梁　潔，李　琳，單　楊，唐漢軍，3

(1中南大學(xué)隆平分院，長(zhǎng)沙　410125； 2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物淀粉化學(xué)與代謝組學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，長(zhǎng)沙　410125；3湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長(zhǎng)沙　410125)

?

葛根異黃酮對(duì)唾液淀粉酶及陰溝腸桿菌的抑制作用初探

梁潔1，2，李琳1，2，單楊1，3，唐漢軍1，2，3

(1中南大學(xué)隆平分院，長(zhǎng)沙410125；2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物淀粉化學(xué)與代謝組學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，長(zhǎng)沙410125；3湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長(zhǎng)沙410125)

目的：揭示葛根異黃酮降血糖與減肥作用的機(jī)理。方法：以乙醇回流提取法分離提取不同地域的野葛和粉葛葛根異黃酮類(lèi)；AOAC法和高效液相色譜法分析營(yíng)養(yǎng)成分；以唾液淀粉酶和陰溝腸桿菌構(gòu)建試驗(yàn)評(píng)價(jià)體系，用比色法測(cè)定葛根提取物(PREE)添加的抑制活性。結(jié)果：野葛與粉葛的基本營(yíng)養(yǎng)沒(méi)有顯著的差異，但異黃酮成分的含量和組成差異顯著；PREE對(duì)唾液淀粉酶的半抑制濃度(IC50)是0.31～1.14mg/mL、對(duì)陰溝腸桿菌的IC50為0.49～0.56mg/mL。隨著PREE濃度的增加，唾液淀粉酶活性減弱，陰溝腸桿菌的增殖速率降低。結(jié)論：葛根異黃酮對(duì)唾液淀粉酶活性和陰溝腸桿菌的增殖均具有抑制效果，直接影響糖代謝的初始階段而發(fā)揮降血糖、減肥作用。

葛根異黃酮；唾液淀粉酶；陰溝腸桿菌；抑制作用

唾液淀粉酶(Salivaamylase)是由唾液腺分泌的一種水解酶，是α-淀粉酶的一種，可以隨機(jī)地切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等。食物進(jìn)入胃后，唾液淀粉酶還可繼續(xù)作用，直至胃內(nèi)容物pH值變?yōu)?.8以下的酸性后反應(yīng)才終止。全吉淑等人[1]研究表明，大豆異黃酮類(lèi)物質(zhì)具有α-淀粉酶活性抑制作用，對(duì)改善非胰島素依賴型糖尿病癥狀、防止血糖升高有利。

陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)廣泛存在于大自然中，在人與動(dòng)物的糞便、土壤、各類(lèi)植物中均可檢出，是腸道常住菌種之一，但也可成為條件致病菌。陰溝腸桿菌已成為引起醫(yī)院肺部感染的重要病原菌之一[2]，也是較為常見(jiàn)的細(xì)菌，常引起肺部感染、敗血癥和尿路感染，也是造成肥胖的直接元兇之一[3]，近年來(lái)由于陰溝腸桿菌的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，使臨床感染治療面臨潛在威脅[4]。

葛根的主要功能成分是異黃酮類(lèi)化合物，主要有葛根素、3-羥基葛根素、3-甲氧基葛根素、葛根素-木糖苷、大豆苷元、大豆苷、芒柄花素、染料木苷、染料木素等[5]，已確認(rèn)有48種，其中葛根素是本屬植物的特有成分。已知植物中，葛植物的異黃酮種類(lèi)最多、含量高[6]。葛根異黃酮可以提高人畜的免疫力、治療缺血性中風(fēng)[7]、缺血性視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜黃斑病[8]，改善骨質(zhì)代謝[9,10]，具有顯著的抗抑郁作用[11]，治療叢集性頭痛，副作用輕微[12]，可降低血糖、血脂，治療心腦血管疾病，對(duì)治療肥胖有一定的作用[13]。

關(guān)于葛根異黃酮作用機(jī)理的研究報(bào)告還不多，本研究為揭示葛根異黃酮降血糖與減肥作用的機(jī)理，以湖南省不同地域栽培的粉葛和野葛的葛根提取物(PREE)為試驗(yàn)材料，構(gòu)建首先參與糖代謝的唾液淀粉酶及腸道常住菌種陰溝腸桿菌的in vitro評(píng)價(jià)體系，初步探討了PREE對(duì)唾液淀粉酶活性及陰溝腸桿菌的抑制作用。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

使用2012年12月在湖南省武陵源山區(qū)采集的1個(gè)野葛，以及在麻陽(yáng)縣、桑植縣、冷水江市3個(gè)地域采集的2年生栽培粉葛的葛根作為試驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)編號(hào)分別為Kudzu-A(野葛根)、Kudzu-B(麻陽(yáng)粉葛根)、Kudzu-C(桑植粉葛根)、Kudzu-D(冷水江粉葛根)。將采集的4種鮮葛根，充分洗凈后切成約2 mm厚薄片，在105℃條件下常壓烘干，粉碎至100目以上，貯存于干燥器中，作為分析樣品和功能成分的提取原料。

