和玉軍，張 充，錢(qián) 輝，陸兆新，別小妹，趙海珍，呂鳳霞

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶發(fā)酵條件優(yōu)化

和玉軍，張 充，錢(qián) 輝，陸兆新，別小妹，趙海珍，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

為進(jìn)一步提高重組大腸桿菌（pET-23a-pse-LOX）產(chǎn)脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）的酶活力，利用響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、接種量、培養(yǎng)基初始pH值和裝液量對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。在此基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)從7 個(gè)因素中篩選出對(duì)LOX產(chǎn)量具有顯著效應(yīng)的因素為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)基初始pH值，并利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法分析以確定其產(chǎn)酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，即誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為菌液OD600nm達(dá)到1.6、誘導(dǎo)時(shí)間34 h、培養(yǎng)基初始pH 7.0。在此條件下，LOX酶活力為（21 261.60±264.03） U/mL，比優(yōu)化前的（13 553.96±46.64） U/mL提高了56.87%。

脂肪氧合酶；發(fā)酵條件；響應(yīng)面法；Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

和玉軍， 張充， 錢(qián)輝， 等. 重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶發(fā)酵條件優(yōu)化［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 149-155. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615025. http://www.spkx.net.cn

HE Yujun， ZHANG Chong， QIAN Hui， et al. Optimization of fermentation conditions for lipoxygenase production by recombinant Escherichia coli［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 149-155. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615025. http://www.spkx.net.cn

脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12），屬于氧化還原酶［1］，是一類(lèi)含有非血紅素鐵，能夠?qū)Ｒ淮呋趸衏is， cis-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸，形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過(guò)氧化物的雙加氧酶［2］。這種不穩(wěn)定的氫過(guò)氧化物能氧化面筋蛋白質(zhì)形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子聚合，從而達(dá)到增強(qiáng)面筋的作用［3］，同時(shí)LOX還可以通過(guò)偶合反應(yīng)破壞類(lèi)胡蘿卜素的雙鍵結(jié)構(gòu)，起到漂白面粉的作用［4］。由于LOX兼具面粉強(qiáng)筋和漂白的功效，具有替代化學(xué)面粉品質(zhì)改良劑的潛力，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。目前，市場(chǎng)上商品級(jí)LOX多以大豆粉作為酶源，但大豆粉含有多種同工酶，存在成分復(fù)雜、效果不佳等缺點(diǎn)［5］，限制其在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。

通過(guò)LOX基因的克隆與異源表達(dá)，獲得質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)量高、成本低的LOX是可以解決上述問(wèn)題的。其中，來(lái)源于植物、動(dòng)物等真核生物的LOX基因已經(jīng)在大腸桿菌［6］（Escherichia coli，E. coli）、釀酒酵母［7］（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母［8-9］（Pichia pastoris）中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)，但總體產(chǎn)酶水平不高。原核生物來(lái)源的LOX異源表達(dá)同樣面臨表達(dá)量低、難分泌至胞外等問(wèn)題［10］。目前僅有藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacterium）、念珠藻（Nostoc punctiforme）［11］、銅綠假單胞菌［12-13］（Pseudomonas aeruginosa）和魚(yú)腥藻［14-15］（Anabaena）來(lái)源的原核生物L(fēng)OX基因 實(shí)現(xiàn)了在E. coli、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中異源表達(dá)，但產(chǎn)酶水平仍然不高。陸信曜等［13，16］將P. aeruginosa的LOX在大腸桿菌中表達(dá)，獲得了分泌LOX的重組大腸桿菌，并對(duì)其發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行初步優(yōu)化，胞外酶活力為8.4 U/mL。張充等［14，17］克隆魚(yú)腥藻Anabaena sp. PCC 7120基因組中LOX基因，構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體，胞內(nèi)LOX活力達(dá)6 750 U/mL，并轉(zhuǎn)化B. subtilis WB800，實(shí)現(xiàn)LOX在食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的異源分泌表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，章棟梁等［18］對(duì)重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，胞外酶活力最高為167.32 U/mL。

