馮仁鑫 陳 升 劉 嬌 寧北芳 謝渭芬

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院消化內(nèi)科(200003)

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·論 著·

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞的影響*

馮仁鑫#陳 升#劉 嬌 寧北芳 謝渭芬&

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院消化內(nèi)科(200003)

背景：腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)是腫瘤微環(huán)境中一類特殊的間質(zhì)細(xì)胞，研究顯示CAF在一些惡性腫瘤中可調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞(CSC)的干細(xì)胞特性和致瘤性。然而在肝細(xì)胞癌(HCC)中，CAF對CSC的調(diào)控作用尚不清楚。目的：探討CAF對肝癌干細(xì)胞的影響。方法：分別采用免疫組化和免疫熒光技術(shù)標(biāo)記CD44陽性CSC和α-SMA陽性CAF，觀察兩者在人HCC標(biāo)本中的位置關(guān)系。從HCC手術(shù)標(biāo)本中分離、純化CAF和癌旁成纖維細(xì)胞(PTF)，收集相應(yīng)條件培養(yǎng)基和干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。以real-time PCR檢測CAF或PTF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株HuH-7中的肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)分選肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物EpCAM陽性HuH-7細(xì)胞，以CAF或PTF干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，行干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)。結(jié)果：在HCC標(biāo)本中，CAF與CSC位置緊鄰。與PTF組和對照組HuH-7細(xì)胞相比，CAF條件培養(yǎng)基處理組HuH-7細(xì)胞肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物基因和自我更新相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)(P均<0.05)。CAF干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組未經(jīng)分選的HuH-7細(xì)胞和EpCAM陽性HuH-7細(xì)胞，成球率分別顯著高于相應(yīng)PTF組和對照組細(xì)胞(19.15%、32.13%對10.89%、19.57%和12.57%、19.77%，P均<0.001)。結(jié)論：CAF在肝癌干細(xì)胞自我更新能力的維持和促進(jìn)中起重要作用。

癌，肝細(xì)胞； 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞； 腫瘤干細(xì)胞； 自我更新； 球形體，細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSC)是腫瘤組織中一小群具有自我更新能力并能分化產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞，在維持腫瘤細(xì)胞惡性表型如增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥性等方面發(fā)揮重要作用[1]，可為特殊的細(xì)胞表面標(biāo)記物所標(biāo)記。目前CD133、CD24、CD44、CD90、上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)、DLK1(delta-like 1 homologue)等表面標(biāo)記物均被用于肝癌干細(xì)胞的分離和鑒定[2-3]。腫瘤微環(huán)境中還有一類特殊的間質(zhì)細(xì)胞，即腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)，對維持腫瘤的標(biāo)志性特征，如增殖信號的持續(xù)活化、誘導(dǎo)血管生成、抵抗細(xì)胞死亡、改變細(xì)胞能量代謝等具有重要意義[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)CAF可調(diào)節(jié)胃癌[5]、結(jié)直腸癌[6]、前列腺癌[7]等惡性腫瘤中CSC的干細(xì)胞特性和致瘤性。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)多發(fā)生于肝纖維化和肝硬化患者，癌組織和癌旁組織中含有大量成纖維細(xì)胞。本課題組前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，CAF可通過分泌趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CXCL16激活HCC細(xì)胞中的Hedgehog(Hh)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，但CAF對肝癌干細(xì)胞的影響尚有待明確，本研究對此進(jìn)行了探討。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

用于分離CAF和癌旁成纖維細(xì)胞(peritumoral fibroblasts, PTF)的人HCC組織及其配對癌旁組織(取自距癌灶邊緣≥5 cm處)來源于上海東方肝膽外科醫(yī)院原發(fā)性HCC手術(shù)患者，患者術(shù)前簽署手術(shù)標(biāo)本使用同意書。

二、細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人肝癌細(xì)胞株HuH-7(中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、非必需氨基酸(HyClone, GE Healthcare)，F(xiàn)BS、ITS細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、谷氨酰胺、B-27添加劑(Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc.)，青-鏈霉素混合液(Sigma-Aldrich Co.)，抗人成纖維細(xì)胞磁珠、熒光標(biāo)記EpCAM抗體(Miltenyi Biotec)，表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)(R&D Systems)，兔抗人CD44抗體(BD Biosciences)，小鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，Alexa Fluor?488驢抗小鼠IgG、TRIzol?試劑、SuperScript?Ⅲ cDNA合成試劑盒(Invitrogen, Thermo Fisher Scien-tific Inc.)，SYBR?Premix Ex TaqTMreal-time PCR試劑盒(TAKARA BIO INC.)。免疫磁珠細(xì)胞分選儀(Miltenyi Biotec)，熒光顯微鏡(Carl Zeiss AG)，real-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc.)，流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)。

