閆福媛 琚 堅(jiān) 高 藩 王曉青

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院特需病房科(650101)

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威靈仙總皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型血清IL-6、IL-17、TNF-α水平和肝臟病理的影響*

閆福媛#琚 堅(jiān)&高 藩 王曉青

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院特需病房科(650101)

背景：中藥威靈仙化學(xué)成分多樣，藥理作用廣泛。前期研究顯示威靈仙能有效干預(yù)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化。目的：研究威靈仙總皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠模型血清炎癥細(xì)胞因子和肝臟病理的干預(yù)作用。方法：以高脂飼料飼養(yǎng)16周誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型，分別予多烯磷脂酰膽堿和威靈仙總皂苷灌胃干預(yù)8周，同時(shí)設(shè)置不予藥物干預(yù)的模型組和以普通飼料飼養(yǎng)的空白組。以ELISA法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-17、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，以非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活動(dòng)度積分評(píng)估肝臟脂肪變性分度和炎癥分級(jí)。結(jié)果：經(jīng)8周藥物干預(yù)后，威靈仙總皂苷組血清IL-6、IL-17、TNF-α水平顯著低于模型組(P<0.01)，與空白組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，肝臟脂肪變性分度和炎癥分級(jí)亦較模型組顯著減輕(P<0.05)，與臨床常用保肝藥物多烯磷脂酰膽堿的作用無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論：威靈仙總皂苷可有效改善實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型的肝臟脂肪變性和炎癥損傷，降低血清炎癥細(xì)胞因子水平，療效與多烯磷脂酰膽堿相當(dāng)。其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肝臟免疫、對(duì)抗肝臟氧化應(yīng)激、改善胰島素抵抗等有關(guān)。

威靈仙； 皂苷類； 非酒精性脂肪性肝炎； 白細(xì)胞介素6； 白細(xì)胞介素17； 腫瘤壞死因子α

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除外乙醇以及其他明確的肝損害因素，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪性肝病以及由其演變而來的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)、肝纖維化和肝硬化[1]。NAFLD與酒精性脂肪性肝病的演進(jìn)過程一致，依次為脂肪肝→脂肪性肝炎→脂肪性肝纖維化→肝硬化→肝癌，因此NASH是NAFLD發(fā)展為肝硬化乃至肝癌的關(guān)鍵步驟。中藥威靈仙是毛茛科鐵線蓮屬植物威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮、東北鐵線蓮的干燥根和根莖，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)之功效[2]。威靈仙化學(xué)成分多樣，目前研究最多的是其中的多糖類和皂苷類物質(zhì)。威靈仙皂苷成分藥理作用廣泛，包括免疫抑制[3]、抗氧化[4]、抗炎[4-5]、抗腫瘤[6]等。本課題組前期研究[7]顯示威靈仙能有效干預(yù)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化，效果與臨床常用保肝藥物多烯磷脂酰膽堿無明顯差異。本研究通過比較威靈仙總皂苷和多烯磷脂酰膽堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型血清炎癥細(xì)胞因子和肝臟病理的干預(yù)作用, 探討應(yīng)用威靈仙總皂苷治療NSAH的價(jià)值。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠50只，平均體質(zhì)量(70±10) g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證：SCXK(滇)2005-0008。大鼠飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，于安靜環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，室溫(22±2) ℃，濕度50%±5%，通風(fēng)良好，自然晝夜光線，自由進(jìn)食、飲水。豬油(昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng))，蛋黃粉、膽固醇、膽酸鈉(上海源葉生物科技有限公司)，多烯磷脂酰膽堿膠囊[228 mg/粒，商品名：易善復(fù)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20059010，賽諾菲(北京)制藥有限公司]，威靈仙總皂苷(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)，大鼠血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒(eBioscience, Thermo Fisher Scientific Inc.)，大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒(RayBiotech, Inc.)。

二、方法

1. 造模階段動(dòng)物分組和NASH模型建立[8]：從50只大鼠中隨機(jī)抽取14只組成空白組，其余36只作為模型組?？瞻捉M予普通飼料飼養(yǎng)16 周；模型組予高脂飼料(82.5%普通飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉)飼養(yǎng)16 周。兩組分別于4、8、12、16周末各取1只、1只、2只、2只大鼠，處死后取出肝臟，在肝右葉中央部取1.0 cm×0.5 cm大小的肝組織，迅速于0.9% NaCl溶液中漂洗，4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，行HE染色，觀察肝組織病理學(xué)變化。檢查結(jié)果顯示高脂飼料飼養(yǎng)16周可成功建立實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型。

