楊云舒，姜子濤*，李 榮

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

廣棗黃酮清除自由基能力及抗氧化性能的細(xì)胞模型法評(píng)價(jià)

楊云舒，姜子濤*，李 榮

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

利用制備色譜將廣棗黃酮分離成F1和F2兩個(gè)組分。分別測定廣棗黃酮、F1和F2的總抗氧化能力、清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）以及超氧陰離子自由基（O2-·）的能力，并與常見的抗氧化劑VC進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明：廣棗黃酮具有良好的抗氧化效果，總黃酮的抗氧化能力介于F1和F2之間；F1對(duì)DPPH自由基的清除能力以及F1和F2對(duì)·OH的清除能力均高于VC，而在總抗氧化能力以及清除O2-·方面F1和F2的效果均弱于VC。另外，細(xì)胞模型法評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，廣棗黃酮可清除小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)的活性氧，表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。

廣棗黃酮；總抗氧化能力；自由基清除活性；細(xì)胞抗氧化活性；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7

漆樹科植物南酸棗（Choerospondias axillaris （Roxb.）Burtt et Hill）在我國分布廣泛，其干燥果實(shí)稱為廣棗［1］。由于廣棗對(duì)抗心律失常、改善心肌缺血具有明顯的效果，因此在臨床上常被用于治療心血管疾?。?-6］，含廣棗的制劑占蒙成藥總方劑的10%［7］。目前已有的研究表明，廣棗中含有黃酮類化合物、脂肪酸、甾醇、氨基酸以及多種無機(jī)鹽成分［8-14］。其中，黃酮類物質(zhì)被認(rèn)為是主要的抗氧化活性成分［15］。郭英等［16］發(fā)現(xiàn)廣棗提取物對(duì)于活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基有較強(qiáng)的體外清除能力。包保全等［17］通過觀察廣棗總黃酮對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞中乳酸脫氫酶和脂質(zhì)過氧化物的影響，證明了廣棗總黃酮可以通過清除自由基對(duì)氧合血紅蛋白產(chǎn)生保護(hù)作用。細(xì)胞模型法是一種新型的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，與化學(xué)法相比，細(xì)胞模型法具有更好的生物相關(guān)性，能夠更加準(zhǔn)確地預(yù)測活性物質(zhì)在人體內(nèi)的抗氧化活性，但目前對(duì)于廣棗黃酮的研究還極少涉及細(xì)胞抗氧化活性的評(píng)價(jià)［18］。

本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中，將提取得到的廣棗黃酮經(jīng)制備色譜分離純化，得到了極性不同的兩個(gè)組分——F1和F2［19］，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)廣棗總黃酮及兩個(gè)分離組分分別進(jìn)行抗氧化活性和清除自由基能力的研究，并與常用抗氧化劑VC進(jìn)行對(duì)比。同時(shí)采用細(xì)胞模型法研究廣棗黃酮在小鼠巨噬細(xì)胞中的抗氧化能力，為今后廣棗黃酮的開發(fā)應(yīng)用以及進(jìn)一步的成分分析和構(gòu)效關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣棗，產(chǎn)地西藏昌都。按照文獻(xiàn)［19］方法提取廣棗黃酮，并通過制備色譜將黃酮分為F1和F2兩個(gè)組分，并分別溶解于30%的乙醇溶液中，配制成1.0 mg/mL的貯備液。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 江蘇齊氏生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所科技公司；DMEM高糖培養(yǎng)基 美國HyClone公司；2'，7'-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針 江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；無水乙醇等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M5多功能讀板機(jī) 美國Molecular Devices公司；Agilent 1260系列高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；U-3900紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司；HERAcell 240i CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Alpha-1500紫外-可見分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司；DS-5MC倒置顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 磷鉬絡(luò)合物法測定總抗氧化活性

依據(jù)文獻(xiàn)［20-21］的方法，用蒸餾水液稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的F1、F2、廣棗總黃酮樣品液和VC溶液。在一系列具塞試管中分別加入4.0 mL磷鉬試劑（終濃度為0.6 mol/L硫酸、4.0 mmol/L鉬酸銨和28.0 mmol/L磷酸鈉）和0.4 mL樣品液，迅速搖勻，將試管在95 ℃條件下恒溫水浴90 min，在695 nm波長處測定吸光度（A695nm），平行測定3 次，取平均值。

1.3.2 清除DPPH自由基能力的測定

依據(jù)文獻(xiàn)［22］的方法，用蒸餾水稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10 mg/mL的F1、F2、總黃酮樣品液和VC溶液。在具塞試管中加入濃度為1.0×10-4mol/L的DPPH溶液3.5 mL和無水乙醇0.5 mL，避光靜置30 min，測定其在517 nm波長處的吸光度A1；在具塞試管中加入1.0×10-4mol/L的DPPH溶液3.5 mL和樣品液0.5 mL混合，避光靜置30 min，測定其在517 nm波長處的吸光度A；取3.5 mL無水乙醇與0.5 mL樣品液混合，測定其在517 nm波長處的吸光度A0，同時(shí)以3.5 mL無水乙醇和0.5 mL蒸餾水的混合液作為空白。平行測定3 次，取平均值。按照公式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.3 清除羥自由基（·OH）能力的測定

