劉春曉，李佳宇，劉乃齊，劉立杰，張建麗，白 英*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

內(nèi)蒙古錫林郭勒盟地區(qū)傳統(tǒng)奶油制品中產(chǎn)共軛亞油酸乳酸菌的分離篩選與鑒定

劉春曉，李佳宇，劉乃齊，劉立杰，張建麗，白 英*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

本實驗從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟地區(qū)傳統(tǒng)奶油制品中分離篩選共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）高產(chǎn)乳酸菌。采用紫外分光光度法檢測菌株發(fā)酵液中CLA含量，篩選出高產(chǎn)菌株，分析其菌落特征、細胞形態(tài)及生理生化特性，并結合16S rDNA全序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定其種屬。結果表明，從樣品中共篩出20 株產(chǎn)CLA菌株，當亞油酸（linoleic acid，LA）添加量為0.06%，接種量為2%時，分離自鑲黃旗酸油的11 株產(chǎn)CLA菌株中，菌株HS4產(chǎn)量最高，為23.586 μg/mL，轉化率為7.86%，經(jīng)鑒定其為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）；分離自正鑲藍旗稀奶油的9 株產(chǎn)CLA菌株中，菌株LX5產(chǎn)量最高，為20.508 μg/mL，轉化率為6.84%，經(jīng)鑒定其為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。

共軛亞油酸；傳統(tǒng)奶油制品；乳酸菌；篩選；鑒定

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是含有順式或反式共軛雙鍵的十八碳二烯酸，是亞油酸（cis9，cis12-C18∶2，linoleic acid，LA）的一組位置和構象異構體的總稱，其中以cis9，trans11-CLA和trans10，cis12-CLA為主。CLA具有抗癌、抗動脈粥樣硬化、降低脂肪沉積、提高免疫力、促進生長等生理功能，具有廣泛的應用前景［1-2］。天然CLA主要來自反芻動物瘤胃中的溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）對亞油酸的異構化作用，產(chǎn)量較少，且該菌為嚴格厭氧菌，不易培養(yǎng)，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)［3］。目前多采用堿性異構化法生產(chǎn)CLA，產(chǎn)量大，效率高，但得到一系列具有位置和幾何異構體的CLA混合物，難以人為控制，且食用安全性較低［4］。近年來，人們發(fā)現(xiàn)微生物合成的CLA異構體具有組成形式單一、生理活性高、無毒副作用等特點，因此分離篩選出具高產(chǎn)CLA能力的乳酸菌逐步成為研究的熱點。

目前多數(shù)研究者從酸菜、奶酪、動物瘤胃與腸道中分離產(chǎn)CLA菌株，如張中義等［5］從傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜汁中分離出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、方麗等［6］從東北傳統(tǒng)酸菜汁中分離出鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、羅玉芬［7］從自制泡菜中篩選出明串珠菌（Leuconostoc sp.）、秦敏江［8］從奶酪中篩選出費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）、Gurovica等［9］從魚腸道中分離出戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、黃翠麗等［10］從內(nèi)蒙古鄂爾多斯山羊瘤胃中分離出嬰兒鏈球菌（Streptococcus infantarius）。本實驗以采集自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟地區(qū)的傳統(tǒng)奶油制品為原料，利用溴甲酚紫平板進行初篩，以紫外分光光度法檢測菌株發(fā)酵液中CLA含量的方式進行復篩，篩選出高產(chǎn)菌株，對其菌落特征、細胞形態(tài)及生理生化特性進行分析，并結合16S rDNA全序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定其種屬。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

鑲黃旗酸油、正藍旗稀奶油，均采購于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟錫林浩特市額吉淖爾路察哈爾奶食店。

溴甲酚紫培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、MRS半固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基按照參考文獻［7］中的方法配制。

共軛亞油酸標準品（純度≥99.9%）、亞油酸（純度≥99.9%） 美國Sigma公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒（含染料） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SX-500全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司；T6新世紀紫外可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限責任公司；OLYMPUS BX50型光學顯微鏡 日本Olympus公司；SW-CJ-1D型超凈臺 蘇州安泰空氣技術公司；303-OA型生化培養(yǎng)箱 天津市通利信達儀器廠；LEICA DM4000B型正置智能熒光顯微鏡 德國徠卡公司；PHS-3C型酸度計 上海佑科儀器有限公司；3730X型測序儀、2720 thermal cycler型PCR儀 美國應用生物系統(tǒng)公司；DYCP-31DN型DNA電泳槽 北京六一儀器廠；FR980型凝膠成像儀 上海復日科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

