馬士博，譚　飛，姜艷平，喬薪瑗，崔　文，唐麗杰，劉　敏，李一經(jīng)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

豬輪狀病毒HeBei-12株在MA-104細胞上最適繁殖時間的摸索

馬士博，譚飛，姜艷平，喬薪瑗，崔文，唐麗杰，劉敏，李一經(jīng)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

本試驗將HeBei-12株豬輪狀病毒在MA-104細胞上培養(yǎng)，通過對病毒的細胞培養(yǎng)物進行核酸提取及RT-PCR檢測證明，該病毒可以很好的適應(yīng)細胞。為獲得最佳的病毒培養(yǎng)量，本試驗分別從間接免疫熒光，增殖動力學(xué)曲線以及病毒感染細胞后的超薄切片電鏡對病毒的繁殖周期做了初步研究。結(jié)果表明，HeBei-12株豬輪狀病毒在感染MA-104細胞時，病毒粒子是隨著時間的變化而變化的，當病毒接種20 h時即可在細胞質(zhì)中觀察到病毒粒子。當病毒感染細胞64 h時，滴度達到最大值4.8 logTCID50/mL，此后滴度逐漸下降。本試驗對豬輪狀病毒地方流行株HeBei-12株在MA-104細胞上的最佳繁殖時間進行摸索，為進一步研究其生物學(xué)特性和疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

豬輪狀病毒HeBei-12株；繁殖時間；恒河猴胎腎細胞

輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus），是導(dǎo)致動物腹瀉的重要病原之一，給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。其發(fā)生不受衛(wèi)生狀況影響，由于目前尚無特效藥物治療，疫苗接種仍是最有力的預(yù)防和控制措施。因此選擇理想毒株以及摸索最佳病毒繁殖量在研制豬輪狀病毒疫苗是至關(guān)重要的。本研究從不同角度分析了HeBei-12株豬輪狀病毒在MA-104細胞上的繁殖趨勢，以期為進一步研究其生物學(xué)特性和疫苗的研發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1病料及細胞豬腹瀉病料（2012年采自河北省某豬場）經(jīng)本實驗室檢驗為豬輪狀病毒陽性，命名為HeBei-12株，于-80℃冷藏備用。JL-94株輪狀病毒為本實驗室保存。MA-104細胞（恒河猴胎腎傳代細胞）為本實驗室保存。

1.2主要試劑DMEM、胎牛血清為HyClone公司產(chǎn)品；小量病毒RNA抽提試劑盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0），購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；FITC標記的山羊抗鼠IgG，購自Sigma公司；豬輪狀病毒陽性血清為本實驗室制備。

1.3引物設(shè)計與合成參考GenBank中porcine RV（L29186.1）參考株基因序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計合成特異性套式PCR引物，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列參見表1。

表1　套式PCR引物序列

1.4方法

1.4.1病料處理及細胞接種將糞便樣品移入EP管中，經(jīng)研磨器充分研磨后，按1∶1比例加入PBS緩沖溶液，將樣品懸起，反復(fù)凍融3次，4 000 r/min（4℃）離心15 min，收集上清。經(jīng)RT-PCR檢測為輪狀病毒陽性且不混合感染其他腹瀉病毒。將腹瀉病料用無血清的DMEM進行1∶10稀釋，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心8 min，取上清用0.22 μm濾器過濾后，接種于MA-104細胞，用含10%FBS（新生牛血清）的DMEM培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。病毒接種前，用30 μg/mL胰酶在37℃處理60 min，待細胞長成致密單層后，按0.05 MOI接種HeBei-12株病毒，待CPE達90%時收獲病毒液，按此方法將病毒連續(xù)傳代，觀察細胞病變［1］。

