于世博　孔祥耀　陳明翠　何顯珠　吳　寧

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽，550000； 2 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴陽，550000)

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維藥黑種草子對急性乙醇性肝損傷小鼠保護作用及抑制NF-κB炎性反應(yīng)信號通路的研究

于世博1孔祥耀1陳明翠1何顯珠1吳寧2

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽，550000； 2 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴陽，550000)

目的：觀察維藥黑種草子對急性乙醇性肝損傷小鼠保護作用及對NF-κB炎性反應(yīng)信號通路的抑制作用。方法：50只昆明小鼠隨機分為模型組、空白組、陽性對照組、黑種草子水提液高劑量組(6 g/kg)、黑種草子水提液低劑量組(2 g/kg)。除空白組外，其余各組每日均灌胃給予56度白酒10 mL/kg，連續(xù)灌胃15 d。禁食不禁水10 h后，觀察小鼠一般狀態(tài)，檢測體質(zhì)量，肝重，肝指數(shù)，肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，肝組織核因子κB(NF-κB)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達，并進行肝組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)均降低，血清ALT及AST活性升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，黑種草子水提液各組小鼠肝體質(zhì)量和肝指數(shù)有所升高，血清ALT及AST活性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組小鼠肝細胞明顯氣球樣變性、壞死和并伴有少量炎細胞浸潤，黑種草子水提液組較肝損傷模型組病變情況顯著減輕。模型組NF-κB及TNF-α表達強度均高于空白組，黑種草子各給藥組較模型組NF-κB及TNF-α表達強度均下降。結(jié)論：黑種草子水提液對急性乙醇性肝損傷小鼠具有一定保護作用，并且能明顯抑制小鼠肝細胞NF-κB及TNF-α的表達。

黑種草子；乙醇性肝損傷；小鼠；NF-κB；TNF-α

大量的乙醇攝入會使肝臟受到不同程度的損壞，而短時間內(nèi)的大量飲酒更會加重肝臟的損傷。隨著社會生活水平的不斷提高，乙醇性肝損傷已經(jīng)成為了一個不可忽視的健康問題。目前臨床上對急性乙醇性肝損傷的治療還不是十分理想，所以天然保肝類藥物的研發(fā)成為了人們新的需求。維藥黑種草子為我國新疆維吾爾族的傳統(tǒng)常用藥材。具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、保肝、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗菌等功效[1-4]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)黑種草子對急性乙醇性肝損傷有一定的治療作用，但其具體作用機制尚不明確。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是一種在核細胞基因轉(zhuǎn)錄中重要的調(diào)控因子，參與多種疾病的病理生理過程，在機體的免疫和炎性反應(yīng)及凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用[5]。長期乙醇攝入可使肝組織中NF-κB活化，造成多種下游炎性反應(yīng)因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的大量產(chǎn)生。故NF-κB炎性反應(yīng)信號通路對乙醇性肝損傷的發(fā)生發(fā)展起著十分重要的作用。本研究擬觀察黑種草子對急性乙醇性肝損傷小鼠肝組織中NF-κB及TNF-α表達強度的影響，探究乙醇性肝損傷的防治機制，為維藥黑種草子臨床應(yīng)用提供實驗資料和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1一般資料昆明小鼠50只，雌雄各半，清潔級，體質(zhì)量為19～24 g。由貴州醫(yī)科大學(xué)動物管理中心提供，合格證號：SCXK(黔)2012—001。黑種草子購于新疆維吾爾民族醫(yī)院。紅星牌56度白酒，北京紅星二鍋頭股份有限公司生產(chǎn)，批號：2014-08-29。血清ALT、AST、檢測試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR0024。NF-κB及TNF-α多克隆抗體，免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR0003?？ㄗo肝片，北京葵花藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：Z20003336。7150型全自動生化分析儀，日本日立公司生產(chǎn)；RM2015型石蠟切片機，德國萊卡公司生產(chǎn)；5430型離心機，德國Eppendorf公司生產(chǎn)；MDF-382E型低溫冰箱，日本三洋公司生產(chǎn)；移液器，德國EPPENDORF公司生產(chǎn)；DSHZ-300型恒溫水浴箱，江蘇太倉醫(yī)用儀器廠生產(chǎn)；BX51T-PHD-J11型顯微鏡，日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。

