岳東梅，王金磊，馬　君，黃思揚，朱興全，王春仁

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，甘肅 蘭州 730046）

甘肅臨夏綿羊雙腔吸蟲的感染與鑒定

岳東梅1，2，王金磊2，馬君2，黃思揚2，朱興全2，王春仁1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，甘肅 蘭州 730046）

為調(diào)查甘肅省臨夏回族聚集地中綿羊雙腔吸蟲的自然感染情況，有效地指導防治工作，選取了具有代表性的屠宰場進行調(diào)查。首先經(jīng)過形態(tài)學觀察，對疑似病原進行分離，再通過PCR方法及DNA測序來鑒定。形態(tài)鑒定結(jié)果表明，在350只綿羊中共發(fā)現(xiàn)8只綿羊感染了雙腔吸蟲，分子生物學鑒定結(jié)果表明，這8只綿羊感染的雙腔吸蟲均為矛形雙腔吸蟲。

雙腔吸蟲；調(diào)查；臨夏回族自治州；分離；鑒定

雙腔吸蟲病是由矛形雙腔吸蟲（Dicrocoelium dendriticum）、東方雙腔吸蟲（Dicrocoelium orientalis）或中華雙腔吸蟲（Dicrocoelium chinensis）寄生于反芻動物牛、羊、駱駝和鹿的膽管和膽囊內(nèi)引起的。雙腔吸蟲也可感染馬屬動物、豬、犬、兔、猴及其他動物，偶見感染人［1-3］。

該病分布較廣，其流行與陸地螺和螞蟻的廣泛存在有關(guān)，在我國各地都有發(fā)生，尤其西北諸省區(qū)和內(nèi)蒙古流行嚴重，能引起膽管炎、肝硬變，并導致代謝障礙和營養(yǎng)不良，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失［2，4］。因此，有效的防制此病對畜牧業(yè)生產(chǎn)、保護公共環(huán)境、預防和控制人畜共患寄生蟲病有重要意義。

1997年王佩雅等報道的甘南牧區(qū)綿羊中吸蟲感染情況［5］、1999年朱瑗、張思明報道的甘肅定西羊矛形雙腔吸蟲感染情況［6］、2008年陳亮等報道的蘭州的羊矛形雙腔吸蟲的感染情況［7］均采用形態(tài)學觀察并報道的。但傳統(tǒng)的診斷方法無法鑒別形態(tài)極其相似種。近年來PCR技術(shù)廣泛運用于寄生蟲的鑒定，根據(jù)ITS序列來進行PCR擴增能夠檢測雙腔吸蟲幼蟲［8］。為了調(diào)查甘肅省臨夏地區(qū)綿羊雙腔吸蟲的感染情況，我們選取了兩個具有代表性的綿羊屠宰場進行調(diào)查，期望獲得該牧區(qū)的雙腔吸蟲的流行趨勢，制定出相應(yīng)的防控策略，對羊健康養(yǎng)殖起到指導作用。

1　材料與方法

1.1樣品來源甘肅省臨夏市某大型綿羊屠宰場和康樂縣某綿羊屠宰場分別隨機抽取150只和200只綿羊作為調(diào)查對象。將待檢綿羊逐個剖殺并將病變明顯的肝臟收集，低溫保存運送到實驗室，并對每個有病變的肝臟用剪刀沿肝膽管進行剖檢，將收集的雙腔吸蟲蟲體在室溫下用生理鹽水清洗3次，將自然沉降的、無雜質(zhì)的雙腔吸蟲蟲體固定于75%酒精中，并置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2引物合成與稀釋采用我們實驗室先前報道的吸蟲ITS序列通用引物NC5（5′-GTA GGTGAA CCT GCG GAA GGA TCA TT-3′，26 bp）和NC2（5′-TTA GTT TCT TTT CCT CCG CT-3′，20 bp）序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行合成（每管1OD）。合成的引物于室溫下，6 000 r/min離心5 min，加入所需滅菌超純水，充分混勻后于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3蟲體DNA的提取按照基因組DNA抽提試劑盒（WizardRSV Genomic DNA purification system，Promega，USA）的使用說明書提取蟲體DNA，將提好的蟲體DNA置于4℃或-20℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4核糖體ITS序列的PCR擴增用引物NC5和NC2對蟲體的ITS基因進行PCR擴增。擴增體系為25 μL，含12.5 μL Premix Ex Taq，上下引物（50 μmol/mL）各0.5 μL，DNA模板1 μL，滅菌水10.5 μL。預期片段大小為1 200 bp。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性2 min，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增完畢后，取5 μL PCR產(chǎn)物，用凝膠電泳檢測（1%瓊脂糖凝膠，溴化乙錠染色）后，凝膠成像系統(tǒng)照相，并記錄結(jié)果。