依據(jù)文獻(xiàn)［23-24］的方法，采用結(jié)晶紫法對(duì)樣品清除·OH的能力進(jìn)行測定：將儲(chǔ)備液稀釋，配制成0.1 mg/mL的F1、F2、總黃酮樣品液和VC溶液。在一系列10 mL具塞試管中先后加入0.4 mmol/L結(jié)晶紫0.3 mL、pH 4.0磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液（磷酸氫二鉀濃度為0.2 mol/L、檸檬酸濃度為0.1 mol/L）3.0 mL、15.0 mmol/L的FeSO4溶液2.5 mL和20.0 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL，用緩沖液定容至10 mL并搖勻，放置30 min，測定其在580 nm波長處的吸光度A0；同時(shí)測定不加H2O2時(shí)的吸光度，記為Ab；在加入H2O2前分別加入0.2、0.6、1.0 mL的樣品液，測定其在580 nm波長處的吸光度，記為Ax，同時(shí)以30%乙醇溶液為空白。平行測定3 次，取平均值。按照公式（2）計(jì)算·OH清除率。

1.3.4 清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測定［25-26］

1.3.4.1 最大吸收波長的確定

向試管中加入pH 8.2的Tris-HCl（濃度為0.05 mol/L）緩沖液4.5 mL和蒸餾水4.0 mL，在37 ℃條件下恒溫水浴20 min，立即加入3.0 mmol/L的鄰苯三酚（已在相同條件下預(yù)熱）0.5 mL，迅速搖勻，在2～16 min內(nèi)每隔2 min于250～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，確定其最大吸收波長。

1.3.4.2 鄰苯三酚自氧化速率的測定

將按照1.3.4.1節(jié)混合的溶液在320 nm波長處測定吸光度，以10.0 mmol/L HCl為參比，在2～6 min內(nèi)每1 min記錄一次吸光度，將測定值進(jìn)行線性回歸，得到其斜率k0。

1.3.4.3 樣品液對(duì)O2-·清除率的測定

用蒸餾水稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10 mg/mL的F1、F2、總黃酮樣品液和VC溶液。向具塞試管中加入pH 8.2的Tris-HCl（濃度為0.05 mol/L）緩沖溶液4.5 mL、樣品液1.5 mL和蒸餾水2.5 mL，在37 ℃條件下恒溫水浴20 min，立即加入3.0 mmol/L的鄰苯三酚（已在相同條件下預(yù)熱）0.5 mL，迅速搖勻，在320 nm波長處以10.0 mmol/L HCl溶液為參比，在2～6 min內(nèi)每1 min記錄一次吸光度，進(jìn)行線性回歸得到斜率ks。所有實(shí)驗(yàn)均平行測定3 次，取平均值。根據(jù)公式（3）計(jì)算O2-·清除率。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）的測定

1.3.5.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

適當(dāng)改進(jìn)文獻(xiàn)［27］的方法，用于測定廣棗總黃酮、F1和F2對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的毒性作用。將處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以每孔100 μL的接種量接種于96 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，使細(xì)胞貼壁生長。培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，實(shí)驗(yàn)組每孔中加入100 μL不同質(zhì)量濃度（1.0、100.0、500.0 μg/mL）的廣棗總黃酮、F1和F2溶液培養(yǎng)24 h，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。小心吸棄培養(yǎng)液并用PBS清洗，加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去MTT溶液，加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，低速振蕩至結(jié)晶物溶解，于570 nm波長處測定每孔吸光度?？瞻捉M不接種細(xì)胞，只用培養(yǎng)液處理；對(duì)照組接種細(xì)胞，以培養(yǎng)液代替樣品溶液。按照公式（4）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：Ax、Ac、A0分別為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組在570 nm波長處的吸光度。

1.3.5.2 細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的測定

根據(jù)Qian Zhongji［28］和Yang Lichen［29］等的方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，測定廣棗總黃酮、F1和F2在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)的抗氧化活性。按照1.3.5.1節(jié)條件接種細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后小心吸棄培養(yǎng)液并用PBS清洗，每孔加入廣棗總黃酮、F1和F2溶液（100.0 μg/mL）和DCFH-DA探針溶液（10.0 μmol/L）各100 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)30 min后用PBS清洗兩次，加入100 μL的H2O2溶液（100.0 μmol/L）。在1 h內(nèi)每5 min測定一次熒光強(qiáng)度，測定條件為：激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm?？瞻捉M只用DCFH-DA探針和培養(yǎng)液處理，不加入樣品溶液和H2O2。對(duì)照組用DCFH-DA和H2O2處理，以培養(yǎng)液代替樣品溶液。

