吳成，金維政，趙志強(qiáng)，王蕾

（山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)村能源總站，濟(jì)南 250100）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中甲硫威及其代謝物殘留

吳成，金維政，趙志強(qiáng)，王蕾

（山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)村能源總站，濟(jì)南 250100）

建立了蔬菜中甲硫威及其代謝物（甲硫威亞砜和甲硫威砜）殘留的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品以乙腈提取，采用電噴霧正離子源（ESI+）和多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，甲硫威、甲硫威亞砜、甲硫威砜的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.995，甲硫威和甲硫威亞砜的線性范圍為0.001～0.1 mg/L、甲硫威砜的線性范圍為0.006～0.1 mg/L，方法檢出限和定量限分別為0.4～3.0 μg/kg和1.4～10.0 μg/kg。在10，50，100 μg/kg 3個(gè)添加水平下，甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜的回收率為71.0%～98.1%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.5%～9.9%（n=6）。該法簡單、準(zhǔn)確、快速、靈敏，符合法規(guī)殘留限量監(jiān)測要求。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；甲硫威；甲硫威亞砜；甲硫威砜；蔬菜

甲硫威屬中等毒性殺軟體動(dòng)物劑，具有觸殺和胃毒作用［1］。GB 2763-2014規(guī)定甲硫威殘留為甲硫威及其代謝物（甲硫威亞砜和甲硫威砜）之和［2］。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23214-2008，GB/T 20770-2008和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1679-2009可用于檢測甲硫威［3-5］，出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0527-2012可檢測甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜［6］。甲硫威殘留主要檢測方法有液相色譜-柱后衍生熒光法［7］、氣相色譜-質(zhì)譜法［8］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［9-10］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［3-6，11-15］，甲硫威亞砜和甲硫威砜殘留檢測文獻(xiàn)報(bào)道方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［6，11-15］。甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測時(shí)，現(xiàn)有文獻(xiàn)均選擇加氫峰離子作母離子［3-6，11-15］。筆者研究發(fā)現(xiàn)，在相同的儀器工作條件下，相較于加氫峰離子，甲硫威和甲硫威砜的加銨峰離子信號更強(qiáng)且穩(wěn)定。GB 2763-2014規(guī)定了蔬菜中甲硫威殘留限量值，其中，抱子甘藍(lán)、結(jié)球萵苣和馬鈴薯的限量值最低，為0.05 mg/kg［2］。目前，用LC-MS/MS檢測甲硫威及其代謝物殘留的文獻(xiàn)集中于煙草與谷物［6，11-15］，未見蔬菜中甲硫威及其代謝物殘留的檢測方法。筆者以抱子甘藍(lán)、結(jié)球萵苣和馬鈴薯作蔬菜代表，用LC-MS/MS開展蔬菜中甲硫威及其代謝物殘留檢測的研究，建立了甲硫威及其代謝物殘留的快速確證檢測方法。該法操作簡單，快速、靈敏，精密度和回收率較好，適合蔬菜中甲硫威及其代謝物殘留的確證和定量測定。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：LCMS-8040型，配電噴霧離子源（ESI），日本Shimadzu公司；

離心機(jī)：LDZ5-2型，北京京立離心機(jī)公司；

食品加工機(jī)：k600型，荷蘭Philips公司；

均質(zhì)器：T18型，德國IKA公司；

電子天平：JY2001型，感量為0.1 g，上海精密儀器公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國Merck公司；

甲酸、乙酸銨、氯化鈉：分析純，上海化學(xué)試劑有限公司；

抱子甘藍(lán)、結(jié)球萵苣、馬鈴薯：市售，依據(jù)SN/T 0527-2012［6］檢測，以確保空白樣品無甲硫威殘留；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用甲醇稀釋甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜標(biāo)準(zhǔn)溶液為100 mg/L單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20.0℃冰箱保存，使用時(shí)用甲醇-水溶液（1+1）稀釋至所需的濃度。

關(guān)于本組80例患者的掃描診斷情況，如表1所示。多層螺旋CT與MRI檢查肺動(dòng)脈栓塞顯示率均為100%，圖像質(zhì)量較高，且多層螺旋CT掃描時(shí)間短于MRI（P＜0.05）。

1.3儀器工作條件

1.3.1液相色譜

色譜柱：Waters symmetry C18柱（150 mm×3.9 mm，5 μm，美國Waters公司）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（體積比為75∶25，含5 mmol/L乙酸銨）；流量：0.4 mL/min；等度洗脫；進(jìn)樣體積：1 μL；信號采集時(shí)長：8.0 min。

1.3.2質(zhì)譜

電噴霧正離子源（ESI+）接口電壓：4.5 kV；電噴霧負(fù)離子源（ESI-）接口電壓：-3.5 kV；霧化氣：3.0 L/min氮?dú)?；干燥氣?5.0 L/min氮?dú)?；碰撞氣：氬氣；脫溶劑管溫度?50℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；駐留時(shí)間：20 ms；延遲時(shí)間：3 ms；各監(jiān)測離子對的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1　LC-MS/MS 測定甲硫威及其代謝物的部分參數(shù)

