尹柏雙，宋永利，付連軍，呼顯生，沙萬里，方文山，高　利

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

鹿特異性復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠腦區(qū)NOS活性及NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的影響

尹柏雙1，宋永利1，付連軍1，呼顯生1，沙萬里1，方文山1，高利2

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

研究鹿特異性復(fù)合麻醉劑麻醉下大鼠不同腦區(qū)NOS活性、NO和cGMP濃度的變化，探討鹿特異性復(fù)合麻醉劑的中樞作用機(jī)理。將24只SD大鼠隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組、誘導(dǎo)期、麻醉期和催醒期，于不同時(shí)期采集大鼠大腦皮質(zhì)、小腦、腦干、海馬和丘腦。采用比色法測(cè)定各腦區(qū)NOS活性和NO含量，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定各腦區(qū)cGMP濃度。結(jié)果表明，腹腔注射鹿特異性復(fù)合麻醉劑30 mg/kg體重后，麻醉期各腦區(qū)一氧化氮合酶（NOS）活性顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；NO產(chǎn)量與對(duì)照組比較降低極顯著（P＜0.01）；鳥甘酸環(huán)化酶（cGMP）濃度降低顯著（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果提示，鹿特異性復(fù)合麻醉劑抑制大鼠各腦區(qū)NOS活性，阻斷NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是其產(chǎn)生全麻作用的重要機(jī)理之一。

鹿特異性復(fù)合麻醉劑；一氧化氮合酶；一氧化氮/環(huán)鳥苷酸；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

一氧化氮（NO）是一種氣體信號(hào)分子，可激活鳥苷酸環(huán)化酶（cGMP），起到細(xì)胞間信號(hào)傳遞的作用［1-2］。cGMP作為第二信使，起到傳遞細(xì)胞內(nèi)信息的作用［3］。一氧化氮合酶（NOS）是NO生成的關(guān)鍵酶［4］。NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路［5-6］，將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，參與肌肉收縮、神經(jīng)傳遞和細(xì)胞生長(zhǎng)等生理過程［7］。研究發(fā)現(xiàn)，NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了麻醉藥對(duì)神經(jīng)突觸作用，引起興奮性突觸的抑制和抑制性突觸的增強(qiáng)，從而產(chǎn)生麻醉現(xiàn)象［8-10］。鹿特異性復(fù)合麻醉劑是根據(jù)平衡麻醉理論以賽拉嗪和強(qiáng)痛寧組方而成的針對(duì)于鹿生理特點(diǎn)，為鹿的鋸茸、野外分群和疾病診療等需要研制。本試驗(yàn)旨在探討鹿特異性復(fù)合麻醉劑麻醉下大鼠各腦區(qū)NOS活性、NO和cGMP含量的變化，擬從NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的變化揭示鹿特異性復(fù)合麻醉劑作用的分子學(xué)機(jī)理。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及動(dòng)物鹿特異性復(fù)合麻醉劑（噻啦嗪∶替來他明∶強(qiáng)痛寧=0.90∶0.82∶0.26）；NOS測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130815）；NO測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130812）；考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130816）；cGMP Elisa Kit（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130915）。SD純種大鼠24只，體重200±20 g，雌雄不拘，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，同一條件下飼養(yǎng)2周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2動(dòng)物分組與處理SD純種大鼠，共24只，隨機(jī)取6只作為生理鹽水對(duì)照組，其余大鼠為試驗(yàn)組；試驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分成誘導(dǎo)期（注藥后5 min）、麻醉期（翻正反射消失）、催醒期（翻正反射恢復(fù)）3個(gè)亞組，每組6只。對(duì)照組大鼠腹腔注射30 mL/ kg體重的生理鹽水，試驗(yàn)組大鼠腹腔注射30 mg/ kg體重的鹿特異性復(fù)合麻醉劑。

1.3樣品采集和處理對(duì)照組大鼠在腹腔注射給藥后5 min斷頭取腦，誘導(dǎo)期、麻醉期和催醒期分別在給藥后5 min、大鼠翻正反射消失即刻、翻正反射恢復(fù)即刻斷頭取腦，在生理鹽水冰面上迅速分離大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干，分別稱重，裝入凍存管后投入液氮中保存。