雖然有關(guān)LOX基因的克隆與異源表達(dá)的研究已很多，包括胞內(nèi)和胞外表達(dá)，但LOX產(chǎn)量仍不是很高。為了提高LOX的產(chǎn)量，本研究以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的一株重組大腸桿菌為出發(fā)菌株，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)確定不同因子對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，并利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出對(duì)LOX產(chǎn)量具有顯著效應(yīng)的關(guān)鍵因子，然后利用響應(yīng)曲面法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高LOX產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種、培養(yǎng)基與試劑

重組大腸桿菌pET-23a-pse-LOX，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程研究室構(gòu)建。

LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：大豆蛋白胨25、酵母浸膏15、甘油6、KH2PO45、MgSO4?7H2O 2、MnCl2?4H2O 0.05，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

胰蛋白胨、酵母提取物 青島生工生物科技有限公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）北京索萊寶科技有限公司；亞油酸 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Orion 3 STAR pH計(jì) 美國(guó)Thermo公司；SX-700高壓蒸汽滅菌器 日本TOMY公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HYG-A全溫?fù)u瓶柜 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；JY91ⅡDN超聲波破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；GXZ-9240MBE鼓風(fēng)干燥箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3方法

1.3.1菌種活化

將甘油管保藏的重組菌（-70 ℃）轉(zhuǎn)接到LB平板上，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，待平板上長(zhǎng)出單菌落后，將單菌落轉(zhuǎn)接至盛有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h左右至對(duì)數(shù)期備用。

1.3.2搖瓶培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至一定菌體密度后在設(shè)定的發(fā)酵條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3菌體密度與菌體干重的測(cè)定

將一定體積的發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min后棄上清，菌體用蒸餾水洗滌1～2 次，再用蒸餾水復(fù)溶后以蒸餾水為空白測(cè)定菌體密度OD600nm，同時(shí)將菌液在相同條件下離心、洗滌后，將其放置在105 ℃的干燥箱中恒溫干燥至恒質(zhì)量（Δm≤0.3 mg），繪制菌體干重與菌體密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4重組脂肪氧合酶的制備

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液在8 000 r/min離心10 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.3 mol/L NaCl和體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton X-100混合制備）重懸菌體，超聲波破碎菌體（400 W，超聲1 s，停頓2 s，共超聲30 min），4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液作為粗酶液［19］。

1.3.5酶活力的測(cè)定

亞油酸底物的制備［20］：取25 μL吐溫-20分散于8 mL脫氧蒸餾水中，混勻后加入27 μL亞油酸，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡，用1.1 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液使其澄清，定容到50 mL容量瓶中，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｃ富盍y(cè)定反應(yīng)體系為：pH 6.0的磷酸鹽緩沖液2.78 mL，酶液20 μL，亞油酸鈉200 μL，混勻后放入水浴中并開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)3 min測(cè)定234 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化。LOX酶活力定義［21］：35 ℃條件下1 min內(nèi)3 mL反應(yīng)體系在234 nm波長(zhǎng)處的吸光度增加0.001作為一個(gè)酶活力單位U。

1.3.6單因素試驗(yàn)

1.3.6.1誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定

根據(jù)菌體生長(zhǎng)曲線，分別在不同的菌體生長(zhǎng)期（OD600nm=0.4、1.5、2.6、3.4、4.2）添加誘導(dǎo)劑，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)；在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期添加不同質(zhì)量濃度的誘導(dǎo)劑（10、50、100、200、400 μg/mL），確定誘導(dǎo)劑最適質(zhì)量濃度；在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期添加一定濃度誘導(dǎo)劑，分別誘導(dǎo)不同時(shí)間（8、16、24、32、40 h），確定適宜的誘導(dǎo)時(shí)間；添加誘導(dǎo)劑后，分別在不同溫度條件下（16、25、30、37 ℃）誘導(dǎo)，確定最適誘導(dǎo)溫度。