1.4.2RT-PCR檢測取病毒在MA-104上得第8代細胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心5 min，取上清5 000 r/min離心15 min。采用小量病毒RNA抽提試劑盒提取病毒基因組RNA，然后在42℃條件下反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用針對流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒及輪狀病毒的引物對其進行nest-PCR檢測［2］。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)30個，72℃終延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。所得的PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.4.3間接免疫熒光檢測取第8代輪狀病毒核酸陽性的細胞培養(yǎng)物接種于長滿單層的MA-104細胞，分別在第36、54、70 h和100 h時用甲醇固定（4℃，10 min），Triton X-100作用10 min，3% BSA 37℃封閉30 min，依次加入鼠抗輪狀病毒JL-94株全病毒多克隆抗體（1∶200稀釋）和FITC標記的山羊抗鼠IgG（1∶2 000稀釋），分別于37℃條件下作用60 min，PBS清洗后分別在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察結(jié)果［3］。

1.4.4增殖動力學(xué)曲線的繪制取第8代輪狀病毒核酸陽性的細胞培養(yǎng)物接種于長滿單層的MA-104細胞，每10 h測其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50），比較病毒滴度的變化情況，具體方法如下：將10倍系列稀釋的病毒接種于長成單層細胞的96孔板中，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)，并設(shè)細胞對照和未稀釋病毒對照。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)5 d，每天觀察細胞病變。按Reed-Muench公式計算病毒的感染性滴度［4］。

1.4.5電鏡檢測將HeBei-12株輪狀病毒接種于長滿單層的MA-104細胞，每10 h取病毒的細胞培養(yǎng)物（90 mL），離心后用1 mL DMEM懸起。4%戊二醛前固定，再用1%OsO4后固定，丙酮逐級脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，烘干10 d左右，對樣品進行超薄切片后正染色，最后置于透射電子顯微鏡下觀察［4-5］。

2　結(jié)果

圖1　輪狀病毒HeBei-12株感染MA-104細胞70 h時的CPE （40×）

2.1CPE觀察豬狀病毒HeBei-12株感染MA-104細胞70 h時，可觀察到明顯的CPE，表現(xiàn)為細胞膜融合，細胞核固縮、空泡化，感染細胞大片脫落，如圖1B。

2.2RT-PCR檢測結(jié)果通過對病毒的細胞培養(yǎng)物RNA的提取，并進行RT-PCR檢測，經(jīng)核酸檢測得到大小約274 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果符合。結(jié)果表明，HeBei-12株輪狀病毒已適應(yīng)MA-104細胞。結(jié)果見圖2。

圖2　RT-PCR檢測結(jié)果

2.3間接免疫熒光檢測對輪狀病毒核酸陽性者在MA-104細胞上接種。為獲得病毒在細胞上的最佳繁殖量，本試驗對收毒時間進行初步摸索，圖3為HeBei-12株病毒在MA-104細胞上繁殖36、54、70 h和100 h時的間接免疫熒光結(jié)果（如圖3）。結(jié)果表明，當病毒感染36 h時，細胞保持著完整的形態(tài)，僅呈現(xiàn)出輕微的熒光（如圖3A和3E）。54 h時細胞開始發(fā)生輕微病變，細胞質(zhì)染色加深且特異性熒光更加明顯（如圖3B和3F）。70 h時呈現(xiàn)明顯的CPE，有的細胞完全被熒光顆粒所充滿，有的細胞已經(jīng)破裂，僅可以看到非特異性的細胞輪廓（如圖3C和3G）。100 h時大部分細胞破裂，喪失細胞形態(tài)（如圖3D和3H）。由此，初步確定病毒在MA-104細胞上培養(yǎng)最適培養(yǎng)時間為60～70 h。

圖3　間接免疫熒光結(jié)果

2.4病毒的動力學(xué)增殖曲線將HeBei-12病毒接種于MA-104細胞，測定其動力學(xué)增殖曲線，結(jié)果見圖4。當病毒感染64 h時，在MA-104細胞中滴度達到最大值4.8 log TCID50/mL。此后滴度逐漸下降。因此，確定病毒感染MA-104細胞的最適收毒時間為64 h。

