任穎超，黃　娟，單　虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省高校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，山東 青島266109）

PRRSV變異株ORF5全基因的可溶性表達與重組蛋白的純化

任穎超，黃娟，單虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省高校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，山東 青島266109）

為了獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）變異株可溶性糖基化囊膜蛋白（GP5），從pMD18-T-ORF5（V）重組質(zhì)粒中PCR擴增得到PRRSV變異株LX13（1）結(jié)構(gòu)蛋白ORF5全基因編碼區(qū)，并克隆至原核表達載體pCold TF DNA上，得到重組表達質(zhì)粒pCold-TF-GP5（V），轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21中誘導(dǎo)表達，并通過SDS-PAGE和Western Blot鑒定分析。結(jié)果表明，目的基因插入位置和閱讀框正確，成功表達的融合蛋白分子量約為75.2 ku，并以可溶性蛋白的形式存在，表達量約占菌體總蛋白含量的22.26%。該融合蛋白能與鼠抗His標簽單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，說明重組蛋白具有反應(yīng)原性。該可溶性重組蛋白的獲得為研究PRRSV變異株GP5蛋白的抗原性奠定了基礎(chǔ)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；變異株；ORF5基因；可溶性原核表達

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）可引起妊娠母豬繁殖障礙、仔豬的呼吸道癥狀甚至死亡。該病在1987年首發(fā)于美國，并很快蔓延至世界各地。郭寶清等于1996年在國內(nèi)首次分離到該病毒。之后，隨著PRRSV的遺傳和變異，我國在2006年暴發(fā)了以仔豬高死亡率為特征的高致病性藍耳病［1］，使我國養(yǎng)豬業(yè)受到重創(chuàng)。

PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5是由ORF5編碼的糖基化囊膜蛋白，變異性較強，具有誘導(dǎo)細胞凋亡的活性，并可能參與病毒入侵宿主細胞的過程［2］。GP5蛋白被認為是PRRSV免疫保護的主要蛋白［3］。高致病性PRRSV變異株和經(jīng)典株在GP5蛋白基因上發(fā)生較大的變異，其核苷酸變異性在5%以上［4］，這種變異對其抗原性的影響還未見報道。

本研究采用一種高效原核表達載體pCold TF DNA獲得高致病性PRRSV變異株重組GP5表達質(zhì)粒，在E.coli BL21中獲得可溶性表達產(chǎn)物，并對表達的重組融合蛋白進行定性分析，為進一步比較高致病性PRRSV變異株和經(jīng)典株GP5蛋白抗原性差異奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與載體大腸埃希菌（E.coli）DH5α和BL21、質(zhì)粒pCold TF DNA，購自TaKaRa公司，含PRRSV變異株LX13（1）株ORF5基因的質(zhì)粒pMDl8-T-ORF5（V）由筆者構(gòu)建、保存。

1.1.2試劑限制性內(nèi)切酶（EcoR I、Kpn I），T4 DNA連接酶，HRP標記的抗His標簽鼠單抗，購自北京康為世紀生物科技有限公司；His Trap HP親和層析柱，購自GE Healthcare公司。

1.2方法

1.2.1重組原核表達載體pCold-TF-GP5（V）的構(gòu)建及鑒定根據(jù)LX13（1）核苷酸序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計一對特異性引物，P1：5′-GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3′；P2：5′-GGAATTCCTAGAGACGACCCCATAG-3′，劃線部分為EcoR I和Kpn I酶切位點。以pMDl8-T-ORF5（V）為模板進行PCR擴增，EcoR I和Kpn I雙酶切PCR產(chǎn)物純化后，連接至pCold TF DNA，并轉(zhuǎn)化DH5α。鑒定后的陽性質(zhì)粒由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.2TF-GP5（V）蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析將pCold-TF-GP5（V）轉(zhuǎn)化BL21菌后，按1∶100比例接種于含有50 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩，當(dāng)培養(yǎng)液的D600nm值為0.4～0.5時，移至15℃放置30 min。添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，15℃條件下培養(yǎng)24 h。誘導(dǎo)菌體、誘導(dǎo)菌體超聲波破碎后的上清和沉淀分別取樣進行SDS-PAGE電泳。

1.2.3TF-GP5（V）蛋白的純化及Western Blot鑒定將誘導(dǎo)的菌體經(jīng)超聲波破碎后離心，取上清經(jīng)鎳柱純化。將表達產(chǎn)物濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA中過夜封閉；使用HRP標記的抗His標簽鼠單抗孵育后，置于DAB底物顯色液中顯色。

2　結(jié)果與分析

2.1重組原核表達載體pCold-TF-GP5（V）的構(gòu)建及鑒定擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)與預(yù)期片段大?。?18 bp）一致的條帶（圖1）。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I、Kpn I雙酶切，在5 769 bp（pCold TF DNA載體片段）和618 bp（目的片段）處出現(xiàn)條帶；以重組質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定得到618 bp左右的片段（圖2），均與預(yù)期相符。將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pCold-TF-GP5（V）。

2.2TF-GP5（V）蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

圖1　PCR擴增ORF5基因

圖2　重組質(zhì)粒pCold-TF-GP5（V）的鑒定

pCold-TF-GP5（V）重組轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG于15℃誘導(dǎo)24 h后，在75.2 ku附近出現(xiàn)一蛋白條帶，與預(yù)期大小一致。經(jīng)超聲波破碎后發(fā)現(xiàn)，重組蛋白主要存在上清中，沉淀中幾乎沒有，為可溶性表達。而空載體pCold TF DNA轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)可表達52 ku的TF蛋白（圖3）。