2　結(jié)果

2.1小鼠一般情況空白組小鼠各指標(biāo)均正常，模型組小鼠較正常對照組相比體重減輕，嗜睡，毛發(fā)光澤度下降，并伴有反應(yīng)遲鈍，活動，進食減少，腹部腫脹等癥狀。少量小鼠出現(xiàn)便稀現(xiàn)象。模型組有兩只小鼠由于將乙醇誤吸入氣管而導(dǎo)致死亡，其他各組均無死亡現(xiàn)象。與模型組相比黑種草子水提液各給藥組小鼠情況均有明顯改善，其中高劑量組最為明顯。與空白組相比模型組小鼠體重及肝臟指數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。瘤果黑種草子水提液各給藥組與陽性對照組組較模型組體重均有不同程度的上升，且肝臟指數(shù)也表現(xiàn)為上升，其中瘤果黑種草子高劑量組最為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各實驗組體重及肝指數(shù)比較結(jié)果見表1。

2.2黑種草子對急性乙醇性肝損傷小鼠血清肝功能影響由表2可見與空白組相比，模型組小鼠ALT及AST活性表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明建模成功。與模型組相比，瘤果黑種草子水提液各組均可降低小鼠體內(nèi)ALT及AST活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3黑種草子對小鼠肝組織外觀及病理改變的影響正常對照組小鼠肝組織外觀呈紅褐色且具有明顯光澤，觸之感覺柔軟且富有彈性。模型組小鼠肝組織外觀呈黃褐色，少數(shù)呈深紅色及灰白色，觸之感覺質(zhì)地較硬且缺少彈性。黑種草子各給藥組情況均介于模型組與空白對照組之間，其中高劑量組更接近于正常對照組。肝臟病理情況改變。見圖1：HE。

表1　瘤果黑種草子對小鼠體重及肝指數(shù)的影響±s)

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

表2　瘤果黑種草子對急性乙醇性肝損傷小鼠血清ALT及AST的影響±s)

注：與空白組相比**P<0.01;與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

染色后鏡下觀察可見空白組肝細胞完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，多數(shù)為單核，少見雙核及多核。模型組小鼠肝細胞腫脹，并伴有氣球樣變。肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細胞排列混亂。部分肝細胞伴有少量炎性反應(yīng)細胞浸潤。陽性對照組及黑種草子不同劑量給藥組對急性乙醇性肝損傷小鼠肝臟病理情況均有不同程度的改善作用，部分細胞可見氣球樣變性及少量點狀壞死，其中黑種草子高劑量組改善最為明顯。

圖1　不同分組肝細胞病變情況(400)

2.4黑種草子對小鼠肝組織NF-κB及TNF-α免疫組化染色結(jié)果由圖二顯示NF-κB陽性細胞主要分布于肝細胞壞死灶周圍細胞的胞質(zhì)中，TNF-α陽性細胞主要分布于中央靜脈及肝細胞壞死灶周圍細胞的胞質(zhì)中。模型組NF-κB及TNF-α表達強度明顯高于空白組，黑種草子各給藥組較模型組均能抑制NF-κB及TNF-α的表達強度，其中黑種草子高劑量組最為明顯。

圖2　不同分組肝細胞NF-κB及TNF-α免疫組化染色(200)

3　討論

肝臟是乙醇在機體代謝中極為重要的臟器，過量的飲酒則會造成肝組織不同程度的損傷。隨著社會生活水平的不斷提高，乙醇性的肝損傷已經(jīng)成為了一個不可忽視健康問題[6-7]。其已成為繼病毒性肝炎后的另一種多發(fā)的肝損傷疾病[8]。在機體中90%以上的乙醇在肝臟中代謝[9]，當(dāng)過量飲酒后體內(nèi)的乙醇代謝顯著提高，從而產(chǎn)生大量的乙醛與細胞因子(如TNF-α)。乙醛對肝細胞有破壞作用，可使大量的肝細胞變性及壞死。而細胞因子則參與了肝細胞的損傷過程，過多的細胞因子可導(dǎo)致肝細胞發(fā)生炎性病變，造成肝臟的損傷[10]。

ALT及AST是肝細胞損傷的敏感指標(biāo)，ALT主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，AST主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)及線粒體中，當(dāng)肝細胞嚴(yán)重受損失時，會引起肝細胞通透性增加，胞質(zhì)內(nèi)的ALT及線粒體內(nèi)的AST會釋放進入血，導(dǎo)致血液中的ALT及AST的表達水平大幅升高[11]。因此血液內(nèi)ALT及AST的含量是衡量乙醇性肝損傷對肝臟影響的重要指標(biāo)。NF-κB是一種分布與作用十分廣泛的真核細胞轉(zhuǎn)錄因子，其與乙醇性肝病的發(fā)生,發(fā)展關(guān)系密切。它的功能有賴于它的活化，核內(nèi)聚集，DNA結(jié)合能力以及它所引起的相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，表達[12]。研究證實，長期乙醇攝入可以使肝組織中NF-κB活化，活化后的NF-κB進入細胞核內(nèi)與多種炎性反應(yīng)因子啟動子區(qū)域中κB序列結(jié)合，促進炎性反應(yīng)細胞因子的轉(zhuǎn)錄，引起肝細胞的進一步炎性反應(yīng)，壞死，凋亡與纖維化形成[13]。同時TNF-α在乙醇性肝損傷的發(fā)生，發(fā)展中也占有重要的地位，在敲除TNF-α受體基因的大鼠給予乙醇灌胃不引起肝臟的炎性反應(yīng)與壞死性改變[14]。同樣TNF-α也是NF-κB炎性反應(yīng)信號通路中關(guān)鍵的促炎物質(zhì)，它既是NF-κB的激活物質(zhì)，也是激活后的產(chǎn)物，其在NF-κB炎性反應(yīng)信號的傳導(dǎo)中起到了重要作用。