圖4　病毒的增殖動力學(xué)曲線

2.5超薄切片電鏡將HeBei-12株豬輪狀病毒接種于MA-104細胞，在不同時間對病毒量進行監(jiān)測。結(jié)果如圖5所示，當病毒感染細胞20 h時，細胞保持完整且良好的形態(tài)，未見有病毒粒子。30 h時視野中觀察到了典型的病毒粒子，彌散的存在于細胞質(zhì)中。40 h時細胞質(zhì)中的病毒粒子增多，細胞發(fā)生輕微的病變。50 h時病毒粒子繼續(xù)增殖，病變程度加深，細胞折光度發(fā)生了明顯的變化。60 h時病毒粒子充滿了整個細胞質(zhì)中，細胞核明顯萎縮。70 h時病毒粒子開始減少，細胞核空泡化，各個細胞器均發(fā)生了明顯的病變且失去了完整的細胞構(gòu)架。80 h時伴隨著病毒粒子的釋放細胞質(zhì)中的病毒進一步減少。病毒繁殖90 h后，細胞形態(tài)已基本喪失。

圖5　超薄切片

3　討論

輪狀病毒是引起幼齡動物腹瀉的重要病原之一。該病發(fā)生于世界各地，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失。目前尚無特效藥物來治療該?。?-7］，主要仍以預(yù)防為主，而病毒在細胞上的分離培養(yǎng)和提高滴度是疫苗研制的關(guān)鍵因素。

本試驗對從河北省收集的豬腹瀉糞便樣品（已經(jīng)驗證了其為輪狀病毒感染，且無其他腹瀉病毒的混合感染），命名為HeBei-12株。對該病毒在MA-104細胞上進行馴化培養(yǎng)。結(jié)果顯示，該毒株在MA-104細胞上可出現(xiàn)典型的CPE，且隨著傳代次數(shù)增加，出現(xiàn)CPE的時間縮短，細胞病變程度也隨之加劇。證明病毒可很好的適應(yīng)細胞。

收毒時間是獲得高滴度病毒的關(guān)鍵因素［8］，一方面病毒在細胞中有其各自的繁殖周期，另一方面從細胞中釋放到培養(yǎng)液中的病毒并不能長時間的耐受37℃的條件。所以，當各方面因素達到平衡時獲得病毒的最高滴度尤為重要。本試驗分別從間接免疫熒光試驗，增殖動力學(xué)曲線以及病毒感染細胞后的超薄切片電鏡觀察進行測定，以確定最佳收毒時間。結(jié)果顯示，當病毒感染64 h時，病毒滴度可達到最大值4.8logTCID50/ mL。隨著時間的推移滴度逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，因此確定病毒在MA-104細胞中培養(yǎng)的最佳收毒時間為64 h。

本試驗證明了HeBei-12分離株對細胞具有良好的適應(yīng)性，并對其在細胞中的繁殖情況進行摸索。為進一步研究其生物學(xué)特性和疫苗制備奠定了基礎(chǔ)。

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［3］尹興曉，文喻玲，趙慶歡，等.輪狀病毒Vp6蛋白的免疫熒光檢測［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2008，21（5）：434-437.

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Gropefor optimal proliferation timeof porcinerotavirusHeBei-12 strain in MA-104 cell line

MA Shi-bo，TAN Fei，JIANG Yan-ping，QIAO Xin-yuan，CUI Wen，TANG Li-jie，LIU Min，LI Yi-jing
（Department of Preventive Veterinary，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In this study，we showed that rotavirus HeBei-12 strain could grow well on MA-104 cell demonstrated by RT-PCR. Virus propagation was analyzed by immuno-fluorescence，proliferation kinetics，and electron microscope detection，and the haresting time was also optimized.The results showed that the virus particles constantly changed with time.The highest value of 4.8logTCID50/mL was detected at 62 h before the titers decreased gradually.Determination for optimal proliferation time would make a contribution to molecular biology study and vaccine development on porcine rotavirus.

Porcine rotavirus HeBei-12 strain；proliferation；MA-104 cell line

LI Yi-jing

S852.65+9.4

A

0529-6005（2016）04-0026-04

2014-11-04

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題（2012AA10-1304-3）

馬士博（1989-），女，碩士，研究方向為動物微生物與免疫，E-mail：mashibo8904@126.com

李一經(jīng)，E-mail：yijingli@163.com