在無菌條件下用接種環(huán)挑取少量奶油制品于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，從液體培養(yǎng)基中挑取一環(huán)菌液在溴甲酚紫平板上劃線，置于培養(yǎng)箱中37 ℃厭氧、倒置培養(yǎng)24 h。將平板上能使周圍紫色變?yōu)辄S色的菌落進行反復分離純化至單菌落［11-15］。將各菌株編號后進行革蘭氏染色與過氧化氫酶實驗，將G+、過氧化氫酶陰性的菌株接種于MRS半固體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 產(chǎn)CLA乳酸菌的篩選

發(fā)酵培養(yǎng)液中加入0.06% LA乳化液（吐溫-80、LA和蒸餾水以體積比5∶3∶10進行乳化），用一次性注射器通過已滅菌、膜孔徑為0.22 μm的微孔過濾器過濾除菌［7］。初篩菌株在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃活化2 代，在每支試管中（15 mm×150 mm）裝入4.5 mL MRS液體培養(yǎng)基，加入0.5 mL LA乳化液，接種量為2%，接種后置于快速混勻器混勻，37 ℃發(fā)酵24 h［7］。

1.3.3 菌株產(chǎn)CLA水平檢測

CLA標準曲線制作：以正己烷為溶劑，將10 mg CLA標準品定容于100 mL容量瓶中，分別吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80 mL CLA溶液裝入10 mL容量瓶，利用正己烷定容［16-19］。以正己烷為參比，在233 nm波長處測定不同質量濃度（0.000～8.000 μg/mL）溶液的吸光度，以CLA質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制共軛亞油酸標準曲線［5］，得到回歸方程為y=0.126 7x（R2=0.999 3）。

發(fā)酵結束后，將發(fā)酵液移入60 mm分液漏斗中，每管發(fā)酵液加入20 mL正己烷振蕩萃取5 min，靜置分層后棄去下層水相液體，用5 mL蒸餾水振蕩水洗，靜置后棄去下層水相液體，水洗3 遍，將萃取液移至干凈小燒杯中，再用墊有濾紙并盛裝少量無水硫酸鈉的小漏斗進行過濾以除去水分和水溶性物質，直至乳化層消失。將脫水后的正己烷萃取液移入25 mL容量瓶中，正己烷定容，搖勻后進行紫外檢測。將未接入菌種的，與發(fā)酵培養(yǎng)基同一批次滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基按照以上方法培養(yǎng)、萃取、定容，以所得的萃取液為參比液，采用紫外-可見分光光度計在233 nm波長處測定吸光度，根據(jù)CLA標準曲線方程計算CLA的生成量。根據(jù)發(fā)酵液中CLA含量，篩選出產(chǎn)CLA水平高的菌株［15-17］。

1.3.4 菌落與細胞形態(tài)特征分析

將高產(chǎn)菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落特征，革蘭氏染色后，觀察細胞形態(tài)［20-25］。

1.3.5 菌株生化特性測定

生化特性測定的主要實驗有：糖發(fā)酵實驗、葡萄糖酸鹽實驗、明膠液化實驗、淀粉水解實驗、過氧化氫酶實驗、石蕊牛乳實驗、吲哚實驗、硝酸鹽還原實驗、V-P（乙酰甲基醇）實驗、甲基紅實驗、脲酶實驗和硫化氫實驗［20-25］。

1.3.6 菌株生理特性測定

1.3.6.1 不同培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響

將菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，在10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃條件下分別培養(yǎng)18、24、48、72 h，測定菌液在600 nm波長處的吸光度，以培養(yǎng)溫度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制曲線［20-25］。

1.3.6.2 菌株液體培養(yǎng)基的最終pH值與生長量測定

從半固體MRS培養(yǎng)基上取菌株一環(huán)接種到pH值為7.0的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔4 h取菌液，測定菌液pH值與600 nm波長處的吸光度，以培養(yǎng)時間為橫坐標、pH值與吸光度為縱坐標繪制曲線［20-25］。

1.3.6.3 菌株運動性實驗

將菌株用接菌針穿刺接種于半固體MRS培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌株運動性［20-23］。

