張英慧，王丙云，黃劍波，計(jì)慧琴，馬艷玲，鐘希瓊，董華強(qiáng)

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院北院食品安全系，廣東 南海 528231；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院北院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東 南海 528231）

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷進(jìn)入巨噬細(xì)胞的熒光檢測(cè)

張英慧1，王丙云2，黃劍波1，計(jì)慧琴2，馬艷玲1，鐘希瓊1，董華強(qiáng)1

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院北院食品安全系，廣東 南海 528231；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院北院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東 南海 528231）

利用熒光技術(shù)探索矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin 3-O-glucoside，C3G）在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中的分布。首先采用熒光分光光度法掃描C3G的特異激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，再利用激光共聚焦技術(shù)探討C3G進(jìn)入小鼠和人巨噬細(xì)胞的過(guò)程以及C3G在細(xì)胞中的定位，并分析C3G孵育時(shí)間對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化的影響。結(jié)果表明：在488 nm和520 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，C3G孵育15 min的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)開始呈現(xiàn)綠色和紅色熒光，并且隨著孵育時(shí)間的變化，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，其中孵育60 min可觀察到熒光布滿細(xì)胞核，其熒光強(qiáng)度是孵育前的6.45 倍。研究表明采用特異波長(zhǎng)的激光共聚焦斷層掃描技術(shù)可示蹤到花色苷在干預(yù)細(xì)胞內(nèi)的分布，結(jié)果顯示花色苷C3G可快速穿過(guò)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜和核膜，直達(dá)細(xì)胞核。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷；巨噬細(xì)胞；激光共聚焦顯微技術(shù)；熒光分光光度法

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin 3-O-glucoside，C3G）類屬于植物中的花青素類，為呈色物質(zhì)，其天然提取物粉末為紫紅色，是自然界分布最廣的花色苷。盡管大量的研究證實(shí)C3G具有抗氧化［1］、降血脂［1］、抗腫瘤［2］、抗炎癥［3］、抑制血小板凝集［4］、預(yù)防糖尿病［5］、減肥［6］、保護(hù)視力［7］和保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞［8］等諸多生理活性，但其在機(jī)體細(xì)胞中的存在部位和結(jié)合位點(diǎn)目前尚無(wú)定論。

高效液相色譜是目前普遍應(yīng)用的檢測(cè)C3G的方法，血液中C3G的含量可采用高效液相色譜的方法檢測(cè)［9-10］，但是這種方法應(yīng)用于體外培養(yǎng)細(xì)胞中C3G的檢測(cè)有一定的難度，由于細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量有限，干預(yù)后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的C3G有限，C3G的豐度往往低于儀器的靈敏度。另外，高效液相色譜也很難檢測(cè)到C3G在細(xì)胞中的定位。再加上細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核的分離過(guò)程必然增加了C3G的損失。Agati等［11］報(bào)道花青素為植物細(xì)胞中的熒光物質(zhì)，具有特定的吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，例如葡萄中花青素的特異吸收波長(zhǎng)為540 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為685 nm，并利用這一特性建立了植物活體中該類色素的檢測(cè)方法；Lin Yakang等［12］利用包括花青素在內(nèi)的類黃酮物質(zhì)的熒光研究了植物化學(xué)物在玉米細(xì)胞中的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)。

激光共聚焦顯微鏡作為近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的大型生物學(xué)分析儀器，它借助熒光標(biāo)記方法，采用激光作為光源，使激光經(jīng)過(guò)照明針孔后形成點(diǎn)光源，對(duì)焦平面每一點(diǎn)進(jìn)行掃描，并在共焦針孔處成像，大大提高了圖像分辨率和檢測(cè)靈敏度，具有活細(xì)胞動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、斷層掃描及三維圖像重建等功能，可對(duì)所觀察細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的物質(zhì)進(jìn)行定量、定性、定位和時(shí)空監(jiān)測(cè)［13-14］。

本實(shí)驗(yàn)綜合借鑒以上方法，首先掃描了C3G特異的熒光波長(zhǎng)，并根據(jù)特征波長(zhǎng)進(jìn)行激光共聚焦斷層掃描，嘗試觀察C3G是否可以進(jìn)入小鼠和人的巨噬細(xì)胞中。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

15 只SPF級(jí)C57BL/6J雌性小鼠（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002），體質(zhì)量為18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；THP-1細(xì)胞株 美國(guó)培養(yǎng)物典藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

RPMI1640培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司。

C3G 挪威Polyphenols Laboratories AS公司；豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-12-myristate-13- acetate，PMA）、臺(tái)盼藍(lán)、多聚甲醛 美國(guó)Sigma公司；抗生素（青霉素和鏈霉素） 美國(guó)Invitrogen公司；0.01 mol/L pH 7.2～7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning公司；玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿 美國(guó)MatTek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Haraeus公司；熒光分光光度計(jì)美國(guó)Varian公司；倒置顯微鏡 重慶光學(xué)儀器廠；冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；FV500-IX81 OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 C3G熒光波長(zhǎng)的掃描

將C3G溶解到PBS中，配成終濃度為1 mmol/L的溶液，利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)的掃描，確定C3G特異的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。對(duì)照組為PBS溶液。

1.3.2 激光共聚焦顯微鏡掃描C3G在巨噬細(xì)胞中的分布

1.3.2.1 檢測(cè)C3G在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的分布

1）小鼠腹腔注射1 mL無(wú)菌液體石蠟，3 d后收集腹部巨噬細(xì)胞。具體方法為：小鼠腹部消毒，沿中線注入3～4 mL冰中預(yù)冷的無(wú)菌PBS，輕輕按摩腹部5 min。無(wú)菌剪開腹壁，用吸管吸出滲出液，再用同樣體積的預(yù)冷的PBS沖洗腹腔2～3 次，合并滲出液于離心管中，4 ℃、800 r/min條件下離心5 min，去上清液。用預(yù)冷的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2～3 次，每次4 ℃、800 r/min 離心5 min，去上清液，用預(yù)冷的適量RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105/mL，加于含蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板中，于玻片上爬壁4 h。

2）棄去未貼壁細(xì)胞，加含50 μmol/L C3G的體積分?jǐn)?shù)10% FBS-RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)0～1 h。分別取0、15、30、45、60 min 各時(shí)段進(jìn)行體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定5 min。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3 次。

3）以FV500-IX81 OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡600 倍水鏡斷層掃描固定后的細(xì)胞，激發(fā)波長(zhǎng)分別設(shè)置為488 nm和520 nm。操作設(shè)置為：PmT1881，Gain 2.4，C.A 715，MAr220.5%；PmT2791，Gain 2.0，offset 5%，C.A 580nm，He 50.0%。圖像生成采用FluoView軟件。

1.3.2.2 檢測(cè)C3G在人巨噬細(xì)胞株THP-1中的分布

1）將人THP-1單核/巨噬細(xì)胞以2.0×105/孔接種于6孔玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿，以含100 ng/mL PMA、體積分?jǐn)?shù)10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640在體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃條件下誘導(dǎo)分化貼壁48 h。

2）PBS洗3 次，加含50 μmol/L C3G的10% FBSRPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)0～1 h。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3 次。

3）以FV500-IX81 OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡600 倍水鏡斷層掃描干預(yù)后的細(xì)胞，激發(fā)波長(zhǎng)分別設(shè)置為488 nm和520 nm。操作設(shè)置同1.3.2.1節(jié)3），利用FluoView軟件合成圖像并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS13.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以±s表示。多組均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用Tukey's honestly法，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 C3G熒光波長(zhǎng)的掃描

利用熒光分光光度計(jì)掃描1 mmol/L C3G-PBS溶液的發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)。由圖1可知，1 mmol/L C3G-PBS溶液在488 nm激發(fā)下于520 nm處有弱的熒光發(fā)射（圖1a），在520 nm激發(fā)下于630 nm左右有弱的熒光發(fā)射（圖1c），而PBS在相同的激發(fā)條件下無(wú)熒光（圖1b、d）。

2.2 激光共聚焦顯微鏡斷層掃描檢測(cè)C3G在巨噬細(xì)胞中的分布

2.2.1 C3G在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的分布

激光共聚焦斷層掃描技術(shù)可逐層觀察細(xì)胞的橫切面，圖2顯示了50 μmol/L C3G孵育小鼠腹腔巨噬細(xì)胞0～60 min，激光共聚焦顯微鏡觀察到的C3G的熒光分布。C3G在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下呈現(xiàn)綠色熒光，在520 nm激發(fā)波長(zhǎng)下呈現(xiàn)紅色熒光，紅色熒光的強(qiáng)度高于綠色熒光。孵育小鼠巨噬細(xì)胞15 min左右，即有帶熒光的C3G進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增加，孵育60 min左右C3G甚至可到達(dá)小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核。

2.2.2 C3G在人巨噬細(xì)胞株THP-1中的分布

激光共聚焦顯微鏡觀察到50 μmol/L C3G孵育人巨噬細(xì)胞株THP-1 30 min，僅有弱的熒光物質(zhì)聚集于細(xì)胞膜周圍，45 min時(shí)細(xì)胞中熒光略強(qiáng)，60 min繼續(xù)增強(qiáng)，并有部分細(xì)胞表現(xiàn)為已染核（圖3）。以FluoView軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，C3G孵育THP-1細(xì)胞的時(shí)間延長(zhǎng)到60 min，細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度為孵育前的6.45 倍（表1）。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C3G 具有特定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，激光共聚焦顯微鏡斷層掃描結(jié)果表明C3G可以進(jìn)入小鼠和人的巨噬細(xì)胞，在488 nm和520 nm的光波激發(fā)下，C3G在細(xì)胞內(nèi)分別呈現(xiàn)綠色和紅色熒光，雖然熒光強(qiáng)度較弱。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)C3G的攝取能力高于人巨噬細(xì)胞系THP-1，孵育15 min即可呈現(xiàn)熒光，而分化的THP-1細(xì)胞只有在孵育30 min以后才呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-熒光強(qiáng)度梯度變化。有研究者發(fā)現(xiàn)小鼠在灌胃果汁30 min內(nèi)可利用高效液相色譜的方法在血液和腦組織檢測(cè)到花色苷的濃度高峰［9］，人在飲用富含花色苷的飲料后1～2 h內(nèi)血液中C3G可達(dá)到高峰［10，15］，F(xiàn)ernandes等［16］報(bào)道花青素可以穿過(guò)中度分化的胃腺癌細(xì)胞MKN-28，提示花青素可能會(huì)穿過(guò)胃壁屏障，這也許是花色苷迅速出現(xiàn)在血液中的原因。花色苷如此快的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)速率與本實(shí)驗(yàn)在巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到的結(jié)果相一致。

利用熒光檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)類黃酮化合物的吸收方法曾經(jīng)應(yīng)用于矢車菊素的結(jié)構(gòu)類似物槲皮素的研究上，槲皮素具有黃酮醇的結(jié)構(gòu)，植物的花青素和黃酮醇都以二氫黃酮醇為前體物由酶催化生成，二氫黃酮醇還原酶是植物體內(nèi)產(chǎn)生花青素的關(guān)鍵酶。酸性溶液中的還原反應(yīng)可使槲皮素轉(zhuǎn)化為矢車菊素。Kuo等［17］早在1996年利用熒光顯微鏡檢測(cè)了經(jīng)100 μmol/L槲皮素孵育40 min的Caco-2細(xì)胞，認(rèn)為槲皮素在細(xì)胞內(nèi)有積累，其最大發(fā)射峰為550 nm，并且槲皮素主要分布于核仁周圍。Walgren等［18］證明了槲皮素-4'-β-葡萄糖苷15 min即可進(jìn)入Caco-2細(xì)胞，并呈現(xiàn)出熒光，而其代謝物槲皮素-3-硫酸酯則沒(méi)有熒光，說(shuō)明分子的極性和結(jié)構(gòu)的改變影響熒光的產(chǎn)生。Nifli等［19］利用另一個(gè)細(xì)胞系HepG2檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)攝的槲皮素在488 nm紫外光激發(fā)下，于500～540 nm波長(zhǎng)處有特異的熒光，配合質(zhì)譜分析認(rèn)為天然的槲皮素是孵育初期細(xì)胞內(nèi)的主要形式，也是熒光的來(lái)源，雖然在15 min后出現(xiàn)少量的甲基化代謝物，但是并未檢測(cè)到槲皮素的氧化衍生物。

目前并未見(jiàn)有關(guān)C3G在培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中自發(fā)熒光的報(bào)道。本研究表明C3G在巨噬細(xì)胞中不但類似于槲皮素-4'-β-葡萄糖苷發(fā)射綠色熒光，還可以發(fā)射紅色熒光，而且紅色熒光的強(qiáng)度明顯高于綠色熒光。

