高　晨，朱連勤，朱風(fēng)華，王學(xué)鑫，張　婷，張　靜

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.德州學(xué)院農(nóng)學(xué)系，山東 德州 253023）

不同銅源對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)銅-ATP酶二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1和金屬硫蛋白含量的影響

高晨1，2，朱連勤1，朱風(fēng)華1，王學(xué)鑫1，張婷1，張靜1

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.德州學(xué)院農(nóng)學(xué)系，山東 德州 253023）

利用Caco-2細(xì)胞模型研究不同濃度硫酸銅，微米氧化銅，納米氧化銅（銅水平2、4、8、16 mg/L）對(duì)細(xì)胞銅-ATP酶、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）、金屬硫蛋白（metallothionein，MT）含量的影響。結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中添加銅離子能提高Caco-2細(xì)胞銅-ATP酶、MT含量，低濃度銅離子能提高細(xì)胞DMT1含量，高濃度銅離子降低細(xì)胞DMT1含量。納米氧化銅對(duì)幾種銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用與硫酸銅類似，但納米氧化銅對(duì)銅-ATP酶、MT、DMT1含量的影響更加明顯。

納米氧化銅；Caco-2細(xì)胞；銅-ATP酶；金屬硫蛋白；二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1

銅作為機(jī)體必需的微量元素之一。目前飼料中常用的銅源有硫酸銅和氧化銅等，但傳統(tǒng)銅源存在吸收率低、污染環(huán)境等缺點(diǎn)。隨著納米科技的興起，納米微量元素添加劑步入人們視野，有研究表明，飼料中添加納米氧化銅效果優(yōu)于硫酸銅和氧化銅，其生物學(xué)作用強(qiáng)，生物利用率高［1-3］。然而，納米氧化銅在動(dòng)物體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制并不清楚，仍需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)以Caco-2細(xì)胞為模型，研究不同銅源對(duì)銅-ATP酶、金屬硫蛋白（metallothionein，MT）、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）的影響，探討納米氧化銅在吸收轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)的特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究和開發(fā)納米氧化銅提供參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)將Caco-2細(xì)胞按1×105/mL的濃度接種于6孔板中，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)20 d后，換入含有不同銅源的DMEM培養(yǎng)液（3 mL/孔）。設(shè)12個(gè)試驗(yàn)組，硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅3種銅源分別設(shè)4個(gè)組（銅水平2、4、8、16 mg/L）；對(duì)照組加培養(yǎng)液3 mL/孔；每組6個(gè)重復(fù)。繼續(xù)作用24 h后，收集細(xì)胞檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.3檢測指標(biāo)與方法采用BCA法檢測Caco-2細(xì)胞蛋白含量。利用銅-ATP酶測試盒、金屬硫蛋白測試盒、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體測試盒檢測Caco-2細(xì)胞中銅-ATP酶、MT、DMT1含量。

1.4數(shù)據(jù)分析利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)處理應(yīng)用單因素方差分析和LSD多重比較。數(shù)據(jù)均采用-X±SD表示。

2　結(jié)果

2.1不同銅源對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)銅-ATP酶活性的影響結(jié)果顯示，培養(yǎng)液銅水平為2、4 mg/L時(shí)，添加納米氧化銅組的銅-ATP酶活性高于硫酸銅和微米氧化銅組（P＜0.05）。培養(yǎng)液銅水平為8 mg/L時(shí)，添加硫酸銅組的銅-ATP酶活性高于納米氧化銅組（P＜0.05）。硫酸銅和納米氧化銅對(duì)Caco-2細(xì)胞銅-ATP酶活性的影響均呈現(xiàn)隨著銅濃度升高先上升后下降趨勢（P＜0.05）。見表1。

表1　不同銅源對(duì)Caco-2細(xì)胞銅-ATP酶活性的影響（μmolPi/mgprot/hour）

2.2不同銅源對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)MT含量的影響

結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中添加同等銅水平時(shí)，納米氧化銅組Caco-2細(xì)胞MT含量高于硫酸銅組和微米氧化銅組（P＜0.05）。納米氧化銅和硫酸銅對(duì)Caco-2細(xì)胞MT含量的影響均呈現(xiàn)隨培養(yǎng)液銅濃度的升高而升高（P＜0.05）。見表2。

表2　不同銅源對(duì)Caco-2細(xì)胞MT含量的影響（μg/gprot）

2.3不同銅源對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)DMT1含量的影響結(jié)果顯示，培養(yǎng)液銅水平為2 mg/L時(shí)，添加硫酸銅Caco-2細(xì)胞DMT1含量高于納米氧化銅和微米氧化銅（P＜0.05）。銅水平為4 mg/L時(shí)，添加硫酸銅和微米氧化銅Caco-2細(xì)胞DMT1含量高于納米氧化銅（P＜0.05）。銅水平為8、16 mg/L時(shí)，添加微米氧化銅Caco-2細(xì)胞DMT1含量高于硫酸銅和納米氧化銅（P＜0.05）。納米氧化銅和硫酸銅對(duì)Caco-2細(xì)胞DMT1含量的影響均呈現(xiàn)隨銅濃度的升高而下降（P＜0.05）。見表3。