1.5PCR產(chǎn)物膠回收與純化經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將與目的片段大小相符的PCR產(chǎn)物進行膠回收純化，具體操作步驟按照OMEGA Gel Extraction Kit試劑盒使用說明書進行。將純化好的PCR產(chǎn)物置于4℃或-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6測序與分析將目的片段的膠回收產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行雙向測序，然后拼接。將拼接后的序列通過NCBI上進行Blast比對及軟件分析，來判斷該雙腔吸蟲是中華雙腔吸蟲、東方雙腔吸蟲還是矛形雙腔吸蟲。

2　結(jié)果

2.1剖檢結(jié)果對上述兩個綿羊屠宰場共350只綿羊的肝臟進行調(diào)查。臨夏市大型綿羊屠宰場的150只綿羊中發(fā)現(xiàn)有病變的肝臟10只，進一步檢測未發(fā)現(xiàn)雙腔吸蟲的感染。康樂縣綿羊屠宰場的200只綿羊中，發(fā)現(xiàn)有病變的肝臟15只，進一步檢測發(fā)現(xiàn)8只綿羊的肝臟感染并分離獲得了雙腔吸蟲蟲體。此結(jié)果表明，臨夏回族自治區(qū)雙腔吸蟲的平均感染率較低，僅為2.3%。

2.2PCR擴增結(jié)果雙腔吸蟲有3個種，單從形態(tài)上很難區(qū)分，最有效最可靠的方法是分子生物學方法，用引物NC5和NC2對隨機選取的5條雙腔吸蟲的TS基因序列進行擴增，經(jīng)1%凝膠電泳檢測，擴增出主條帶大小為1 200 bp左右，與目的條帶預期大小一致（如圖1）。

圖1　雙腔吸蟲ITS基因序列PCR鑒定結(jié)果

2.3DNA測序結(jié)果將從測序公司得到的測序結(jié)果比對拼接，獲得準確序列并在NCBI上Blast比對，結(jié)果表明，5個PCR樣品的序列均與矛形雙腔吸蟲ITS序列的匹配率達到100%。因此判定本次分離得到的雙腔吸蟲全部為矛形雙腔吸蟲。

3　討論

雙腔吸蟲病主要感染反芻動物且流行范圍較廣，常與肝片吸蟲混合感染，造成更大的經(jīng)濟損失。近年來對雙腔吸蟲病的研究非常少，因此對其目前的流行情況幾乎沒有了解。在甘肅地區(qū)少數(shù)民族較多，尤其是穆斯林較多，養(yǎng)羊業(yè)對該地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展起到很重要的作用，因此全面了解羊寄生蟲的感染形勢對養(yǎng)羊業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

本次調(diào)查結(jié)果表明，甘肅省臨夏回族自治區(qū)綿羊雙腔吸蟲感染率為2.3%。通過分子生物學方法鑒定分離的蟲體全部為矛形雙腔吸蟲。該結(jié)果與1997年王佩雅等在甘南調(diào)查的結(jié)果一致［5］，說明近20年來在甘肅地區(qū)主要以矛形雙腔吸蟲的感染為主。相比1999年定西地區(qū)羊矛形雙腔吸蟲感染率（76.4%）［6］，臨夏地區(qū)2015年的感染率下降了約33倍。造成這些差異的原因可能有地理位置和環(huán)境的不同，臨夏州地處青藏高原與黃土高原過渡地帶，境內(nèi)山谷多，平地少，平均海拔2 000 m，由于海拔較高、氣候變化較大，雙腔吸蟲尾蚴和螺的生長繁殖的自然條件較差；對于1997年的結(jié)果來說，低感染率也說明了我們羊養(yǎng)殖水平的不斷提高。而我們此次的調(diào)查結(jié)果高于2008年蘭州地區(qū)的感染率0.38%［7］，這也說明在臨夏地區(qū)尤其是康樂縣，其緊鄰洮河，洮河水位近年來不斷下降，在洮河沿岸形成不少低洼濕地，這一變化適宜雙腔吸蟲的中間宿主螺的生長。而蘭州附近的郊區(qū)這種環(huán)境相對較少，且蘭州附近羊場的衛(wèi)生及防控措施更加到位，減少了雙腔吸蟲的傳播。