中草藥，特別是一些民族藥物在近些年中從多方面，多靶點的治療方式治療乙醇性肝損傷已逐漸得到認(rèn)可[15-16]。本實驗結(jié)果顯示，黑種草子水提液給藥后各給藥組均能提高小鼠肝臟重量及肝臟指數(shù)，并減緩ALT及AST升高的趨勢。其中黑種草子高劑量給藥組結(jié)果最為明顯。進一步觀察小鼠肝臟組織病理學(xué)切片發(fā)現(xiàn)高劑量黑種草子組能夠明顯減輕急性乙醇性肝損傷小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)的破壞及肝細胞的氣球樣變，腫脹及壞死。隨著黑種草子劑量的減少，其治療作用也逐步減弱。與空白組相比，急性乙醇性肝損傷小鼠肝組織NF-κB和TNF-α含量明顯升高，引起炎性損傷。與模型組相比，各劑量給藥組肝組織中NF-κB及TNF-α表達水平均明顯降低，且呈一定的劑量反映關(guān)系。

綜上所述黑種草子對急性乙醇性肝損傷有保護作用，其具體機制可能與通過抑制NF-κB炎性反應(yīng)信號通路的激活，減少了如TNF-α等炎性反應(yīng)因子的釋放，進而發(fā)揮其抗炎作用有關(guān)。

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(2015-12-01收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Study on the Protective Effect of Uygur Medicine Nigellae Semenon on Acute Alcoholic Liver Injury Mice and its Inhibition on NF-кB Signaling Pathway

Yu Shibo1,Kong Xiangyao1,Chen Mingcui1,He Xianzhu1,Wu Ning2

(1 Guizhou Medical University,Guiyang 550000,China; 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,China)

Objective:To explore the protective effects of Uygur medicine Nigellae Semen on acute alcoholic liver damage mice and its inhibition on NF-кB signaling pathway.Methods:After establishing acute alcoholic liver injury mice model,50 mice were randomly divided into blank group,model group,positive control group,nigellae semen extraction high dose (6 g/kg) group,and nigellae semen extraction low dose (2 g/kg) group.Except for the blank group,the other groups were orally administered 56 degree liquor 10 mL/kg for 15 days.After 10hrs of food forbidden but no water forbidden,observe the general state of mice,detect their body weight,liver weight,liver index,liver function indexes of alanine aminotransferase (ALT),aspartate aminotransferase (AST),the expression of NF-кB and TNF-α in liver tissue and liver tissue pathological changes.Results:Compared with the blank group,the body weight and liver index of the model group decreased,and serum ALT and AST activity significantly increased (P<0.05).Compared with the model group,the liver weight of mice,body weight and liver index increased in nigellae semen groups,while serum ALT and AST activity decreased significantly (P<0.05).Model group mice showed significantly hepatocytes ballooning degeneration,necrosis and accompanied by a small amount of inflammatory cells infiltration.Compared with the model group,the nigellae semen group showed lower pathological changes.Compared with the blank group,the serum concentrations of NF-кB and serum TNF-α content significantly increased in model group.Compare with the model group,the serum concentrations of NF-кB and serum TNF-α content significantly decreased in the nigellae semen groups.Conclusion:Nigellae semen extraction has a protective effect on acute alcoholic liver damage mice,and it can inhibit the expression of NF-кB and TNF-α liver cells.

Nigellae semenon; Alcoholic liver injury; Mice; NF-кB; TNF-α

國家科技支撐計劃項目(編號：2013BAI05B03)

于世博(1995.04—)，男，本科，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：841778339@qq.com

吳寧(1974.06—)，女，碩士，副教授，貴州醫(yī)科大學(xué)生物與分子化學(xué)教研室主任，研究方向：貴州特色中草藥防治疾病分子機制，E-mail：1638210715@qq.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.048