2. 藥物干預(yù)階段動(dòng)物分組和干預(yù)：實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型成功建立后，原模型組剩余30只大鼠隨機(jī)分為模型組、多烯磷脂酰膽堿組和威靈仙總皂苷組，每組10只；原空白組剩余8只大鼠仍作為空白組。多烯磷脂酰膽堿組、威靈仙總皂苷組大鼠分別予多烯磷脂酰膽堿(195.4 mg·kg-1·d-1)、威靈仙總皂苷(純度61.5%，50 mg·kg-1·d-1)，以 0.9% NaCl配制成3 mL溶液灌胃，模型組、空白組大鼠予0.9% NaCl溶液3 mL灌胃，每日上午9時(shí)灌胃一次，共8 周。

3. 血清標(biāo)本采集和細(xì)胞因子檢測(cè)：藥物干預(yù)結(jié)束后，大鼠禁食、禁水24 h，3%戊巴比妥鈉0.10～0.15 mL/100 g腹腔麻醉，下腔靜脈采血，離心、分離血清，以ELISA法測(cè)定IL-6、IL-17、TNF-α水平，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

4. 肝組織病理學(xué)評(píng)估：藥物干預(yù)結(jié)束后腹腔麻醉處死大鼠，取出肝臟，病理切片制備同造模階段。參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)》進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度積分(NAFLD activity score, NAS)評(píng)估[9]。肝細(xì)胞脂肪變性：0分，<5%；1分，5%～33%；2分，34%～66%；3分，>66%。小葉內(nèi)炎癥(20倍視野計(jì)數(shù)壞死灶)：0分，無；1分，<2個(gè)；2分，2～4個(gè)；3分，>4個(gè)。肝細(xì)胞氣球樣變：0分，無；1分，少見；2分，多見?？偡譃?～8分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

采用高脂飼料飼養(yǎng)16周可成功建立實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型，肝組織無肝纖維化?？瞻捉M大鼠肝臟大體觀察體積正常，表面光滑有光澤，色粉紅，觸之質(zhì)軟，肝組織切片未見明顯肝細(xì)胞脂肪變、氣球樣變、炎癥壞死或纖維化；模型組大鼠肝臟體積增大，表面光澤差，色淡黃，切之有油膩感，可見肝細(xì)胞脂肪變和較多氣球樣變，門管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

A、B：空白組；C、D：模型組；A、C：大體表現(xiàn)；B、D：組織學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×200)

圖1 空白組和模型組大鼠高脂飲食16周末肝臟大體和組織 學(xué)表現(xiàn)

二、血清IL-6、IL-17、TNF-α水平

經(jīng)8周藥物干預(yù)后，多烯磷脂酰膽堿組、威靈仙總皂苷組血清IL-6、IL-17、TNF-α水平均顯著低于模型組(P<0.01)，多烯磷脂酰膽堿組與威靈仙總皂苷組間差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組與空白組間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

三、肝臟脂肪變性分度和炎癥分級(jí)

8周末，模型組表現(xiàn)為Ⅳ度肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞較多氣球樣變，部分門管區(qū)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉內(nèi)多數(shù)有灶狀壞死。多烯磷脂酰膽堿組、威靈仙總皂苷組經(jīng)8周藥物干預(yù)后，肝臟脂肪變性分度和炎癥分級(jí)較模型組顯著減輕(P<0.01,P<0.05)，多烯磷脂酰膽堿組與威靈仙總皂苷組間差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但兩組仍顯著高于空白組(P<0.01)(表2)。