1.3.6.2接種量對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響

將培養(yǎng)好的種子液按體積分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%的接種量接入100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為1.5左右，添加IPTG使其終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，誘導(dǎo)17 h后取出離心、破碎獲得粗酶液，測(cè)定酶活力。

1.3.6.3培養(yǎng)基初始pH值對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響

將配制的培養(yǎng)基在滅菌前分別調(diào)節(jié)pH值為5.0、6.0、7.0、8.0，然后在16 ℃誘導(dǎo)17 h，經(jīng)離心、破碎處理后測(cè)定粗酶液的酶活力。

1.3.6.4裝液量對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響

在250 mL搖瓶中分別裝入40、60、80、100、120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在相同條件下16 ℃誘導(dǎo)17 h后離心收集菌體，破碎后測(cè)定上清液酶活力。

1.3.7發(fā)酵條件的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件的關(guān)鍵因子篩選，其中X1～X4為誘導(dǎo)條件，X5～X7為培養(yǎng)條件，響應(yīng)值為酶活力，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，試驗(yàn)因素水平及代碼見(jiàn)表1。

表1　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及代碼Table 1 Levels and codes of variables used for Plackett-Burman experimental design sign

1.3.8響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)確定發(fā)酵條件各因素的影響順序，選取前3 個(gè)主要影響因素：誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)基初始pH值，采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)一步優(yōu)化，各因子、代碼及水平見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及代碼Table 2 Levels and codes of variables used for Box-Behnken response surface methodology

2　結(jié)果與分析

2.1誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定

2.1.1重組菌最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定

通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中測(cè)定重組菌的生長(zhǎng)曲線，確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的范圍，分別選取OD600nm為0.4、1.5、2.6、3.4、4.2時(shí)添加終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的IPTG作為誘導(dǎo)劑，16 ℃誘導(dǎo)17 h后測(cè)定LOX酶活力和菌體干重，結(jié)果如圖1所示。

圖1　菌株最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定Fig. 1 Determination of the optimal starting time of induction

由圖1可知，在不同時(shí)期添加誘導(dǎo)劑都能誘導(dǎo)表達(dá)，但LOX的產(chǎn)量相差甚大。當(dāng)OD600nm達(dá)到1.5左右時(shí)，添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，酶活力最高，為（18 710.40±278.32） U/mL。當(dāng)OD600nm繼續(xù)增加，菌體干重下降緩慢，而酶活力明顯下降。

2.1.2誘導(dǎo)劑最適質(zhì)量濃度的確定

分別選擇IPTG的終質(zhì)量濃度為10、50、100、200、400 μg/mL，在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期添加后于16 ℃誘導(dǎo)17 h，取出處理后測(cè)定LOX酶活力和菌體干重，結(jié)果如圖2所示。

圖2　IPTG最適質(zhì)量濃度的確定Fig. 2 Determination of the optimal concentration of IPTG

由圖2可知，誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)時(shí)，目的蛋白的表達(dá)隨誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)超過(guò)100 μg/mL時(shí)，LOX酶活力反而出現(xiàn)一定的下降，表明過(guò)高的誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度對(duì)目的蛋白的表達(dá)有一定的抑制作用。這可能是由于IPTG的質(zhì)量濃 度過(guò)高一方面抑制了菌體生長(zhǎng)，另一方面IPTG的劇烈誘導(dǎo)導(dǎo)致目的蛋白合成速率太快，從而在胞內(nèi)形成不溶性包涵體［22］。菌體干重的變化趨勢(shì)與酶活力大致相同。

2.1.3誘導(dǎo)時(shí)間的確定

在重組菌生長(zhǎng)到OD600nm為1.5左右時(shí)，加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的IPTG，在16 ℃條件下分別誘導(dǎo)8、16、24、32、40 h，取樣測(cè)定酶活力和菌體干重，結(jié)果如圖3所示。

圖3　IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的確定Fig. 3 Determination of the induction duration of IPTG