C3G在細(xì)胞內(nèi)不同部位呈現(xiàn)多種生物活性，例如C3G可降低低氧環(huán)境下人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中自由基水平的增加，減緩氧化應(yīng)激，并抑制血管生成和細(xì)胞凋亡［20］；C3G可降低細(xì)胞內(nèi)自由基的生成，抑制高糖誘導(dǎo)的線粒體膜電位損傷，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)促凋亡因子Bax的表達(dá)［21］；C3G可以降低糖尿病小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平［22］；研究表明C3G可以通過(guò)氫鍵和疏水作用力直接結(jié)合在小牛胸腺DNA上，并自發(fā)地保護(hù)DNA免受自由基的損傷［23］，C3G還可抑制赭曲霉素A誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞的DNA損傷［24］；前期研究表明C3G可以激活多個(gè)細(xì)胞核受體報(bào)告基因的表達(dá)［25］，本研究檢測(cè)到C3G可進(jìn)入細(xì)胞核，提示了C3G作為核受體的激動(dòng)劑發(fā)揮作用或直接調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)的可能性。

本研究利用熒光分光光度計(jì)掃描1 mmol/L C3G-PBS溶液的發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)，確定1 mmol/L C3G-PBS溶液在488 nm激發(fā)下有弱的熒光發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，在520 nm激發(fā)下有弱的630 nm左右的熒光發(fā)射波長(zhǎng)。利用激光共聚焦顯微鏡斷層掃描C3G在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞株THP-1中的分布。檢測(cè)結(jié)果表明，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)C3G的攝取能力高于人巨噬細(xì)胞THP-1。無(wú)論是小鼠巨噬細(xì)胞還是人巨噬細(xì)胞THP-1，C3G進(jìn)入細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而逐漸增加，并可穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核中，其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制和C3G與細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)的相互作用關(guān)系有待深入探討。

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Fluorescence Detection of the Entry of Cyanidin-3-O-Glucoside into Macrophages

ZHANG Yinghui1， WANG Bingyun2， HUANG Jianbo1， JI Huiqin2， MA Yanling1， ZHONG Xiqiong1， DONG Huaqiang1
（1. Department of Food Safety， Foshan University （Northern Campus）， Nanhai 528231， China；2. Department of Veterinary Medicine， Foshan University （Northern Campus）， Nanhai 528231， China）

The distribution of cyanidin-3-O-glucoside （C3G） in cultured mouse and human macrophages was detected with fluorescence technique. First， the specific excitation wavelength and emission wavelength of C3G were scanned with fluorescence spectrophotometric assay. Then， a confocal laser scanning microscopy was utilized to investigate the entry process of C3G into cultured mouse macrophages and human macrophage THP-1 cells， and to trace the location of C3G as well as the change in fluorescence intensity in the cells during incubation. The results showed that green and red fluorescence in macrophages after 15 min C3G incubation could be detected with light excitation at 488 nm and 520 nm， respectively. The fluorescence signals were enhanced in the cells as the incubation time was prolonged. The special fluorescence appeared in nuclei when the cells were treated with C3G for 60 min， and the average fluorescence intensity was enhanced by 6.45 folds when C3G incubation time was increased up to 60 min. These results indicated that the distribution of C3G in cells during incubation could be traced with laser scanning confocal microscopy assay. It was concluded that C3G could pass rapidly through the cell membrane and nuclear membrane of macrophages， and entered directly the cell nucleus.

cyanidin-3-O-glucoside； macrophages； confocal laser scanning microscopy； fluorescence spectrophotometric assay

10.7506/spkx1002-6630-201609037

TS201.4

A

1002-6630（2016）09-0198-05

張英慧， 王丙云， 黃劍波， 等. 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷進(jìn)入巨噬細(xì)胞的熒光檢測(cè)［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 198-202. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609037. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Yinghui， WANG Bingyun， HUANG Jianbo， et al. Fluorescence detection of the entry of cyanidin-3-O-glucoside into macrophages［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 198-202. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609037. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目面上項(xiàng)目（31071537）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011A030100018）；佛山市科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014GA000425）

張英慧（1974—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：zhang_ying-hui@163.com