孫振亞梁琳何潔婷王玲玲曾濤

·論著·

沉默Kin17表達抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖

孫振亞1梁琳2何潔婷2王玲玲2曾濤3，4★

目的探討沉默Kin17表達對乳腺癌細胞生長增殖的影響，為評估該分子作為未來藥物靶點的潛能提供依據。方法分別用攜帶Kin17基因特異性siRNA與正常對照siRNA的慢病毒重組載體感染MDA-MB-231細胞，再用嘌呤霉素進行抗性篩選，然后在熒光顯微鏡下觀察陽性細胞的比例；用Real-time PCR與Western blot方法檢測穩(wěn)定轉染了慢病毒重組載體的MDA-MB-231細胞中的Kin17 mRNA與蛋白表達水平；CCK-8實驗檢測細胞生長增殖狀況。結果通過感染攜帶Kin17特異性siRNA的病毒重組載體，穩(wěn)定、明顯敲減了MDA-MB-231細胞中的Kin17mRNA與蛋白表達水平，而且顯著減緩了該乳腺癌細胞的生長增殖速度。結論沉默Kin17表達能抑制三陰表型乳腺癌細胞的增殖，并有可能成為一種潛在的乳腺癌治療新策略。

Kin17；基因沉默；乳腺癌細胞；細胞增殖；三陰型

乳腺癌是女性的頭號腫瘤殺手，嚴重威脅著女性的生命健康［1］。早期患者進行腫瘤組織手術切除為較好的選擇，而進展期的患者的放化療效果還不是很理想。目前，分子分型及相應的靶向治療在乳腺癌中已取得了令人振奮的療效［2］。內分泌療法能明顯改善雌激素（estrogen receptor，ER）或孕激素受體（progestrone receptor，PR）陽性的患者的預后生存［3］。人表皮生長因子受體2（human epidermal grow th factor receptor-2，HER-2）陽性的患者對抗HER-2抗體藥物的臨床療效喜人［4］。而最近發(fā)現，這些靶向藥物在臨床應用中也出現了較多的耐藥性。特別是三陰表型（ER-PRHER-2-）的患者，暫時沒有明顯有效的靶向藥物選擇，預后極差［5］。因此，挖掘更多的藥物靶點，對乳腺癌患者的有效治療非常緊要。

Kin17是一個物種進化中十分保守的蛋白質，在細胞中主要參與DNA復制和DNA修復功能［6，7］。最近，多項研究顯示，該蛋白與肝癌、結腸癌、肺癌、膠質瘤等多種腫瘤的進展及預后療效有關［8-11］。本課題組前期研究發(fā)現，Kin17在乳腺癌組織中表達明顯升高，很可能參與該腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12］。本文將探討沉默Kin17表達對三陰表型乳腺癌細胞MDA-MB-231生長增殖的影響，為評估該分子作為未來藥物靶點的潛能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

MDA-MB-231細胞購自上海中科院細胞庫，慢病毒載體GV115與siRNA購自上海吉凱基因有限公司，胎牛血清FBS、Leibovitz-15培養(yǎng)基和Trizol購自美國Invitrogen公司，M-MLV逆轉錄酶購自美國Promega公司，PrimerSTAR DNA聚合酶購自大連寶生物公司，CCK-8購自于美國sigma公司，鼠抗人Kin17單抗、羊抗鼠IgG-HRP二抗購于美國Santa cruz公司，PCR引物由廣州華大基因有限公司合成，其他試劑為國產或進口分析純試劑。

1.2 細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細胞用Leibovitz-15培養(yǎng)基（添加10％胎牛血清、100 U/m L青霉素、100mg/L鏈霉素）在37℃、含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 穩(wěn)定轉染慢病毒重組載體的細胞株篩選

先針對Kin17基因（GenBank number NM_ 012311，1 182 bp）靶序列設計siRNA，然后分別把合成的相應Kin17_siRNA和正常對照siRNA雙鏈DNA與慢病毒載體GV115進行定向拼接，形成重組載體GV-siRNA_Kin17與GV-siRNA_NC，經測序鑒定正確。重組病毒載體與輔助包裝原件質粒用Lipofectamine 2000共轉染293T細胞，轉染8 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞上清液，然后進行慢病毒顆粒濃縮與病毒滴度測定。接著，把包裝好的病毒感染MDA-MB-231細胞，用嘌呤霉素篩選，在熒光顯微鏡下觀察攜帶熒光細胞的比例，當陽性感染率達到80％以上時停止抗性篩選，得到穩(wěn)定轉染沉默載體的細胞株MDA-MB-231KD與對照細胞株MDA-MB-231NC（圖1）。