圖3　SDS-PAGE鑒定目的蛋白的表達

2.3TF-GP5（V）蛋白的純化及Western Blot分析

經(jīng)純化獲得較純的75.2 ku重組蛋白（圖4）。Western Blot結(jié)果顯示，融合蛋白在75.2 ku大小附近出現(xiàn)一條清晰的反應(yīng)條帶（圖5），表明融合蛋白能與抗His標簽鼠單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。

圖4　重組蛋白的純化

圖5　Western Blot鑒定GP5融合蛋白的反應(yīng)原性

3　討論

在我國PRRSV尤其是高致病性PRRSV變異株始終是嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)的最重要病原之一。免疫接種是目前防制PRRS的主要措施，但PRRS滅活疫苗保護率低，活疫苗不能免疫妊娠母豬和種豬，不利于該病的徹底防制［5］。PRRSV的高變異性也給疫苗免疫帶來新的挑戰(zhàn)。GP5蛋白是PRRSV的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一，能起到參與體液免疫和細胞免疫的作用，并具有較高的免疫原性和中和活性，是研究PRRSV免疫保護的熱點蛋白［6］。因此，研究PRRSV高致病性變異株和經(jīng)典株GP5蛋白基因的變異性和蛋白的抗原性在疫苗制備中意義重大。

GP5蛋白是糖基化的囊膜蛋白，含有高度保守的N-糖基化位點和高疏水區(qū)的信號肽序列，因而在大腸埃希菌等表達系統(tǒng)中表達一直不夠理想，很難表達出完整的GP5蛋白［7］。以往的研究中，多通過去除基因N端的信號肽序列或跨膜區(qū)或通過密碼子優(yōu)化等手段以期獲得GP5蛋白的表達，盡管有些能獲得高效表達，但也多以包涵體形式存在［8-9］。后期還需蛋白質(zhì)復(fù)性才能獲得可溶性蛋白，而復(fù)性過程十分復(fù)雜，且效率往往與特定蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，選擇何種方法也需要反復(fù)試驗，操作繁瑣［10］。

pCold TF DNA帶有cspA（冷休克蛋白A）啟動子及相關(guān)元件，使得菌體在低溫15℃環(huán)境下培養(yǎng)時，目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量得到了提高，此外，由于pCold TF DNA帶有可溶性標簽Trigger Factor（TF），能提高目的蛋白質(zhì)的可溶性［11］。因此，本研究選用pCold TF DNA來表達融合蛋白，SDS-PAGE和Western Blot分析表明，在大腸桿菌BL21中完整的PRRSV GP5蛋白獲得了高效可溶性表達，且具有良好的反應(yīng)原性。為下一步研究PRRSV高致病性變異株GP5蛋白的免疫原性及與經(jīng)典株GP5蛋白的交叉反應(yīng)性奠定基礎(chǔ)。

［1］童光志，周艷君，郝曉芳，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2007，29（5）：323-326.

［2］Delputte P L，Vanderheijden N，Nauwynck H J，et al.Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages［J］.J Virol，2002，76（9）：4312-4320.

［3］Zheng Q S，Chen D S，Li P，et al.Co-expressing GP5 and M proteins under different promoters in recombinant modified vaccinia virus Ankara（rMVA）-based vaccine vector enhanced the humoral and cellular immune responses of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）［J］.Virus Genes，2007，35：585-595.

［4］安同慶，田志軍，肖燕，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株主要囊膜糖蛋白GP5的遺傳變異分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008，30（11）：851-855.

［5］冷超糧.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白B表位誘導(dǎo)中和抗體能力的研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33（4）：297-300.

［6］李欣賢，張曉丹，劉晶晶，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒糖基化囊膜蛋白5原核表達載體的構(gòu)建及免疫原性分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（4）：89-94.

［7］尹國友，孫婕，黃保續(xù).豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因的克隆與原核表達［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2009，30（12）：63-66.

［8］劉岳，肖一紅，崔然，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白分段表達及其生物學(xué)功能的鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33（4）：257-260.

［9］孫文超，任靜強，溫樹波，等.應(yīng)用不同表達載體表達歐洲型PRRSV ORF5蛋白的研究［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2013，8（11）：961-965.

［10］谷紅，楊漢春，郭鑫，等.PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表達與重組蛋白的純化［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2004，35（1）：64-69.

［11］楊李，周鷹，王運剛，等.粉塵螨變應(yīng)原第1組分原核表達質(zhì)粒pCold-TF-Derf1構(gòu)建及鑒定［J］.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2012，23（4）：289-291.

SolubleProkaryotic Expression of ORF5 Geneof PRRSV Variant and Purification of Recombinant Protein

REN Ying-chao，HUANG Juan，SHAN Hu
（Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Universities of Shandong，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

The coding region of ORF5 gene from PRRSV variant was successfully amplified from pMD18-T-ORF5（V）by PCR，and was cloned into the prokaryotic expression vector pCold TF.The recombinant plasmid pCold-TF-GP5（V）was transformed into E.coli BL21 and the induced protein was confired by SDS-PAGE and Western blot.The results showed the target gene was inserted into the exact location and the reading frame was correct.An 75.2 ku soluble protein was successfully induced with a content of 22.26%of total bacterial protein.The recombinant protein showed good reaction with the His-tag monoclonal antibody. Our results contribute to the antigenicity study of glycosylated envelope protein 5（GP5）from PRRSV variant.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）；Variant；ORF5 gene；Soluble prokaryotic expression

HUANG Juan

S852.65+1

A

0529-6005（2016）04-0030-03

2014-11-28

國家科技基礎(chǔ)性工作專項（2012FY111000）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊建設(shè)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金（6630719）

任穎超（1989-），女，碩士，研究方向為獸醫(yī)傳染病學(xué)與生物制品，E-mail：sdzbryc@163.com

，黃娟，E-mail：happyhj888@163.com