1.3.7 菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

Ezup柱式基因組DNA的提?。喝? mL過夜培養(yǎng)的細菌菌液，加入1.5 mL離心管中，室溫下8 000 r/min離心1 min，棄上清，收集菌體。加入180 μL溶菌酶溶液，重懸菌液，37 ℃水浴50 min。再加入20 μL蛋白酶K溶液，振蕩混勻。56 ℃水浴30 min至細胞完全裂解。加入200 μL Buffer BD，充分顛倒混勻。加入200 μL無水乙醇，充分顛倒混勻。將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2 min，再12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱放回收集管，加入500 μL PW，10 000 r/min離心30 s倒掉濾液。將吸附柱放回收集管，加入500 μL清洗液，10 000 r/min離心30 s倒掉濾液。將吸附柱重新放回收集管，于12 000 r/min室溫離心2 min，除去殘留的清洗液［19，26］。取出吸附柱，放入一個新的1.5 mL離心管中，加入70 μL CE Buffer靜置3min，12 000 r/min室溫離心2 min，收集DNA溶液。提取的DNA進行下一步實驗。

PCR擴增：以通用引物7F 5'-CAGAGTTTGA TCCTGGCT-3'和1540R 5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'擴增其16S rDNA片段。PCR反應體系（25 μL）：10×PCR Buffer（Mg2+）2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP Mix 1 μL；引物F（10 μmol/L）0.5 μL；引物R（10 μmol/L） 0.5 μL；Taq DNA 聚合酶 0.2 μL；基因組DNA 0.5 μL；加ddH2O至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min［26-27］。

PCR產(chǎn)物經(jīng)生工生物工程（上海）有限公司測序。測序結果應用美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的BLAST程序進行相似性對比分析，并采用MEGA 6軟件進行同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹［19］。

2 結果與分析

2.1 20 株產(chǎn)CLA菌產(chǎn)量

從鑲黃旗酸油中分離到11 株產(chǎn)CLA菌株，經(jīng)鏡檢，均為G+、桿菌。將11 株菌依次編號為HS1、HS2、HS3、HS4、HS5、HS6、HS7、HS8、HS9、HS10、HS11，CLA產(chǎn)量如圖1所示。11 株菌CLA產(chǎn)量的范圍在9.379～23.586 μg/mL，其中菌株HS4產(chǎn)CLA的能力最強，產(chǎn)量為23.586 μg/mL，轉化率為7.86%。

從正藍旗稀奶油中分離到9 株能產(chǎn)CLA的菌株，經(jīng)鏡檢，均為G+、桿菌。將9 株菌依次編號為LX1、LX2、LX3、LX4、LX5、LX6、LX7、LX8、LX9，CLA產(chǎn)量如圖2所示。9 株菌CLA產(chǎn)量的范圍在4.485～20.508 μg/mL，菌株LX5產(chǎn)CLA的能力最強，產(chǎn)量為20.508 μg/mL，轉化率為6.84%。

2.2 高產(chǎn)菌株菌落特征與細胞形態(tài)

由圖3可知，2 株高產(chǎn)CLA菌株菌落形態(tài)均為圓形，表面光滑不透明，中央微凸起，HS4的菌落大小在2 mm以下，LX5的菌落大小在2～4 mm，HS4的菌落顏色為白色略帶淺黃色，LX5的菌落顏色為乳白色，革蘭氏染色均為陽性，均無鞭毛、無芽孢，均為桿菌，排列方式多為單個或短鏈。

2.3 高產(chǎn)菌株的生化特性

由表1可知，2 株高產(chǎn)CLA菌株能發(fā)酵大部分糖類，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣；HS4不能發(fā)酵阿拉伯糖、蜜二糖、鼠李糖、棉子糖、木糖；LX5不能發(fā)酵阿拉伯糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、棉子糖、木糖、山梨醇。

由表2可知，2 株高產(chǎn)CLA菌株除石蕊牛乳實驗呈陽性，其他生化實驗均呈陰性。

2.4 高產(chǎn)菌株的生理特性

2.4.1 不同培養(yǎng)溫度對菌株生長特性的影響

由圖4可知，當培養(yǎng)溫度為15 ℃時，2 株菌均生長；在15～45 ℃范圍內(nèi)，各菌株生長量隨培養(yǎng)溫度的升高先增大后減少；50 ℃時HS4基本不生長；45 ℃時菌株LX5基本不生長。HS4的最適生長溫度為25～35 ℃；LX5的最適生長溫度為30～35 ℃。

2.4.2 菌株液體培養(yǎng)基的最終pH值與生長量測定結果

由圖5可知，各菌株的菌液pH值在24 h前下降較明顯，菌體生長迅速，24 h后pH值變化趨于平緩，菌體生長量有下降趨勢；HS4菌液pH值的變化范圍為2.92～6.11，OD600nm值變化范圍為0.001～0.733；LX5菌液pH值的變化范圍為2.93～5.91，OD600nm值變化范圍為0.002～0.741。