1.3.5.3 CAA的計(jì)算

對(duì)1.3.5.2節(jié)得到的熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線進(jìn)行積分，按照公式（5）計(jì)算CAA。

式中：∫SA為實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線積分面積；∫CA為對(duì)照組熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線積分面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣棗總黃酮及F1、F2的總抗氧化活性

磷鉬絡(luò)合物法測定總抗氧化活性的原理是抗氧化物質(zhì)可將Mo6+還原為綠色的Mo5+絡(luò)合物，因此吸光度大小與抗氧化物質(zhì)的活性成正相關(guān)［30］。由圖1可知，廣棗總黃酮及F1、F2的抗氧化活性均隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，F(xiàn)2組分的抗氧化活性整體高于F1組分和廣棗總黃酮，但隨著質(zhì)量濃度的增大，三者之間的差距逐漸減?。辉?.1 mg/mL時(shí)，F(xiàn)2的抗氧化活性與VC基本相當(dāng)，即在低質(zhì)量濃度時(shí)F2有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.2 廣棗總黃酮及F1、F2清除DPPH自由基的能力

當(dāng)DPPH自由基中的孤對(duì)電子與自由基清除劑配對(duì)時(shí)，自由基被還原為非自由基形式，表現(xiàn)為在517 nm波長處的吸收減弱，其褪色程度與自由基清除劑的活性相關(guān)［31］。由圖2可知，在0.01 mg/mL時(shí)，VC具有較好的清除DPPH自由基的能力，其DPPH自由基清除率高于3 種樣品，而F2的DPPH自由基清除率高于F1和廣棗總黃酮；在0.2、0.3 mg/mL時(shí)，廣棗總黃酮的DPPH自由基清除率與VC相當(dāng)，而F1的DPPH自由基清除率略高于VC，表明F1在高質(zhì)量濃度時(shí)有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

2.3 廣棗總黃酮及F1、F2清除·OH的能力

·OH是活性氧的一種，會(huì)加速機(jī)體老化，并且是許多疾病產(chǎn)生的誘因［32］。H2O2與Fe2+反應(yīng)·OH，·OH進(jìn)攻較高電子云密度的乙烯基基團(tuán)使結(jié)晶紫發(fā)生褪色，而抗氧化劑的加入能夠清除·OH，從而使體系的吸光度升高［23］。由圖3可知，在0.02、0.06、0.1 mg/mL時(shí)，3 種樣品對(duì)·OH的清除能力均遠(yuǎn)高于VC，且終質(zhì)量濃度僅為0.1 mg/mL時(shí)，各樣品的·OH清除率均接近或達(dá)到50%，是同質(zhì)量濃度下VC對(duì)·OH清除率的6～7 倍，顯著高于Wang Hua等［33］的研究結(jié)果；在0.02 mg/mL時(shí)，F(xiàn)1的清除效果要好于F2和廣棗總黃酮，隨著質(zhì)量濃度的增大，F(xiàn)2的·OH清除率迅速增長，反而高于F1和廣棗總黃酮。

2.4 廣棗總黃酮及F1、F2清除O2-·的能力

由圖4可知，隨著時(shí)間的延長，鄰苯三酚自氧化體系的吸光度不斷升高，在2～6 min內(nèi)持續(xù)增長，結(jié)合吸光度最大值，選擇320 nm為檢測波長。

如圖5所示，對(duì)橫坐標(biāo)時(shí)間和縱坐標(biāo)吸光度進(jìn)行回歸分析，得到k0和ks，從而計(jì)算出樣品對(duì)O2-·的清除率，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，廣棗總黃酮對(duì)O2-·的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高而增大，但明顯弱于VC；F2的O2-·清除率高于F1和廣棗總黃酮。這一結(jié)論與狄建軍等［34］的研究結(jié)果一致，他闡述廣棗粗提物具有很強(qiáng)的清除O2-·的能力，而經(jīng)過離子交換層析的提取物清除能力則減弱，這可能與不同的處理方法有關(guān)。

2.5 廣棗總黃酮及F1、F2的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力

由圖7可知，各樣品僅在1.0 μg/mL時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活率有輕微的抑制作用，而當(dāng)各樣品的質(zhì)量濃度升高到100.0、500.0 μg/mL時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活反而有輕微的促進(jìn)作用，但RAW264.7細(xì)胞存活率總體變化不大，即在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍（1.0～500.0 μg/mL）內(nèi)，廣棗總黃酮、F1和F2對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響可以忽略不計(jì)。