圖4　誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)LOX表達(dá)影響的SDS-PAGEE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the effect of induction duratione on LOX expression

由圖3可知，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)24 h后發(fā)酵液中的酶活力達(dá)到最高，為（20 383.12±189.39） U/mL。誘導(dǎo)8 h時(shí)，酶活力較低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸增高，24 h時(shí)達(dá)到最大，隨后開(kāi)始緩慢下降。這可能是由于宿主細(xì)胞中蛋白酶將異源蛋白降解，使目標(biāo)蛋白表達(dá)水平降低，酶活力下降。菌體干重在整個(gè)過(guò)程中表現(xiàn)為持續(xù)增長(zhǎng)，待誘導(dǎo)24 h左右，生長(zhǎng)速率有所下降，表明菌體開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖4可知，誘導(dǎo)24 h時(shí)對(duì)應(yīng)的條帶中目的蛋白的表達(dá)量最高，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短或者過(guò)長(zhǎng)都不利于目的蛋白的積累。

2.1.4誘導(dǎo)溫度的確定

溫度是保證微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所需各種酶活性的重要條件，同時(shí)是影響重組蛋白表達(dá)的一個(gè)重要因素，因此在發(fā)酵過(guò)程中必須控制合適的溫度。本研究分別在16、25、30、37 ℃誘導(dǎo)菌體17 h，LOX酶活力和菌體干重的結(jié)果如圖5所示。

圖5　誘導(dǎo)溫度的確定Fig. 5 Determination of the optimal induction temperature

由圖5可知，采用16 ℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，酶活力最高為（19 612.80±172.00） U/mL，而溫度較高時(shí)，LOX的表達(dá)受到明顯抑制，30 ℃和37 ℃條件下的酶活力基本為零。菌體干重變化不大，隨著溫度升高，25 ℃后基本無(wú)顯著差異。這表明低溫誘導(dǎo)更有利于重組菌表達(dá)目的蛋白，這可能是因?yàn)楦邷叵沦|(zhì)粒穩(wěn)定性降低以及重組酶的合成速率太快而在胞內(nèi)形成包涵體［23］。

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定重組菌誘導(dǎo)表達(dá)條件，即誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600nm達(dá)到1.5，IPTG質(zhì)量濃度為100 μg/mL，誘導(dǎo)時(shí)間24 h，誘導(dǎo)溫度16 ℃。在此條件下，菌體產(chǎn)生的LOX酶活力更高。

2.2接種量對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響

接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。分別將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%、3%、5%、7%、9%的接種量接入100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果如圖6所示。

圖6　接種量對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響Fig. 6 Effect of inoculum size on cell growth and LOX production

由圖6可知，無(wú)論是LOX酶活力還是菌體干重，在接種量為5%時(shí)兩者均最高，接種量太低或者太高都不利于重組菌的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)。

2.3培養(yǎng)基初始pH值對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響很大，發(fā)酵過(guò)程中需要維持一定的pH值以保證微生物的正常代謝。在配制發(fā)酵培養(yǎng)基后，將初始pH值分別調(diào)至5.0、6.0、7.0和8.0進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定其LOX酶活力和菌體干重，結(jié)果如圖7所示。

圖7　培養(yǎng)基初始pH值對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響Fig. 7 Effect of medium initial pH on cell growth and LOX production

由圖7可知，培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶影響顯著，兩者趨勢(shì)基本一致，都呈現(xiàn)出先迅速上升，在pH 7.0時(shí)LOX酶活力和菌體干重達(dá)最大，分別為（22 780.80±123.55） U/mL和（5.336±0.020） g/L，隨后兩者都開(kāi)始降低。因此，培養(yǎng)基的初始pH值應(yīng)控制在7.0。

2.4裝液量對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響

大腸桿菌屬于兼性厭氧菌，氧氣的供應(yīng)常常是發(fā)酵實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ闹匾拗埔蛩刂唬b液量是影響溶解氧的一個(gè)重要因素。