2.4.3 菌株運動實驗結果

菌株HS4、LX5均無運動性，在半固體MRS培養(yǎng)基內(nèi)均生長在穿刺線上，邊緣清晰，無擴散痕跡。

2.5 菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將菌株HS4、LX5利用通用引物進行16S rDNA片段擴增后，2 株菌的擴增產(chǎn)物序列長度均為1 500 bp左右（圖6），測序結果表明，菌株HS4序列長度為1 450 bp，LX5為1 465 bp。

將菌株HS4、LX5的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性對比分析，結果見表3。菌株HS4與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）相似性最高，相似性達99%，菌株LX5與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）相似性最高，相似性達99%。

構建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7。菌株HS4與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）親緣關系最近，菌株LX5與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）親緣關系最近，再結合菌株的菌落特征、細胞形態(tài)及生理生化特性，菌株HS4鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），菌株LX5鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。

3 結 論

本實驗篩選出具有高產(chǎn)CLA能力的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），其中副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）在目前關于分離篩選產(chǎn)CLA的乳酸菌報道中較為少見，篩選出的2 株高產(chǎn)菌株均具有較強的CLA合成能力，可以作為今后通過優(yōu)化培養(yǎng)條件、基因誘變、亞油酸異構酶分離提取等方式提高微生物合成CLA效率的出發(fā)菌株。從實驗結果可以看出，不同的乳酸菌產(chǎn)共軛亞油酸的能力有顯著差別，這可能與其自身的CLA代謝機制有關，一些菌株具有將CLA進一步轉化為其他代謝產(chǎn)物的能力，游離的LA也會對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用，而不同的菌株對LA具有不同的耐受能力，這些因素導致不同的菌株具有不同的CLA轉化能力。因此，今后在CLA微生物合成機制、生產(chǎn)CLA的最適反應條件、確定產(chǎn)CLA的最適底物等方面都需要進一步深入研究。

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Isolation， Screening and Identification of Lactic Acid Bacteria with Conjugated Linoleic Acid-Producing from Traditional Cream Products in Xilingol League of Inner Mongolia

LIU Chunxiao， LI Jiayu， LIU Naiqi， LIU Lijie， ZHANG Jianli， BAI Ying*
（College of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China）

The objective of this study was to isolate lactic acid bacteria （LAB） with high ability to produce conjugated linoleic acid （CLA） from traditional cream products in Xilingol League of Inner Mongolia. CLA content in fermented broth was determined by UV-spectrophotometry， and the strains with the highest CLA-producing ability were identified by analyzing their colony characteristics， cell morphology， biochemical and physiological characteristics， and the phylogenetic tree generated with MEGA 6 software based on 16S rDNA sequence. Twenty CLA-producing strains were isolated from traditional cream products， 11 strains of which were present in samples collected from Xianghuang Banner and the remaining 9 strains were found in samples collected from Zhengxianglan Banner. HS4 with the highest CLA-producing capacity among the strains isolated from cream samples collected from Xianghuang Banner was identified as Lactobacillus casei， producing 23.586 μg/mL CLA with a conversion efficiency of 7.86% when it was cultured at an inoculum size of 2% in the presence of 0.06% linoleic acid； among the strains isolated from cream samples collected from Zhengxianglan Banner， LX5 with the highest CLA-producing capacity was identified as Lactobacillus paracasei， producing 20.508 μg/mL CLA with a conversion efficiency of 6.84% under the same culture conditions as described for HS4.

conjugated linoleic acid； traditional cream products； lactic acid bacteria； screening； identification

10.7506/spkx1002-6630-201609035

TS252.5

A

1002-6630（2016）09-0186-06

劉春曉， 李佳宇， 劉乃齊， 等. 內(nèi)蒙古錫林郭勒盟地區(qū)傳統(tǒng)奶油制品中產(chǎn)共軛亞油酸乳酸菌的分離篩選與鑒定［J］. 食品科學， 2016， 37（9）： 186-191. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609035. http：//www.spkx.net.cn

LIU Chunxiao， LI Jiayu， LIU Naiqi， et al. Isolation， screening and identification of lactic acid bacteria with conjugated linoleic acid-producing from traditional cream products in Xilingol League of Inner Mongolia［J］. Food Science， 2016， 37（9）：186-191. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609035. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-14

劉春曉（1989—），女，碩士研究生，研究方向為乳品生物技術與加工工程。E-mail：liuchunxiao1989@sina.com

*通信作者：白英（1968—），女，副教授，博士，研究方向為乳品生物技術與加工工程。E-mail：baiying77@sina.com