3　討論

銅-ATP酶存在于細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等亞細(xì)胞器中，在調(diào)節(jié)細(xì)胞Cu吸收和平衡方面有重要作用［4］。Xie等報(bào)道，添加銅能明顯提高大鼠腸上皮細(xì)胞中銅-ATP酶（ATP7A）活性［5］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加低濃度納米氧化銅能提高Caco-2細(xì)胞中銅-ATP酶活性，但當(dāng)添加高濃度納米氧化銅時(shí)，銅-ATP酶的活性又回落至正常水平，甚至略有下降?？赡苁怯捎诩?xì)胞在短時(shí)間內(nèi)積聚大量的銅，進(jìn)而細(xì)胞通過負(fù)反饋調(diào)控進(jìn)入細(xì)胞中的銅離子量，是細(xì)胞避免銅中毒的一種保護(hù)性反應(yīng)。硫酸銅對(duì)銅-ATP酶活性的影響與納米氧化銅相似。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，納米氧化銅對(duì)銅-ATP酶活性的影響要強(qiáng)于相同濃度的硫酸銅，可能是納米氧化銅以銅離子和納米粒子兩種形式進(jìn)入細(xì)胞，通過兩種途徑對(duì)細(xì)胞銅-ATP酶活性產(chǎn)生影響。添加微米氧化銅后對(duì)銅-ATP酶活性沒有影響。MT是一類與金屬元素具有高度親和力且能被其誘導(dǎo)的功能特異的蛋白質(zhì)。銅與MT結(jié)合成Cu-MT，保持細(xì)胞內(nèi)銅濃度相對(duì)穩(wěn)定，有效地減低銅的細(xì)胞毒性。Darwish等報(bào)道，大鼠肝臟細(xì)胞中的MT mRNA的表達(dá)水平與銅濃度呈正相關(guān)［6］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)液中納米氧化銅水平的升高，Caco-2細(xì)胞MT mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高［7］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨培養(yǎng)液中銅離子濃度增加，Caco-2細(xì)胞中MT的含量顯著增高，納米氧化銅對(duì)細(xì)胞中MT含量影響與硫酸銅類似，但是同等濃度的納米氧化銅比硫酸銅更能促進(jìn)MT的生成。DMT1在腸中主要分布于十二指腸絨毛刷狀緣等處，DMT1除了攝取Fe2+外，也能對(duì)銅離子進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)［8］。Jiang等對(duì)小鼠HEK-293細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞銅轉(zhuǎn)運(yùn)量增加，DMT1 mRNA的表達(dá)受到抑制［9］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)液中納米氧化銅濃度的增加，細(xì)胞DMT1的生成受到抑制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)同等濃度下納米氧化銅對(duì)DMT1的抑制作用要強(qiáng)于硫酸銅，可能是由于納米氧化銅以銅離子和納米粒子2種形式進(jìn)入細(xì)胞為細(xì)胞提供了更多的銅，進(jìn)而抑制DMT1的生成。

表3　不同銅源對(duì)Caco-2細(xì)胞DMT1含量的影響（μg/gprot）

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米氧化銅對(duì)幾種銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用與微米氧化銅有較大差異，反而與硫酸銅類似，說明納米氧化銅在培養(yǎng)液中部分以銅離子形態(tài)存在。但納米氧化銅對(duì)銅-ATP酶、MT、DMT1含量的影響更明顯，因?yàn)榧{米氧化銅除了以銅離子形式進(jìn)入細(xì)胞外，還以納米粒子形式直接進(jìn)入細(xì)胞，通過2種途徑來對(duì)細(xì)胞的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白產(chǎn)生影響。

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Effects of different sources of copper on copper-ATPase，divalent metal transporter content 1，metallothionein in Caco-2 cells

GAO Chen1，2，ZHU Lian-qin1，ZHU Feng-hua1，WANG Xue-xin1，ZHANG Ting1，ZHANG Jing1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Department of Agronomy，Dezhou University，Dezhou 253023，China）

In this study，we investigated the effects of different concentrations of CuSO4，micron-CuO，nano-CuO（copper levels 2，4，8，16 mg/L）on cell copper-ATPase，DMT1，MT content in Caco-2 cell.The results showed that the culture medium supplemented with copper ions improve the copper-ATPase，and MT content in Caco-2 cells.Low concentrations of copper ions improved DMT1 content and high concentrations of copper ions reduced DMT1 content in Caco-2 cells.Effect of nano-CuO on several copper transporters was similar to CuSO4，but the impact of nano-CuO to copper-ATPase，MT，DMT1 content was more obvious.

Nano-CuO；Caco-2 cell；copper-ATPase；MT；DMT1

ZHU Lian-qin

S852.3

A

0529-6005（2016）04-0049-02

2014-11-26

國家自然科學(xué)基金科學(xué)部主任基金項(xiàng)目（311400-76）；青島市科技計(jì)劃基礎(chǔ)項(xiàng)目［12-1-4-5-（5）-jch］

高晨（1979-），男，講師，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營養(yǎng)代謝病與中毒病，E-mail：gaochen1127@126.com

朱連勤，E-mail：lqzhu@qau.edu.cn