傳統(tǒng)的診斷方法主要根據(jù)形態(tài)學特征進行糞便中蟲卵的顯微觀察和肝臟中成蟲的檢查，無法鑒別形態(tài)極其相似種。本試驗調(diào)查除用形態(tài)學方法外，還采用了分子生物學方法對其種類進行了鑒定，其較普通鑒定方法更加的敏感、特異、準確，其結(jié)果更加可靠。

本次調(diào)查臨夏地區(qū)綿羊雙腔吸蟲的感染率較低，說明近年來對該病的防控措施到位，但該疾病并沒有消失，因此仍需加強環(huán)境衛(wèi)生和飼養(yǎng)管理，放牧應(yīng)盡可能避開潮濕低洼地帶［9］。同時要滅螺，建立清潔的飲水地點，合理補充精料和礦物質(zhì)，提高畜體自身的抵抗力。

對臨夏回族自治州綿羊雙腔吸蟲感染情況的調(diào)查這是首次報道，臨夏地區(qū)所處的位置介于甘南與蘭州之間，對該地區(qū)寄生蟲疾病的良好監(jiān)控也具有重要的意義，能夠掌握該地區(qū)雙腔吸蟲地流行情況，為蘭州地區(qū)的公共衛(wèi)生防控提供重要的理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。

［1］闞立抒，何昕，胡志廣.中華雙腔吸蟲形態(tài)學特性［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2007（10）：22-22.

［2］牛術(shù)華.雙腔吸蟲病的防控［J］.Animal Husbandry and Feedence，2010，31（11）：186-187.

［3］Farid H.Human infection with Fasciola hepatica and Dicrocoelium dendriticum in Isfahan area，Central Iran［J］.Journal of Parasitology，1971，57（1）：160-160.

［4］李敬雙，何學佘.矛形雙腔吸蟲對綿羊感染情況的調(diào)查［J］.肉品衛(wèi)生，1999（04）：4-4.

［5］王佩雅，呂文順，才學鵬，等.甘南牧區(qū)藏系綿羊寄生蠕蟲的種類調(diào)查和感染季節(jié)動態(tài)研究［J］.中國獸醫(yī)科技，1997，27（10）：19-21.

［6］朱瑗，張思明.甘肅省定西地區(qū)羊寄生蟲感染情況調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)科技，1999，29（1）：15-17.

［7］陳亮，竇永喜，田斌，等.蘭州地區(qū)羊寄生蟲感染情況調(diào)查及防治策略［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2008，38（6）：18-20.

［8］Martínez-Ibeas A M，Martínez-Valladares M，González-Lanza C，et al.Detection of Dicrocoelium dendriticum larval stages in mollusc and ant intermediate hosts by PCR，using mitochondrial and ribosomal internal transcribed spacer（ITS-2）sequences［J］.Parasitology，2011，138（14）：1-8.

［9］馬萍.小尾寒羊羔羊寄生蟲病調(diào)查及防治效果［J］.中國獸醫(yī)寄生蟲病，2007，15（5）：35-37.

Infection and identification ofDicrocoelium dendriticumof sheep in Linxia，Gansu province

YUE Dong-mei1，2，WANG Jin-lei2，MA Jun2，HUANG Si-yang2，ZHU Xing-quan2，WANG Chun-ren1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China；2.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province，Lanzhou Veterinary Research Institute，CAAS，Lanzhou 730046，China）

Dicroceliosis is one of the major parasitic diseases which seriously endanger the cattle and sheep.In order to investigate the natural infection of sheep in the area of Linxia Hui Autonomous Prefecture，Gansu province，and guide the prevention and control work effectively，the representative abattoir was selected.In this study，the pathogens were first detected by the morphological identification，and then they were isolated and identified by，PCR and DNA sequencing.The results indicated that all of the were Dicrocoelium dendriticum.

Dicrocoelium；Survey；Linxia Hui Autonomous Prefecture；isolation；identification

WANG Chun-ren

S852.73+5

A

0529-6005（2016）09-0013-02

2016-03-07

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2015CB-150300）

岳東梅（1989-），女，碩士生，從事動物寄生蟲病研究，E-mail：dongmeiyue@163.com

王春仁，E-mail：chunrenwang@sohu.com