圖8　裝液量對(duì)LOX產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響Fig. 8 Effect of medium volume on cell growth and LOX production

由圖8可知，LOX酶活力隨著裝液量增加先上升后逐漸降低，當(dāng)裝液量為60 mL/250 mL時(shí)，最有利于重組菌產(chǎn)酶。菌體干重在裝液量為40 mL/250 mL時(shí)最高，隨著裝液量的增加，菌體干重持續(xù)降低。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是隨著裝液量增加，發(fā)酵液與空氣的接觸面積相對(duì)減小，搖瓶發(fā)酵系統(tǒng)的供氧能力下降；同時(shí)隨搖瓶裝液量增加，單位體積發(fā)酵液中的溶氧降低更為明顯，因此發(fā)酵液中溶氧過(guò)低阻 礙細(xì)胞生長(zhǎng)和外源蛋白的表達(dá)；另外還會(huì)導(dǎo)致底物的不完全氧化產(chǎn)生多種有機(jī)酸，如乙酸等，這些因素都有可能影響LOX的表達(dá)及菌體生長(zhǎng)［24］。2.5 發(fā)酵條件的Plackett-Burman試驗(yàn)

采用Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)影響發(fā)酵產(chǎn)酶的7 個(gè)因素進(jìn)行篩選，試驗(yàn)結(jié)果及預(yù)測(cè)值見(jiàn)表3，顯著性分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及預(yù)測(cè)值Table 3 Plackett-Burman experimental design with actual and predicted values of LOX activity

表4　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析及其顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance and significance test of Plackett-Burman experimental design model

由表4可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著（P=0.000 9），對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著影響的因子包括誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、接種量和培養(yǎng)基初始pH值，其中誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)基初始pH值的影響極顯著（P＜0.01），而誘導(dǎo)溫度和裝液量的影響是不顯著的。在上述5 個(gè)具有顯著影響的因子中，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度和誘導(dǎo)時(shí)間均為正效應(yīng)，所以在后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)將其中心點(diǎn)適當(dāng)上移，而接種量和培養(yǎng)基初始pH值為負(fù)效應(yīng)，說(shuō)明它們?cè)谒较孪迺r(shí)更有利于重組菌產(chǎn)酶，中心點(diǎn)應(yīng)適當(dāng)下移。

2.6響應(yīng)面試驗(yàn)

2.6.1預(yù)測(cè)模型建立及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選取誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)基初始pH值為試驗(yàn)因素，以LOX酶活力Y為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及預(yù)測(cè)值見(jiàn)表5。利用Design-Expert分析軟件對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程為：Y=21 900.78+ 1 894.86A+1 637.21B-499.21C+1 128.60AB-813.78AC+98.50BC-11 938.16A2-6 146.17B2-7 369.81C2。

表5　響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及預(yù)測(cè)值Table 5 Box-Behnken design with actual and predicted values of LOX activity

表6　回歸模型方差分析及其顯著性檢驗(yàn)Table 6 Analysis of variance and significance test of Box-Behnken regression model

由表6可知，該模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)（P=0.993 0＞0.05）極不顯著，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型擬合度較高。通過(guò)P檢驗(yàn)，一次項(xiàng)A、B及二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)酶活力大小有極顯著影響，AB、AC對(duì)酶活力大小的影響達(dá)到顯著水平。模型的校正決定系數(shù)=0.993 7，表明該模型能夠解釋99.37%的變異，決定系數(shù)R2=0.997 2，表明重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間有很好的擬合度。因此，可以用該模型對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.6.2響應(yīng)面分析

由回歸方程得到誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)基初始pH值這3 個(gè)因素間交互作用對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，如圖9所示。

圖9　各因素交互作用對(duì)LOX酶活力的影響Fig. 9 Effects of interactions among experimental factors on LOX activity