1.4樣品處理

按GB/T 8855-2008 《新鮮水果和蔬菜取樣方法》抽取抱子甘藍(lán)、結(jié)球萵苣和馬鈴薯樣品，取可食部分［16］，縮分、切碎、混勻，放入食品加工機(jī)中粉碎，制成待測樣，置于-20.0℃冰箱中保存。稱取樣品15.0 g于50 mL具塞離心管，加入30.0 mL乙腈，用均質(zhì)器以12 000 r/min均質(zhì)2 min，加入5.0 g氯化鈉，劇烈振搖2 min，以5 000 r/min離心5 min，取上清液10.0 mL于100 mL燒杯中，以60℃水浴氮吹至近干，用甲醇-水溶液（1+1）轉(zhuǎn)移定容至2.0 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測。

2　結(jié)果與討論

2.1提取溶劑的選擇

對不同基質(zhì)蔬菜樣品，選取乙腈、乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷為提取溶劑進(jìn)行提取對比試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蔬菜富含水分，丙酮與水互溶，除去水分較困難；二氯甲烷易乳化與水相分層不明顯，且二氯甲烷價(jià)格較高且毒性較大；乙酸乙酯提取色素較多；乙腈與水部分互溶，加入氯化鈉后，乙腈層與下層飽和氯化鈉溶液分層明顯，氯化鈉溶液能除去部分水溶性雜質(zhì)。因此實(shí)驗(yàn)選取乙腈作為蔬菜中甲硫威及其代謝物殘留檢測的提取溶劑。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別采用ESI+和ESI-對甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜進(jìn)行母離子掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESI+模式下，甲硫威亞砜的加氫峰離子、甲硫威和甲硫威砜的加銨峰離子信號均較強(qiáng)且穩(wěn)定，以相應(yīng)離子作母離子，利用島津LCMS-8040 Optimizer軟件對甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜的子離子、四極桿預(yù)桿偏置電壓（Q1和Q3）、碰撞池電壓（CE）等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表1。

用優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜條件，在MRM模式下，進(jìn)0.1 mg/L甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜混標(biāo)1.0 μL，得總離子流圖（TIC）見圖1（峰保留時(shí)間與表1洗脫出峰順序?qū)?yīng)），計(jì)算定性離子與定量離子（基峰離子）信號強(qiáng)度比（豐度比，見表1），依據(jù)歐盟2002/657文件規(guī)定的質(zhì)譜技術(shù)中相對離子強(qiáng)度的最大允許限度范圍，結(jié)合樣品色譜峰保留時(shí)間和扣背景質(zhì)譜圖，可確證樣品中甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜的存在。

圖1　甲硫威及其代謝物的總離子流圖（TIC）

2.3凈化條件的選擇

選取氨基固相萃取柱（6 mL/1 000 mg）、石墨化炭黑氨基串聯(lián)固相萃取柱（6 mL，500 mg GCB/500 mg NH2—）和基質(zhì)分散固相萃取試劑盒（15 mL，400 mg PSA/400 mg C18/400 mg GCB/1 200 mg MgSO4）進(jìn)行蔬菜基質(zhì)樣品乙腈提取液凈化對比試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3種凈化手段效率都不高，操作步驟繁瑣，對分析物的回收有一定影響。本實(shí)驗(yàn)樣品前處理采取鹽析、乙腈提取、離心和過有機(jī)濾膜，雖不能充分去除樣品中色素、糖類和脂類，但不存在農(nóng)藥多殘留測定中固相萃取時(shí)一些農(nóng)藥的吸附損失，并且當(dāng)前LC-MS/MS儀器結(jié)構(gòu)性能得到改進(jìn)，具有較好的抗色素、糖類和脂類干擾能力，質(zhì)譜儀進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源及離子傳輸通道等的清洗很方便，樣品雜質(zhì)對儀器壽命的影響可以不計(jì)；另外，甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜為弱極性化合物，雜質(zhì)對其電噴霧離子化影響較小，加上多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描模式的高選擇性，不采取過固相萃取小柱或基質(zhì)分散固相萃取試劑盒的凈化手段，樣品基質(zhì)對分析物測定的干擾可忽略不計(jì)。本實(shí)驗(yàn)樣品前處理方法，操作簡單，回收率高，快速和經(jīng)濟(jì)，特別適合大批量樣品農(nóng)藥多殘留檢測，是農(nóng)業(yè)部蔬菜質(zhì)量安全農(nóng)藥殘留例行監(jiān)測和風(fēng)險(xiǎn)評估推薦的LC-MS/MS樣品前處理方法。