三、方法

1. CAF、PTF的分離、純化：采用免疫磁珠細(xì)胞分選法(MACS)分離CAF和PTF[8]。以PBS將標(biāo)本洗凈后剪成1 mm3的小塊，加入含0.5%膠原酶Ⅳ、1% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育30 min。待組織完全消化后收集細(xì)胞懸液，離心、棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于原代成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基(含10% FBS、1% ITS細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、1%青-鏈霉素、1%谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基)。將培養(yǎng)2～3代的原代成纖維細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后重懸于MACS緩沖液中，加入抗人成纖維細(xì)胞磁珠后上柱，在免疫磁珠細(xì)胞分選儀中進(jìn)行純化。純化后的CAF、PTF培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，取4～10代純化的CAF、PTF進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2. CAF、PTF條件培養(yǎng)基收集

① 3% FBS成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基：將1×105CAF、PTF分別接種于35 mm培養(yǎng)皿中，待貼壁后更換為含3% FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)上清。

② 成纖維細(xì)胞干細(xì)胞條件培養(yǎng)基：將1×105CAF、PTF分別接種于35 mm培養(yǎng)皿中，待貼壁后更換為干細(xì)胞培養(yǎng)基(含1% ITS細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、1%非必需氨基酸、1% B-27添加劑、40 ng/mL EGF、20 ng/mL FGF的DMEM培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)上清。

收集得到的上述條件培養(yǎng)基以0.22 μm濾膜過濾后直接用于HuH-7細(xì)胞培養(yǎng)，或液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 免疫組化和免疫熒光標(biāo)記：HCC組織石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液煮沸抗原修復(fù)，10%山羊血清封閉，依次加入兔抗人CD44抗體(1∶200)和酶標(biāo)山羊抗兔二抗孵育，DAB顯色，陽性染色為棕黃色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后5%馬血清封閉2 h，依次加入小鼠抗人α-SMA抗體(1∶200)和Alexa Fluor?488驢抗小鼠IgG (1∶500)孵育，封片，于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

4. Real-Time PCR檢測肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)：將4×105HuH-7細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，待貼壁后更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后更換為3% FBS CAF或PTF條件培養(yǎng)基，對照組更換為3% FBS DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。TRIzol?試劑提取細(xì)胞總RNA，取1 μg總RNA為模板合成cDNA，以合成的cDNA為模板行real-time PCR擴(kuò)增，操作步驟均參照試劑盒說明書。PCR引物序列見表1，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

表1 Real-Time PCR 引物序列

5. 流式細(xì)胞分選：將1×107HuH-7細(xì)胞重懸于80 μL含0.5% BSA、2 mmol/L EDTA的流式緩沖液，加入10 μL 熒光標(biāo)記EpCAM抗體或同型對照IgG，充分混勻，冰上避光孵育10 min，加入1～2 mL流式緩沖液重懸細(xì)胞，300×g離心5 min，棄上清。將細(xì)胞沉淀重懸于150 μL流式緩沖液，上流式細(xì)胞儀，收集分選的EpCAM陽性細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6. 干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)：將未經(jīng)分選的HuH-7細(xì)胞或流式細(xì)胞術(shù)分選的EpCAM陽性HuH-7細(xì)胞以約10個(gè)/孔的密度加入低吸附96孔板，精確計(jì)數(shù)每孔加入的細(xì)胞數(shù)并記錄。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)組別：干細(xì)胞培養(yǎng)基處理組(對照組)、PTF干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組(PTF組)和CAF干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組(CAF組)，培養(yǎng)7 d后計(jì)數(shù)成球細(xì)胞(細(xì)胞間邊緣發(fā)生融合)數(shù)，計(jì)算成球率。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、CAF與CSC在HCC標(biāo)本中位置緊鄰

CD44為細(xì)胞跨膜糖蛋白之一，參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用，多項(xiàng)研究以CD44為CSC標(biāo)記物，從多種肝癌細(xì)胞株或HCC組織中分選CSC。CD44陽性細(xì)胞較CD44陰性細(xì)胞具有更強(qiáng)的CSC特征，在體外有更強(qiáng)的成球能力和抵御化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的能力，在小鼠體內(nèi)有更強(qiáng)的致瘤性[9-11]。α-SMA是應(yīng)用最廣泛的成纖維細(xì)胞表面標(biāo)記物[12]。本研究采用免疫組化技術(shù)標(biāo)記CD44陽性CSC，采用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記α-SMA陽性CAF，結(jié)果顯示CAF與CSC在HCC標(biāo)本中位置緊鄰(圖1)。作為HCC中含量最豐富的間質(zhì)細(xì)胞之一，CAF與CSC密切的位置關(guān)系提示其可能通過直接接觸或旁分泌作用影響CSC的生物學(xué)特性。

二、CAF促進(jìn)肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

HuH-7細(xì)胞經(jīng)3% FBS CAF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，real-time PCR檢測顯示，肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物基因CD44、CD90、CD133、EpCAM表達(dá)顯著高于3% FBS PTF條件培養(yǎng)基處理組和對照組(P均<0.05)，PTF組與對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；此外，自我更新相關(guān)基因Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1在CAF組HuH-7細(xì)胞中的表達(dá)亦顯著上調(diào)(P均<0.05)(圖2)。

三、CAF促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新

EpCAM是一種鈣離子依賴的細(xì)胞表面連接蛋白，表達(dá)于多種人類上皮細(xì)胞，其表達(dá)升高常伴隨腫瘤早期的變化[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)分選出的EpCAM陽性HCC細(xì)胞顯示出自我更新和分化的CSC樣特征，且在NOD-SCID小鼠體內(nèi)較未經(jīng)分選的HCC細(xì)胞有更強(qiáng)的致瘤性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。為驗(yàn)證CAF對肝癌干細(xì)胞自我更新能力的影響，本研究以EpCAM為分選標(biāo)記物，采用流式細(xì)胞術(shù)從人肝癌細(xì)胞株HuH-7中分選出CSC，檢測未經(jīng)分選的HuH-7細(xì)胞與EpCAM陽性HuH-7細(xì)胞(肝癌干細(xì)胞)的成球能力。檢測結(jié)果顯示，未經(jīng)分選的HuH-7細(xì)胞經(jīng)CAF干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理后，成球率為19.15%，顯著高于PTF干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組(10.89%)和對照組(12.57%)(P均<0.001)，PTF組與對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在EpCAM陽性HuH-7細(xì)胞中，CAF組成球率亦顯著高于PTF組和對照組(32.13%對19.57%和19.77%，P均<0.001)，且三組成球率均明顯高于給予相同處理的未經(jīng)分選的HuH-7細(xì)胞。上述結(jié)果表明CAF可顯著提高肝癌干細(xì)胞和HCC細(xì)胞的成球能力，促進(jìn)兩者自我更新，而PTF對兩種細(xì)胞的自我更新能力無明顯影響(圖3)。

討 論

CSC是腫瘤組織中一小群具有下述特性的干細(xì)胞：①特異的表面標(biāo)記物；②自我更新和無限增殖；③分化潛能；④高致瘤性；⑤輻射抵抗性；⑥耐藥性[1,15]。目前觀點(diǎn)認(rèn)為CSC是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的根本原因，也是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移、 復(fù)發(fā)以及耐藥的關(guān)鍵因素之一[16-17]。

標(biāo)尺=200 μm

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

兩組間比較，***P<0.001

在眾多間質(zhì)細(xì)胞中，CAF作為在腫瘤組織中活化的成纖維細(xì)胞，與PTF相比具有更強(qiáng)的促進(jìn)腫瘤惡性行為的能力[8]。關(guān)于CAF與CSC間相互作用的研究顯示，化療藥物可促進(jìn)CAF分泌白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌干細(xì)胞自我更新和腫瘤生長[6]；CAF還可通過激活TGF-β信號通路促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的自我更新能力和致瘤性[5]；在非小細(xì)胞肺癌中，CAF甚至可通過激活胰島素樣生長因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)/IGF1受體(IGF1R)信號通路，誘導(dǎo)自我更新相關(guān)基因Nonag表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞去分化成為CSC樣細(xì)胞[18]。然而在HCC中，CAF對CSC的調(diào)控作用尚不清楚。

本研究從人HCC組織及其配對癌旁組織中分離、純化CAF和PTF，探討CAF對CSC生物學(xué)特性的影響。免疫組化和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)顯示CAF與CSC在HCC標(biāo)本中位置緊鄰，提示兩者間可能存在直接接觸或旁分泌關(guān)系。以CAF或PTF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HuH-7，real-time PCR檢測顯示CAF條件培養(yǎng)基可促進(jìn)肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物基因表達(dá)，其中CD44表達(dá)量約為PTF組和對照組的4倍，其他表面標(biāo)記物表達(dá)量亦分別上調(diào) 2～3倍。同時(shí)，CAF條件培養(yǎng)基還可促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新相關(guān)基因表達(dá)，以Klf4表達(dá)上調(diào)最為顯著，約為對照組的3.5倍。

CSC在特定生長環(huán)境下具有很強(qiáng)的自我更新和增殖能力。干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)是分離和研究CSC的一種較為成熟的方法，即將單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于低吸附培養(yǎng)皿中，以含有特殊細(xì)胞因子的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的自我更新能力，目前已利用該技術(shù)在結(jié)直腸癌[19]、肺癌[20]、胰腺癌[21]等腫瘤細(xì)胞株中成功分離、富集相應(yīng)CSC。本研究以CAF或PTF干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)未經(jīng)分選的HuH-7細(xì)胞和經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選的EpCAM陽性HuH-7細(xì)胞(肝癌干細(xì)胞)，發(fā)現(xiàn)CAF可提高肝癌干細(xì)胞和HCC細(xì)胞的成球能力(成球率分別增高12.36% 和6.58%)，而PTF則無此作用，證實(shí)CAF可促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新。既往研究顯示Hh和TGF-β信號通路在CSC干細(xì)胞特性的維持中起重要作用[22-23]，本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)CAF分泌的趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CXCL16可激活HCC細(xì)胞中的Hh和TGF-β信號通路[8]，結(jié)合本研究結(jié)果，提示CAF可能通過旁分泌作用促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新。

綜上所述，CAF在肝癌干細(xì)胞自我更新能力的維持和促進(jìn)中起重要作用，這一發(fā)現(xiàn)為以CAF與CSC之間的相互作用為靶點(diǎn)的HCC生物靶向治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2016-06-06收稿；2016-06-27修回)

Effect of Cancer-associated Fibroblasts on Cancer Stem Cells in Hepatocellular Carcinoma

FENGRenxin,CHENSheng,LIUJiao,NINGBeifang,XIEWeifen.

DepartmentofGastroenterology,ChangzhengHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai(200003)

XIE Weifen, Email: weifenxie@medmail.com.cn

Carcinoma, Hepatocellular; Cancer-Associated Fibroblasts; Neoplastic Stem Cells; Self-Renewal;Spheroids, Cellular

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.09.002

國家自然科學(xué)基金(81572412)

#本文共同第一作者，馮仁鑫，Email: fengrenxin1989@163.com；陳升，Email: chenshengemc@163.com

&本文通信作者，Email: weifenxie@medmail.com.cn

Background: Cancer-associated fibroblasts (CAF) are a class of specific mesenchymal cells in tumor microenvironment. It has been demonstrated that CAF might regulate the stemness and tumorigenicity of cancer stem cells (CSC) in some malignancies, however, the regulatory effect of CAF on CSC in hepatocellular carcinoma (HCC) is not clear yet. Aims: To explore the effect of CAF on CSC in HCC. Methods: CD44-positive CSC and α-SMA-positive CAF were labeled by immunohistochemistry and immunofluorescence, respectively, for localization of CSC and CAF in human HCC tissue. CAF and peritumoral fibroblasts (PTF) were isolated and purified from HCC surgical specimens, and the respective conditioned medium (CM) and stemness CM were collected. Human HCC cell line HuH-7 was cultured with CAF- or PTF-CM, and the expression of hepatic CSC-related genes in HuH-7 cells was evaluated by real-time PCR. HuH-7 cells positive for EpCAM, a cell surface hepatic CSC marker, were obtained by fluorescence-activated cell sorting, and cultured with CAF- or PTF-stemness CM for spheroid formation. Results: CAF was adjacent to CSC in HCC tissue. When compared with PTF-CM and controlled CM, CAF-CM up-regulated the expression of hepatic CSC surface marker genes and self-renewal-related genes in HuH-7 cells (Pall <0.05). The spheroid formation rates of unsorted HuH-7 cells and EpCAM-positive HuH-7 cells in CAF-stemness CM were significantly higher than those in PTF-stemness CM and controlled stemness CM (19.15%, 32.13%vs. 10.89%, 19.57% and 12.57%, 19.77%,Pall <0.001). Conclusions: CAF play important roles in the maintenance and enhancement of self-renewal capability of hepatic CSC.