分別將腦組織取出置入冰冷的蔗糖緩沖液（0.32 mol/L，1/10，W/V）介質(zhì)中勻漿，2 500 r/min離心10 min，制備成10%腦組織勻漿液，為待測(cè)樣品。

1.4檢測(cè)方法采用比色法測(cè)定NOS酶活性和NO含量，ELISA測(cè)定cGMP濃度，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。檢測(cè)具體方法參照各檢測(cè)試劑盒的操作說明書進(jìn)行。

1.5試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，用SPSS 13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1鹿特異性復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)NOS活性的影響結(jié)果如表1所示，復(fù)合麻醉劑給藥后抑制了大鼠各腦區(qū)內(nèi)NOS活性，誘導(dǎo)期海馬、腦干NOS活性與對(duì)照組比較分別降低了34.93%（P＜0.01）和18.91%（P＜0.05）；麻醉期大腦皮質(zhì)、小腦、腦干、海馬和丘腦NOS活性與對(duì)照組相比分別降低了32.73%（P＜0.01）、11.47%（P＜0.05）、31.79%（P＜0.01）、35.65%（P＜0.01）和28.52%（P＜0.01）；催醒期大腦皮質(zhì)、小腦和丘腦NOS活性仍然較對(duì)照組低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2鹿特異性復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)NO含量的影響由表2可見，復(fù)合麻醉劑降低了大鼠各腦區(qū)NO含量，誘導(dǎo)期大腦皮質(zhì)、小腦、腦干和丘腦NO含量與對(duì)照組比較分別降低了53.35%（P＜0.01）、35.53%（P＜0.01）、39.83%（P＜0.01）和36.55%（P＜0.01）；麻醉期大腦皮質(zhì)、小腦、海馬、腦干和丘腦NO含量與對(duì)照組比較分別降低了74.96%（P＜0.01）、70.09%（P＜0.01）、48.89%（P＜0. 01）、39.63%（P＜0.01）和63.62%（P＜0.01）。催醒期小腦NO含量仍低于對(duì)照組（P＜0.01）。

表1　復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)NOS活性的影響（n=6，D）［mol Pi/mg（prot）/h］

表1　復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)NOS活性的影響（n=6，D）［mol Pi/mg（prot）/h］

注：與對(duì)照組比較；**：P＜0.01，差異極顯著；*：P＜0.05，差異顯著，下表同

大腦　　小腦　　腦干　　海馬　　丘腦對(duì)照組　6.526±0.21　6.443±0.19　14.197±2.34　6.536±0.54　9.063±1.03誘導(dǎo)期　6.146±0.23　6.684±0.22　11.512±2.74*　4.253±0.37**　9.650±1.14麻醉期　4.390±0.17**　5.704±0.25*　9.684±2.17**　4.206±0.28**　6.478±1.08**催醒期　5.600±0.13*　5.957±0.18*　13.222±3.13　7.676±0.65　5.180±0.39**

2.3鹿特異性復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)cGMP濃度的影響結(jié)果如表3所示，復(fù)合麻醉劑引起大鼠麻醉期各腦區(qū)內(nèi)cGMP濃度降低，與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05或P＜0.01）。催醒期大鼠小腦和腦干cGMP濃度仍低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。

3　討論

NO在維持機(jī)體清醒狀態(tài)、調(diào)解生理機(jī)能等方面發(fā)揮著重要作用［11-12］。中樞神經(jīng)通路的興奮性和抑制性與NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)關(guān)系密切，CNS通過調(diào)節(jié)中樞NO/cGMP系統(tǒng)使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)cGMP含量升高引起興奮性；cGMP含量下降引起中樞抑制［13］。

表2　復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)NO含量的影響（n=6，D）（U/mg）

表2　復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)NO含量的影響（n=6，D）（U/mg）

大腦　　小腦　　腦干　　海馬　　丘腦對(duì)照組　1.957±0.17　7.500±0.78　3.839±0.57　4.502±0.65　3.587±0.28誘導(dǎo)期　0.913±0.12**　4.835±0.21**　2.310±0.36**　3.966±0.37　2.276±0.19**麻醉期　0.490±0.06**　2.243±0.19**　1.962±0.21**　2.718±0.15**　1.305±0.11**催醒期　1.847±0.23　4.393±0.42**　3.886±0.46　4.267±0.48　3.055±0.36