使用DCFH-DA對(duì)RAW246.7細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，使DCFH-DA探針自由擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)酯酶切開了DCFH-DA探針二醋酸鹽的一半，形成了極性更強(qiáng)的DCFH，使得DCFH被困在細(xì)胞里。DCFH可以與H2O2或過氧硝酸鹽發(fā)生反應(yīng)從而被氧化［35］。H2O2在細(xì)胞中形成ROS，從而將DCFH氧化為有熒光性的DCF，因此，通過檢測熒光強(qiáng)度就可以監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)的ROS水平［36］?？寡趸瘎┛梢韵齊OS從而阻止DCFH被氧化為DCF，即通過檢測熒光強(qiáng)度也可以間接檢測出物質(zhì)的抗氧化能力。

由圖8可知，對(duì)照組的熒光強(qiáng)度明顯高于空白組，說明經(jīng)過H2O2處理后的細(xì)胞產(chǎn)生了更多的ROS。而經(jīng)過廣棗總黃酮及F1、F2處理后，RAW246.7細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均明顯降低，即3 種樣品可清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，具有一定的抗氧化能力。進(jìn)一步計(jì)算得到RAW246.7細(xì)胞經(jīng)廣棗總黃酮、F1和F2處理后的CAA值分別為51.05%、57.71%和62.02%，這表明廣棗黃酮具有明顯的抗氧化活性。根據(jù)文獻(xiàn)［37-38］報(bào)道，黃酮的抗氧化性與—OH數(shù)目成正相關(guān)，特別是廣棗黃酮中含有的槲皮苷等在B環(huán)具有3'，4'-O-二羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類物質(zhì)具有較高的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力。

3 結(jié) 論

由于不同物質(zhì)抗氧化活性的機(jī)制有所不同，因此，物質(zhì)的抗氧化性能需要通過多種方法來評(píng)判，使用任何一種單一的方法來評(píng)價(jià)都是不夠全面和客觀的。本研究不僅采用了總抗氧化活性、清除DPPH自由基、·OH和O2-·的能力這4 種化學(xué)方法，還使用了目前較為先進(jìn)的細(xì)胞模型法，比較全面地考察了廣棗黃酮的抗氧化活性和清除自由基的能力。本研究的結(jié)果與Wang Hua等［33］的結(jié)論有較大差異，這可能是由于不同產(chǎn)地的廣棗生長環(huán)境不同導(dǎo)致的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，廣棗黃酮的兩個(gè)組分F1、F2之間的抗氧化性能存在著明顯差別。廣棗黃酮不僅在清除·OH的能力上遠(yuǎn)勝于合成抗氧化劑VC，在清除DPPH自由基的能力上也并不遜色，在細(xì)胞模型法中廣棗黃酮也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化性。雖然在清除O2-·的能力上略遜于VC，但不能否認(rèn)，廣棗黃酮作為一種安全、無毒的天然抗氧化劑，在食品工業(yè)中將具有廣闊的開發(fā)利用前景。

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Evaluation of Free Radical Scavenging Ability and Antioxidant Activity of Flavonoids from Choerospondias axillaris Fruits Using Cell Model

YANG Yunshu， JIANG Zitao*， LI Rong
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin 300134， China）

Flavonoids from the dried fruits of Choerospondias axillaris were separated using preparative chromatography into two fractions （F1 and F2）. The total antioxidant capacity， and DPPH radical， hydroxyl radical and superoxide anion radical scavenging activities of F1 and F2 were evaluated using ascorbic acid （VC） as the reference. The results demonstrated that total flavonoids from C. axillaris had obvious antioxidant capacity， which was between F1 and F2. The DPPH radical scavenging activity of F1 and the hydroxyl radical scavenging activities of F1 and F2 were higher than those of VC， but total antioxidant capacity and superoxide anion radical scavenging activity of F1 and F2 were lower than those of VC. In addition，as evaluated using cell model， the flavonoids from C. axillaris showed significant antioxidant activity in mouse macrophages（RAW264.7）.

flavonoids from Choerospondias axillaris fruits； total antioxidant capacity； free radical scavenging activity；cellular antioxidant activity； mouse macrophages RAW264.7

10.7506/spkx1002-6630-201609018

TS202.3

A

1002-6630（2016）09-0092-06

楊云舒， 姜子濤， 李榮. 廣棗黃酮清除自由基能力及抗氧化性能的細(xì)胞模型法評(píng)價(jià)［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 92-97. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609018. http：//www.spkx.net.cn

YANG Yunshu， JIANG Zitao， LI Rong. Evaluation of free radical scavenging ability and antioxidant activity of flavonoids from Choerospondias axillaris fruits using cell model［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 92-97. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609018. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-19

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（12JCZDJC34100）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（TD12-5049）

楊云舒（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：yangys019@hotmail.com

*通信作者：姜子濤（1956—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn