在紫外燈366 nm處檢視。未找到合適的展開系統(tǒng)，分離效果不好，無(wú)法分辨斑點(diǎn)位置，見圖5。

2.3.2苦豆子提取物中黃酮類成分的聚酰胺薄膜層析色譜研究SDS-正丁醇-正庚烷質(zhì)量比為0.27∶0.63∶0.10，攪拌溶解，混勻，放置24 h即得微乳液。吸取生物堿混標(biāo)溶液和苦豆子提取物供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一5 cm×10 cm聚酰胺薄膜上，以微乳液為展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，噴以顯色劑，先噴2-APB，后噴聚乙二醇400 ，晾干，置紫外光366 nm處檢視?？喽棺犹崛∥镏写蟾庞?0個(gè)斑點(diǎn)，分離效果和硅膠薄層相比，聚酰胺薄膜層析色譜圖各斑點(diǎn)分離較好，沒有對(duì)應(yīng)于綠原酸的斑點(diǎn),對(duì)應(yīng)于蘆丁位置的斑點(diǎn)顏色不一致,見圖6。

圖5　不同展開系統(tǒng)下苦豆子提取物的TLC圖

混標(biāo)：A：綠原酸；B：蘆丁

3　討論

本研究用硅膠薄層色譜法對(duì)苦豆子提取物中的生物堿類活性成分進(jìn)行鑒別，在硅膠薄層色譜條件考察過程中，先以文獻(xiàn)方法分別以氯仿-甲醇-氨水、乙酸乙酯-乙醇-氨水為展開系統(tǒng)，分離度都較差，后以甲苯-丙酮-甲醇-氨水(8∶3∶0.2∶0.5)為展開系統(tǒng)，所用顯色劑為2015版中國(guó)藥典所述改良碘化鉍鉀試液，白光下檢視，斑點(diǎn)清晰且分離度很好。對(duì)青島海洋化工廠分廠和安徽良臣硅源材料有限公司生產(chǎn)的硅膠板進(jìn)行比較，安徽良臣生產(chǎn)的硅膠板鋪板較均勻，分離效果較好?？喽棺犹崛∥锱c藥材中，除了槐果堿、苦參堿、槐定堿之外，還含有其他未知生物堿成分，提取物中所含生物堿，藥材中均有，說明來(lái)源正確，苦豆子藥材經(jīng)提取后，苦參堿和槐果堿成分得到濃縮，含量增加。建立硅膠薄層色譜法分析苦豆子提取物中的黃酮類活性成分，分別以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水、冰醋酸-水-正丁醇、甲苯-乙酸乙酯-甲酸為展開系統(tǒng)，但斑點(diǎn)模糊，分離度較差，后采用聚酰胺薄膜層析色譜法，微乳液中加入甲酸，供試品斑點(diǎn)模糊，無(wú)法分辨斑點(diǎn)位置，最后選擇以微乳液(SDS-正丁醇-正庚烷質(zhì)量比為0.27∶0.63∶0.10)為展開劑進(jìn)行分離，分離度較好?？喽棺犹崛∥镏兴S酮類成分的種類較多，以蘆丁計(jì)，測(cè)得苦豆子提取物中總黃酮量為9.91%，但由于缺乏對(duì)照品，不能確定具體是哪些物質(zhì)，所以利用綠原酸和蘆丁來(lái)確定苦豆子提取物中斑點(diǎn)的相對(duì)位置。

[1]新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)[M]．烏魯木齊：新疆人民衛(wèi)生出版社,2010:84-90．

[2]劉靜，羅維林.苦豆子生物堿現(xiàn)代藥學(xué)研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2014,26(9):1-4.

[3]Attaur R,Miqbal C,Khalid P,et a1.Quinolizidine alkaloids from sophora alopecuroides[J].J Nat Prod,2000,63(3):190-192.

[4]高興軍,王世華.超臨界二氧化碳萃取苦豆子中生物堿的研究[J].中國(guó)科技成果,2011,11(1):28-30.

[5]李生虎,李勇,張永康.苦豆子生物堿的抗炎、鎮(zhèn)痛活性試驗(yàn)探索[J].黑龍江科技信息,2015,18(11)：47-49.

[6]牛彩琴，買文麗，張團(tuán)笑．苦豆子總堿對(duì)家兔離體肺動(dòng)脈血管作用機(jī)制的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,20(11)：2910-2911.

[7]李圓,周雪華,劉亭彥,等.苦參堿對(duì)喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2侵襲轉(zhuǎn)移的影響[J]．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2012,8(3):261-264.

[8]何娜娜,陸明,呂書勤,等.苦豆子提取物對(duì)裸鼠腸癌皮下移植瘤的抑制作用[J].新疆中醫(yī)藥,2012,30(6):31-33.

[9]欒迎春,王兵,張秀麗.苦豆子提取物體外抗腫瘤及抗紫外線輻射作用的研究[J].中外健康文摘,2012,9(1):218-220.

[10]劉軍鋒,丁澤,歐陽(yáng)艷,等.苦豆子生物堿抗菌活性的測(cè)定[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào),2011,38(2):84-86．

[11]史偉,陳志國(guó).苦豆子的開發(fā)與利用[J].草業(yè)與畜牧,2007,27(1):57-59.

[12]周星辰,李鵬,顧沛雯,等.TLC和HPLC法同時(shí)測(cè)定苦豆子總堿中槐定堿和苦參堿的體系優(yōu)化[J].北方園藝,2014,37(18):41-43.

[13]毛艷,賀金華,黃華,等.苦豆子片定性定量方法研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(20):81-83.

[14]辛任升,劉宇,梁劍平,等.苦豆子灌注劑質(zhì)量的檢測(cè)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(5):55-58.

[15]木艾塔爾·努爾麥麥提,李敏,熱娜·卡斯木,等.新疆苦豆子藥材質(zhì)量控制研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(5):588-593.

[16]武靜蓮,姜林芬,吳紅梅,等.紫歸子?jì)D炎康泡騰栓薄層鑒別分析[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2015,33(17):100-101.

[17]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(四部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:322.

[18]Wagner H,Bladt S.Plant Drug Analysis:A thinlayerchromatography Atlas[D].Springer:University of Munich,1996.

(本文編輯施洋)

Determination of alkaloids and flavonoids in the extract of Sophora alopecuroides by TLC

LI Xueli，YANG Ying，YANG Xiaoyi，LI Jianguang

(College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)

ObjectiveTo establish the quality standard of the extract of Sophora alopecuroides by TLC.MethodsUsed silica gel thin layer chromatography for the identification of alkaloids in the extract of Sophora alopecuroides,took Toluene-acetone-methanol-ammonia (8∶3∶0.2∶0.5) as the agent,and modified bismuth potassium iodide solution as chromogenic agent,then observed under the white light.And the flavonoids in the extract of Sophora alopecuroides were identified by polyamide thin film chromatography,With microemulsion as the agent,firstly sprayed 2-APB,then sprayed polyethylene glycol 400 for color rendering,and observed under the UV-366nm.ResultsThe Alkaloids of Sophora alopecuroides extract samples in the chromatogram show the same orange spots corresponding to the positions of control samples of matrine,sophocarpine and sophoridine,which indicates better degree of separation for them,however there are many spots in the chromatogram of flavonoids,which are no corresponding controls.ConclusionFrom the above,a thin layer chromatography method was better to use for identifying the alkaloids and flavonoids in the extract of Sophora alopecuroides,and the main alkaloids are matrine,sophocarpine and sophoridine; but due to lack of corresponding controls,the specific substances of the flavonoids of Sophora alopecuroides extract can not be determined.The TLC method is easy to operate with good reproducibility,which provided the basis for the quality standard of the extract of Sophora alopecuroides.

Sophora alopecuroides; TLC; Alkaloids; Flavonoids

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(201491187)

李雪俐(1993-),女,在讀碩士,研究方向:藥物分析。

李建光,男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向：藥物分析，E-mail：L77117@163.com。

R914

A

1009-5551(2016)11-1440-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.023

2016-09-18]