由圖9a可知，響應(yīng)面圖的曲面形狀較圓，等高線接近圓形，說(shuō)明誘導(dǎo)時(shí)機(jī)與誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)LOX酶活力的交互影響不顯著，同樣，圖9b中誘導(dǎo)時(shí)機(jī)與培養(yǎng)基初始pH值對(duì)LOX酶活力的交互作用不顯著。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)處于最佳時(shí)間點(diǎn)時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間與培養(yǎng)基初始pH值對(duì)LOX酶活力的交互影響如圖9c所示。由于其等高線圖呈橢圓形，所以?xún)烧叩慕换プ饔檬秋@著的。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)和培養(yǎng)基初始pH值的升高，LOX酶活力出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為34 h，培養(yǎng)基的初始pH值為7.0時(shí)，酶活力達(dá)到最高。從響應(yīng)面圖中可以看到，誘導(dǎo)時(shí)間曲面變化較培養(yǎng)基初始pH值曲面變化更陡，表明誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)于重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響更顯著。

采用Design-Expert軟件分析回歸方程，得到曲面的極值點(diǎn)為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600nm達(dá)到1.6、誘導(dǎo)時(shí)間34 h、培養(yǎng)基初始pH 7.0，LOX酶活力預(yù)測(cè)值為22 108.30 U/mL。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，在最佳條件下進(jìn)行了3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，LOX酶活力為（21 261.60±264.03） U/mL，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為3.982%，表明回歸方程擬合度較好，可應(yīng)用于重組大腸桿菌（pET-23a-pse-LOX）產(chǎn)LOX發(fā)酵條件的優(yōu)化。

3　結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從7 個(gè)因素中篩選出對(duì)LOX產(chǎn)量具有顯著影響的3 個(gè)因子，即誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)基的初始pH值。利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)，以LOX酶活為響應(yīng)值，建立三因素三水平的響應(yīng)面模型，通過(guò)對(duì)其顯著性及交互作用的分析，求解回歸方程，獲得最優(yōu)發(fā)酵條件為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為發(fā)酵液OD600nm達(dá)到1.6、誘導(dǎo)時(shí)間34 h、培養(yǎng)基初始pH 7.0，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知LOX酶活力為（21 261.60±264.03） U/mL，與預(yù)測(cè)值22 108.30 U/mL基本吻合，比優(yōu)化前的（13 553.96±46.64） U/mL提高了56.87%，脂肪氧合酶的發(fā)酵水平顯著提高，將為L(zhǎng)OX工業(yè)化生產(chǎn)和替代化學(xué)面粉改良劑溴酸鉀及過(guò)氧化苯甲酰提供依據(jù)。

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Optimization of Fermentation Conditions for Lipoxygenase Production by Recombinant Escherichia coli

HE Yujun， ZHANG Chong， QIAN Hui， LU Zhaoxin， BIE Xiaomei， ZHAO Haizhen， L? Fengxia*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

With the aim to further enhance lipoxygenase （LOX） activity produced by recombinant E. coli， response surface methodology was used to optimize the fermentation conditions. First of all， we explored the effects of starting time of induction， inducer concentration， induction duration， induction temperature， inoculum size， medium initial pH and medium volume on LOX production by single factor tests. Three factors with signifi cant impacts on LOX activity including starting time of induction， induction time and medium initial pH were selected out of these seven factors by using Plackett-Burman design. Simultaneously， the optimal conditions for LOX production were determined by Box-Behnken design and response surface methodology as induction starting at OD600nmof 1.6 and lasting for 34 h and medium initial pH of 7.0. The LOX activity was （21 261.60 ± 264.03） U/mL under these conditions， which was improved by 56.87% than that before optimization， （13 553.96 ± 46.64） U/mL.

lipoxygenase； fermentation conditions； response surface methodology； Plackett-Burman design

10.7506/spkx1002-6630-201615025

TS201.3

A

1002-6630（2016）15-0149-07

2016-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31470095）；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（BE2011390）

和玉軍（1990—），男，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：2013108059@njau.edu.cn

呂鳳霞（1963—），女，教授，博士，主要從事酶工程研究。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn

引文格式：