表2 各組肝臟脂肪變性分度、炎癥分級(jí)比較

*與空白組比較，P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01

討 論

中藥威靈仙化學(xué)成分復(fù)雜，主要有揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分兩大類，前者主要包括棕櫚酸3-羥基-4-甲氧基苯甲醛、二十碳烷等，后者主要包括三萜及其苷類、黃酮和多元酚類、有機(jī)酸類、生物堿類等[10]。威靈仙的藥理作用廣泛，如苷類中的原白頭翁素和白頭翁素有抑菌、抗菌活性；皂苷類具有鎮(zhèn)痛抗炎、免疫抑制、抗纖維化、抗氧化、抗腫瘤、降低尿酸作用；多糖類具有抗腫瘤、抗氧化作用；黃酮類有利膽作用等[3-6,10-11]。文獻(xiàn)報(bào)道皂苷元齊墩果酸可對(duì)多種原因引起的急性肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用，并具有抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)收縮、抗肝纖維化、抗門靜脈高壓作用[12-13]。本研究通過血清炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-17、TNF-α檢測(cè)以及肝臟脂肪變性分度和炎癥分級(jí)評(píng)估，對(duì)威靈仙化學(xué)成分中的總皂苷對(duì)NASH這一NAFLD進(jìn)展至肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)的干預(yù)作用及其可能機(jī)制進(jìn)行了探討。

表1 各組血清炎癥細(xì)胞因子水平比較±s, pg/mL)

*與模型組比較，P<0.01

IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，然而關(guān)于其在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中是起正性還是負(fù)性作用，目前并無明確的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)IL-6能抑制胰島素受體底物1(IRS1)，從而影響胰島素受體與底物結(jié)合后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生[14-16]。然而亦有研究[17]指出，盡管一般程度地阻斷IL-6-STAT3信號(hào)通路可減輕NASH肝損傷，但對(duì)于重度NASH，IL-6信號(hào)是一個(gè)保護(hù)因素，以蛋氨酸膽堿缺乏飲食在db/db肥胖小鼠(本身即存在STAT3活化受損)中誘導(dǎo)NASH，予抗小鼠IL-6受體特異性抗體以進(jìn)一步阻斷STAT3活化可增強(qiáng)肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化/氧化應(yīng)激，進(jìn)而加重肝損傷。Kroy等[18]的研究顯示，以膽堿缺乏乙硫氨酸補(bǔ)充飲食誘導(dǎo)NASH，IL-6缺陷小鼠更易發(fā)生肝臟脂肪變性和炎癥損傷，導(dǎo)致重度NASH，伴高糖血癥和血清胰島素水平升高。Miller等[19]發(fā)現(xiàn)，抗炎細(xì)胞因子IL-10缺陷小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肝臟炎癥反應(yīng)，伴IL-6水平升高和STAT3激活，但給予乙醇或高脂飲食后并不發(fā)生嚴(yán)重肝臟脂肪變性和肝細(xì)胞損傷，在IL-10缺陷小鼠中敲除IL-6或STAT3則可引起肝臟脂肪變性和肝細(xì)胞損傷，且肝臟炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，提示IL-6-STAT3信號(hào)激活有抗脂肪變性作用。本研究中實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型血清IL-6水平顯著升高，這提示對(duì)于NASH的發(fā)生、發(fā)展，IL-6主要起促進(jìn)作用。

IL-17是由Th17細(xì)胞分泌的重要的促炎細(xì)胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)肥胖人群中存在IL-17軸激活，在NAFLD的發(fā)生以及由單純性脂肪性肝病向NASH轉(zhuǎn)變中起極為重要的作用[20-21]。在IL-17A受體(IL-17RA)缺陷小鼠中，高脂飲食可引起內(nèi)臟脂肪沉積、肝臟脂肪變性，但并不發(fā)生嚴(yán)重的脂肪性肝炎和肝細(xì)胞損傷[20]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-17可引起胰島素抵抗，導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性；高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟中Th17細(xì)胞數(shù)量顯著增多，予中和IL-17后，模型小鼠由脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷明顯減輕，血清ALT水平降低，肝臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；NASH患者肝臟中IL-17陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)亦顯著增多[21]。本研究中，實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型血清IL-17水平升高顯著，與上述研究結(jié)果相符。

目前研究認(rèn)為TNF-α可通過多條途徑促進(jìn)NAFLD進(jìn)展：①誘導(dǎo)STAT3表達(dá)，抑制胰島素受體，從而阻礙胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起胰島素抵抗[15]。②誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體表達(dá)，抑制膽固醇向肝外轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致肝內(nèi)膽固醇蓄積，消耗線粒體中的谷胱甘肽，使肝細(xì)胞中活性氧生成增加，加劇氧化應(yīng)激，加重肝細(xì)胞損傷[22]。此外，肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂質(zhì)蓄積時(shí)，TNF-α可上調(diào)細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)表達(dá)，激活蛋白激酶通路，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、凋亡[23]。本研究中，實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型血清TNF-α水平升高顯著，證實(shí)其參與了NASH的發(fā)生。

本組實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型經(jīng)威靈仙總皂苷干預(yù)8周后，肝臟脂肪變性和炎癥損傷明顯減輕，同時(shí)血清IL-6、IL-17、TNF-α降低至正常水平，與臨床常用保肝藥物多烯磷脂酰膽堿療效相當(dāng)。推測(cè)威靈仙總皂苷可能通過改善肝臟脂肪變性、減輕肝細(xì)胞炎癥、調(diào)節(jié)肝臟免疫、對(duì)抗肝臟氧化應(yīng)激、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)肝臟Kupffer細(xì)胞吞噬功能等途徑[15]，降低NASH大鼠模型的血清炎癥細(xì)胞因子水平，減輕肝組織損傷，達(dá)到有效治療和改善NASH的目的。確切機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。

NAFLD是一組多機(jī)制、多進(jìn)程的代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，主流觀點(diǎn)為“二次打擊”學(xué)說。炎癥因子中的細(xì)胞因子作為“二次打擊”學(xué)說中“第二次打擊”的關(guān)鍵因素，在 NASH的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。目前尚無針對(duì)NASH的特效藥物，因此闡明細(xì)胞因子在NAFLD疾病進(jìn)程中的作用機(jī)制及其確切作用環(huán)節(jié)，尋找其中的關(guān)鍵因子作為NASH治療的靶點(diǎn)具有廣泛臨床應(yīng)用前景。威靈仙總皂苷能有效降低高脂飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型的血清IL-6、IL-17、TNF-α水平，改善肝臟病理表現(xiàn)，或許能為NASH的治療和預(yù)防提供新思路。本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，抽樣誤差大，且高脂飼料飼養(yǎng)大鼠16周無法建立肝纖維化模型，后續(xù)研究擬擴(kuò)大樣本量，建立有肝纖維化表現(xiàn)的大鼠模型并行纖維化Masson染色以彌補(bǔ)上述缺陷，明確威靈仙總皂苷對(duì)肝纖維化是否有預(yù)防和治療作用。

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(2016-01-18收稿；2016-02-04修回)

Effect of Total Saponins of Radix clematidis on Serum IL-6, IL-17, TNF-α and Liver Pathology in Experimental NASH Rats

YANFuyuan,JUJian,GAOFan,WANGXiaoqing.

DepartmentofSpecialWard,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming(650101)

JU Jian, Email: jujianyn@163.com

CLEMATIS CHINENSIS; Saponins; Non-Alcoholic Steatohepatitis; Interleukin-6;Interleukin-17; Tumor Necrosis Factor-alpha

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.09.003

云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃基金(2012WS0091)

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&本文通信作者，Email: jujianyn@163.com

Background: Radix clematidis is a Chinese herbal medicine with complex chemical components and broad pharmacological activities. It has been demonstrated that Radix clematidis is effective in treating experimental liver fibrosis. Aims: To investigate the intervention effect of total saponins of Radix clematidis on serum inflammatory cytokines and liver pathology in rats with experimental non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Methods: Sprague-Dawley rats were fed with high fat diet for 16 weeks to induce experimental NASH and then received polyene phosphatidyl choline or total saponins of Radix clematidis intragastrically for 8 weeks. Rats fed with high fat diet without drug intervention and rats fed with normal diet were served as NASH control and blank control, respectively. Serum levels of interleukin-6 (IL-6), IL-17 and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by ELISA method, the hepatic steatosis and inflammation were evaluated by using non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score. Results: After 8 weeks intervention, serum levels of IL-6, IL-17 and TNF-α were significantly decreased in total saponins group than in NASH control group (P<0.01), and no significant difference was seen between total saponins group and blank control group (P>0.05). Severity of hepatic steatosis and inflammation were also reduced markedly in total saponins group (P<0.05). The efficacy of total saponins of Radix clematidis was similar to that of polyene phosphatidyl choline, a commonly used hepatoprotective agent (P>0.05). Conclusions: Total saponins of Radix clematidis is effective for ameliorating hepatic steatosis and inflammatory injury and reducing serum inflammatory cytokines in rats with experimental NASH, the efficacy is equal to polyene phosphatidyl choline. Total saponins of Radix clematidis may exerts the therapeutic effect on NASH by its immunomodulation, antioxidant and anti-insulin resistance activities.