1.4 Real-time PCR

根據已知的人Kin17 cDNA序列自行設計上游引物（5′-CAACTATTGCTGGCTTCA-3′）與下游引物（5′-TGTCTCGTCCACTTTGC-3′），PCR產物片段的理論值為243 bp。GAPDH作為內參對照，上游引物（5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′）與下游引物（5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′）的理論上PCR產物片段為121 bp。收集生長狀態(tài)良好的細胞，先用Trizol抽提總RNA，再用M-MLV逆轉錄酶把總RNA反轉錄而獲得cDNA，接著配制PCR反應體系，混勻后稍離心，于Takara TP800實時定量PCR儀上進行擴增測定。擴增參數為：95℃預變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，共進行40個循環(huán)。

1.5 Western blot分析

收集生長狀態(tài)較好的細胞，用含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液溶解細胞，離心取上清進行SDS-PAGE電泳分離，隨后電轉至PVDF膜上。PVDF膜用5％脫脂奶粉于室溫封閉1 h，再加入鼠抗人Kin17單抗，GAPDH作為內參。次日，滴加羊抗鼠IgG-HRP二抗孵育45m in，經PBST漂洗后，最后用ECL底物曝光及拍照。

1.6 CCK-8細胞增殖檢測

將處于對數生長期的細胞用胰酶消化并收集，再用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液（2×104個/m L）；按照每孔100μL種植于96孔板中，每組設置6孔重復；待細胞完全沉降下來后，在顯微鏡下觀察各組的細胞密度與均勻程度適可后，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。20 h后，加入10μL CCK-8試劑于培養(yǎng)板孔中，無需換液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，把96孔板置于振蕩器上振蕩5m in，再用酶標儀在450 nm波長下檢測OD值。本實驗重復3次，數值用均值±標準差表示。

1.7 統計學處理

實驗數據用SPSS 13.0軟件進行統計分析，不同組細胞間的生長曲線用配對T檢驗來比較分析，P＜0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 成功篩選獲得穩(wěn)轉慢病毒載體GV-siRNA_Kin17與GV-siRNA_NC的細胞株

分別將已構建的慢病毒重組載體GV-siRNA_Kin17與GV-siRNA_NC感染MDA-MB-231細胞，用嘌呤霉素進行抗性篩選，攜帶有綠色熒光載體的陽性細胞比例逐漸增加。當陽性細胞率達到80％以上（圖1）及細胞匯合度達到約80％時，我們即得到了穩(wěn)定轉染重組病毒載體的細胞株MDA-MB-231KD與對照細胞株MDA-MB-231NC，并把它們作為下一步細胞功能研究的實驗材料。

2.2 用GV-siRNA_Kin17載體有效沉默MDA-MB -231細胞的Kin17表達

Real-time PCR檢測結果顯示，轉染了GV-siRNA_Kin17病毒載體的MDA-MB-231KD細胞中的Kin17mRNA表達水平明顯下調，比正常對照細胞MDA-MB-231NC減低了77.5％（圖2A）。Western blot實驗結果也表明，MDA-MB-231KD細胞中的Kin17蛋白表達水平也比正常對照細胞明顯下降（圖2B）。這提示該病毒重組載體的基因沉默效果較好。

2.3 沉默Kin17表達對MDA-MB-231細胞增殖的影響

正常對照細胞MDA-MB-231NC的生長狀態(tài)良好。而CCK-8實驗顯示，MDA-MB-231KD細胞的生長增殖速度比對照細胞MDA-MB-231NC要明顯減緩，P=0.002 6＜0.01（圖3）。

3 討論

已有多項研究表明，Kin17是細胞中DNA復制復合物的一個重要成員，用Kin17抗體作用于細胞，會抑制細胞DNA復制水平［6］。紫外線或離子輻射細胞，能引起該分子的表達上調及定位改變［7］；它很像一個DNA維持蛋白，參與晚期的DNA修復［13］。最近研究發(fā)現，該蛋白與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［8，14］。上調Kin17水平能促進肝癌細胞的生長增殖［8］。而沉默Kin17表達能促進結直腸癌細胞對常用化療藥物的敏感性［9］。