表3　復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)cGMP濃度的影響（n=6，D）（pmol/mL）

表3　復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)cGMP濃度的影響（n=6，D）（pmol/mL）

大腦　　小腦　　腦干　　海馬　　丘腦對(duì)照組　8.19±0.84　9.76±0.97　6.22±1.03　11.62±1.07　7.18±0.51誘導(dǎo)期　7.92±0.47　8.70±0.72　6.11±1.76　11.78±1.25　7.04±0.38麻醉期　7.25±0.73*　8.34±1.05*　5.25±0.85*　9.62±0.97**　5.83±0.73**催醒期　7.68±0.69　7.34±0.67**　5.13±0.71*　12.84±1.06　7.06±0.83

過去的研究表明，多數(shù)麻醉藥能明顯減少大腦皮質(zhì)、小腦等腦區(qū)cGMP的含量，提示NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的抑制可能促使了全身麻醉作用的出現(xiàn)［14］。王洪斌等研究結(jié)果表明，噻環(huán)乙胺麻醉下大鼠大腦皮層、海馬和丘腦內(nèi)NOS活性被抑制，引起NO和cGMP含量明顯下降，提示噻環(huán)乙胺麻醉與NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被抑制相關(guān)［10］。劉煥奇等研究表明，NO/cGMP信號(hào)傳遞系統(tǒng)參與了賽拉唑產(chǎn)生全麻作用［15］。胡興國等研究表明，異丙酚明顯抑制大鼠小腦、海馬和大腦皮層中NOS活性，顯著減少腦區(qū)NO和cGMP含量，提示NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在異丙酚全麻分子機(jī)理中發(fā)揮重要作用［16］。本研究結(jié)果表明，腹腔注射鹿特異性復(fù)合麻醉劑30 mg/kg體重后，引起麻醉期各腦區(qū)NOS活性顯著降低，NO和cGMP含量下降，提示NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了鹿特異性復(fù)合麻醉劑全麻分子機(jī)理調(diào)控。

4　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，鹿特異性復(fù)合麻醉劑抑制大鼠大腦皮質(zhì)、小腦、海馬、腦干和丘腦內(nèi)NOS活性，降低NO和cGMP含量，阻斷NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是其產(chǎn)生全麻作用的重要機(jī)理之一。

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Effects of theSpecificity Anesthetic for Deer on NOS activity and NO/cGMP Signal Pathway in Different Encephalic Region of Rats

YIN Bai-shuang1，SONG Yong-li1，F(xiàn)U Lian-jun1，HU Xian-sheng1，SHA Wan-li1，F(xiàn)ANG Wen-shan1，GAO Li2
（1.Department of Animal Medicine，JiLin Agricultural Science and technology，Jilin 132101，China；2.College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

NOS activity，NO and cGMP contents in different encephalic regions of rats were measured to explore the possible molecular mechanism of action of the deer specific anesthetic on the central nervous system.24 SD rats were divided randomly into four groups including the control，the induction the anesthesia and the recovery.Rats'brain samples of cerebral cortex，hippocampus，cerebellum，thalamus and stem were separated at the different time points under the deer specific anesthesia.The activities of NOS were measured by using colorimetry，and the concentrations of NO and cGMP were determined by Elisa.The NOS activities（P＜0.05 or P＜0.01），the NO contents（P＜0.01），and the concentration of cGMP（P＜0.05 or P＜0.01）were all obviously decreased in all encephalic regions in the anesthesia group compared with control groups.These results indicated that the deer specific anesthetic inhibited NOS activity and blocked NO/cGMP signal transduction，which might be one of the important mechanisms for the drug to generate general anesthesia.

deer specific anesthetic；NOS；NO/cGMP；signal pathway

GAO Li

S859.791

A

0529-6005（2016）09-0114-03

2015-03-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31302150）；長(zhǎng)白山動(dòng)植物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字2012701，2013S029）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字2012307）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字2013905）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究（吉教科合字2014379）

尹柏雙（1978-），男，副教授，博士，從事麻醉與鎮(zhèn)痛研究，E-mail：ybs3421@126.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com