2.4方法的特異性

對于甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜，選擇信號值較高的兩組二級質(zhì)譜離子進(jìn)行定性定量分析，分析物都具有自己的特征二級離子，選擇性極高。輔之色譜的分離，基質(zhì)干擾已減至最低，可忽略不計(jì)。對照蔬菜基質(zhì)空白樣品和加標(biāo)樣品MRM圖，顯示沒有干擾組分影響測定。

2.5線性回歸方程、線性范圍、基質(zhì)影響及定量限

在儀器工作條件下，用按本實(shí)驗(yàn)方法制備的空白蔬菜基質(zhì)溶液和甲醇-水溶液（1+1）將甲硫威及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成0.001～0.1 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行測定，以被測組分的峰面積（y）對其質(zhì)量濃度（x，mg/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以3倍和10倍信噪比（S/N）計(jì)算方法檢出限和定量限。表2列出了甲醇-水溶液（1+1）配制的甲硫威及其代謝物峰面積對其質(zhì)量濃度響應(yīng)的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限。表3列出了3種蔬菜基質(zhì)溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程。結(jié)果表明，3種蔬菜基質(zhì)溶液和甲醇-水溶液（1+1）配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程沒有顯著差異，蔬菜基質(zhì)對分析物測定的干擾可忽略不計(jì)，可采用甲醇水（1+1）配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線對分析物進(jìn)行定量。從表2可知，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.995，甲硫威和甲硫威亞砜的線性范圍為0.001～0.1 mg/L，甲硫威砜的線性范圍為0.006～0.1 mg/L；方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.4～3.0 μg/kg和1.4～10.0 μg/kg。該方法檢測靈敏度符合GB 2763-2014 對蔬菜甲硫威殘留檢測方法的要求。

表2　甲硫威及其代謝物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表3　蔬菜基質(zhì)中甲硫威及其代謝物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)

2.6精密度與回收試驗(yàn)

在蔬菜空白樣品中添加甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜10，50，100 μg/kg 3個(gè)水平，按1.4處理樣品，在1.3儀器工作條件下測定，每個(gè)水平重復(fù)測定6次，進(jìn)行回收試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4　甲硫威及其代謝物在蔬菜中的添加回收率（n=6）

由表4可見，蔬菜中甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜3個(gè)水平添加回收率為71.0%～98.1%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.5%～9.9%，說明本方法準(zhǔn)確度和精密度均已達(dá)到GBT 27404-2008 《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的殘留分析要求。

2.7樣品分析

用本實(shí)驗(yàn)方法對某批次市場抽檢多種蔬菜樣品進(jìn)行分析，在一些蔬菜中檢出甲硫威亞砜，含量在5～30 μg/kg之間，其典型MRM色譜圖見圖2。

圖2　甲硫威亞砜MRM圖

甲硫威亞砜兩個(gè)特征離子對（242＞185和242＞122）均出現(xiàn)，且豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品一致，定性判斷是陽性，定量結(jié)果從MRM圖峰面積校正為8.2 μg/kg。

3　結(jié)語

以乙腈作為提取劑，經(jīng)鹽析、離心和過有機(jī)濾膜凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，成功地建立了抱子甘藍(lán)、結(jié)球萵苣和馬鈴薯3種蔬菜中甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜殘留的快速檢測方法。該方法簡單、快速，靈敏度高，確證性和實(shí)用性強(qiáng)，可作為抱子甘藍(lán)、結(jié)球萵苣和馬鈴薯中甲硫威、甲硫威亞砜和甲硫威砜殘留的確證定性和定量檢測，將來可嘗試推廣于更多種蔬菜中甲硫威殘留檢測。

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Determination of Methiocarb and Its Metabolites Residues in Vegetables by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Wu Cheng， Jin Weizheng， Zhao Zhiqiang， Wang Lei
（Shandong Station of Agro-environment Protection and Rural Energy， Jinan 250100， China）

A new method was established to determine methiocarb and its metabolites （methiocarb sulfoxide and methiocarb sulfone） residues in vegetables by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The sample was extracted with acetonitrile. Electrospray positive ion source（ESI+），multiple reaction monitoring mode （MRM） and external standard method were applied to samples analysis.The calibration curves showed good linearity in the range of 0.001-0.1 mg/L for methiocarb and methiocarb sulfoxide，0.006-0.1 mg/L for methiocarb sulfone with the correlation coefficient r＞0.995，the detection limits and quantification limits were 0.4-3.0 μg/kg and 1.4-10.0 μg/kg，respectively. The method validation was carried out at 10，50，100 μg/kg，the recoveries were from 71.0% to 98.1%，and the relative standard deviations of determination results were from 5.5% to 9.9%（n=6）. The method is simple，sensitive and suitable for monitoring the maximum residue limits（MRLs） of methiocarb，methiocarb sulfoxide and methiocarb sulfone.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry； methiocarb； methiocarb sulfoxide； methiocarb sulfone； vegetable

O657.7

A

1008-6145（2016）03-0049-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.03.013

聯(lián)系人：吳成；E-mail∶ wucheng7745@sina.com

2016-01-12