據報道，Kin17在機體各種正常組織中普遍低表達［15］。本課題組研究也顯示，Kin17在乳腺正常上皮細胞Hs-578Bst與MCF-10A中表達較低，該蛋白在MCF-10A細胞受血清刺激增殖后表達升高；而且通過轉染攜帶Kin17基因的重組質粒來上調Kin17表達水平，能明顯促進MCF-10A細胞的增殖速度［16］。因此，Kin17與乳腺上皮細胞的生長增殖密切相關。我們還發(fā)現，該分子在常見乳腺癌細胞系（MDA-MB-231、BT474、MCF-7、SKBr-3等）及臨床乳腺癌標本組織中表達明顯升高，提示其很可能在乳腺癌細胞的快速增殖及癌癥轉化中發(fā)揮重要作用［12］。在本研究中，通過感染攜帶特異性siRNA的病毒重組載體，穩(wěn)定、明顯敲減了MDA-MB-231細胞中的Kin17基因與蛋白表達水平，而且顯著抑制了該乳腺癌細胞的生長增殖速度。因此，沉默Kin17很可能是一種潛在的乳腺癌治療新策略。特別是對于ER-PR-HER-2-表型的患者，Kin17也許是一種潛在的有效靶點。

目前，Kin17在乳腺癌細胞增殖中的調控機制尚有待闡明［8］。我們已證實，上調Kin17表達能促進MCF-10A細胞的DNA復制活性［16］；化療藥物阿霉素能誘發(fā)MCF-10A細胞產生較多的DNA損傷，同時也引起Kin17蛋白反應性升高［12］。因此，Kin17很可能在乳腺上皮細胞加速增殖中支持其DNA復制及損傷修復功能。本前期研究還發(fā)現，上調Kin17能促進MCF-10A細胞中的ERK1/2的磷酸化活性，提示該蛋白也許參與EGFR癌癥信號途徑［16］。本課題組還發(fā)現，上調Kin17表達能促進MCF-10A細胞中的cyclin D1的表達水平［16］。另有學者也證實，上調Kin17能上調肝癌細胞的cyclin D1水平［8］。這充分表明了該蛋白對細胞周期中G1/S轉換的調控作用。對Kin17在乳腺癌細胞中功能及其分子調控機制的深入探究，將有助于揭示乳腺癌細胞快速增殖及癌癥轉化的潛在機制，為乳腺癌治療新方案的摸索提供有力的科學依據。

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Silencing of Kin17 inhibits proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells

SUN Zhenya1，LIANG Lin2，HE Jieting2，WANG Lingling2，ZENG Tao3，4★
（1.Department of Laboratory Medicine，Central Hospital of Longhua New District，Shenzhen，Guangdong，China，518110；2.The First Clinical Medicine College，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；3.Laboratory Medicine Center，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；4.School of Laboratory Medicine，Guangdong Medical University，Dongguan，Guangdong，China，523808）

Objective To explore the effectof Kin17 silencing on the proliferation of breast cancer cells，and assess the potential of Kin17 asanew drug target.Methods MDA-MB-231 cells were infected with the lentiviral recombinant vectors carrying Kin17 siRNA or normal controlled siRNA，and were screened with puromycin.The rates of the positive cells were observed under a fluorescence microscope.Real-time PCR and Western blot assay were performed to detect them RNA level and protein level of Kin17 in MDA-MB-231 cells transfected with the lentiviral recombinant vectors.And the CCK-8 assay was used to test the cell proliferation. Results The infection of the lentiviral recombinant vector carrying Kin17 siRNA stably knocked down the mRNA level and protein level of Kin17，and slowed down the cell grow th significantly in MDA-MB-231 cells. Conclusion Our findings indicate that the silence of Kin17 expression could inhibit the cell proliferation of triple-negative breast cancer cells，andwould bea potential therapeutic target for breast cancer.

Kin17；Gene silence；Breast cancer cell；Cell proliferation；Triple-negative

廣東省醫(yī)學科學技術研究基金項目（A2013622）；廣東省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201512121118）；東莞市醫(yī)療衛(wèi)生科技計劃一般項目（20131051010005）；南方醫(yī)科大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201512121245）

1.深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東，深圳518110 2.南方醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東，廣州510515 3.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗醫(yī)學科，廣東，廣州510515 4.廣東醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，廣東，東莞523808

★通訊作者：曾濤，E-mail：zengt@smu.edu.cn