試驗(yàn)試劑：膳食纖維分析用酶制劑盒(日本和光制藥公司)；葛根素、大豆苷、大豆苷元等標(biāo)準(zhǔn)物(日本和光制藥公司)；陰溝腸桿菌種(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供)；人唾液淀粉酶(美國(guó)Sigma公司)；蛋白胨、牛肉浸取物(上海盛思生化科技有限公司)；色譜純級(jí)乙腈；無(wú)水乙醇；其他分析用試劑都是國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。高純度脫脂淀粉是本研究團(tuán)隊(duì)調(diào)制的樣品。

1.2主要儀器設(shè)備

GFL-70電熱烘箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；FD-ID-80冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司的；LP-10ATVP高效液相色譜儀,日本島津制作所；SP-756紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；QHZ-98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠潔凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1營(yíng)養(yǎng)成分分析以干燥粉末為分析樣品，采用AOAC法[14-17]測(cè)定。凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量；索氏提取法測(cè)定粗脂肪含量；Prosky-AOAC法測(cè)定膳食纖維含量；常壓電熱灰化法測(cè)定灰分含量；糖分含量由(1)式計(jì)算：

糖分(%)=100-(水分+粗蛋白質(zhì)+粗脂肪+膳食纖維+灰分)

(1)

1.3.2葛根提取物的制備取100g葛根干粉末，加70%乙醇500mL，在100℃加熱回溜裝置上，回溜提取1h后，用G4砂芯抽濾器過(guò)濾。收集殘?jiān)?0%乙醇500mL，在100℃加熱回溜裝置上，回溜提取30min后，用G4或G5砂芯抽濾器過(guò)濾。殘?jiān)僦貜?fù)1次回溜提取，集合3次的濾液，在真空濃縮機(jī)上濃縮至500mL左右。濃縮液用液氮凍結(jié)后，凍干處理，最終獲得20g左右的葛根提取物粉末(PREE)。

1.3.3異黃酮含量測(cè)定精確稱(chēng)取PREE粉末10mg，加70%乙醇5mL，沸水浴10min，充分溶解后，用70%乙醇定容至10mL。溶液用親水性過(guò)濾器(0.45μm目徑)過(guò)濾后，作為高效液相色譜分析樣品。分析條件[18]：層析柱為Cosmosil 5 C18-AR-II (4.6mm×250mm)，流動(dòng)相是10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)(A液)和35%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)(B液)。B液梯度為0～60min：0～80%；60～70min：80%；70～85min：80%～100%；85～90min：100%?？偭魉?mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。

1.3.4淀粉的酶解反應(yīng)條件試驗(yàn)(1)淀粉溶液調(diào)制：稱(chēng)取100mg脫脂淀粉置于帶蓋試管中，加入3mL水，沸水浴15min，冷卻至室溫，再加入5mL滅菌水混勻，加入NaoH溶液(1mol/L)1mL，混合均勻后靜置10min，再加入HCl(1mol/L)溶液1mL中和，混勻后45℃保存?zhèn)溆谩?2)唾液淀粉酶溶液配制：稱(chēng)取唾液淀粉酶粉劑于滅菌帶蓋試管中，在潔凈臺(tái)中加入0.05mmol/L滅菌磷酸鉀緩沖液(pH=6.0)完全溶解，配制成20U/mL的酶溶液，分裝到1.5mL的小離心管，密封好放到-40℃保存?zhèn)溆谩?3)酶的用量試驗(yàn)：預(yù)備滅菌帶蓋試管5支，各取上述淀粉溶液0.1mL，加0.05mmol/L滅菌磷酸鉀緩沖液(pH=6.0)0.4～0.33mL，再分別加上述唾液淀粉酶溶液0、10、30、50、70μL，在37℃震蕩水浴鍋中反應(yīng)30min，沸水浴5min停止反應(yīng)。加入95%的乙醇1.5mL，攪拌均勻，靜置30min后，離心分離(5℃，8 000×g，5min)。采用苯酚硫酸法測(cè)定上清液的總糖含量，判斷合適的酶用量。(4)反應(yīng)時(shí)間的試驗(yàn)：預(yù)備滅菌帶蓋試管6支，各取上述淀粉溶液0.1mL，加0.05mmol/L滅菌磷酸鉀緩沖液(pH=6.0)0.35mL，再加上述唾液淀粉酶溶液50μL，在37℃震蕩水浴鍋中分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60min，沸水浴5min停止反應(yīng)。加入95%的乙醇1.5mL，攪拌均勻，靜置30min后，離心分離(5℃，8 000×g，5min)。采用苯酚硫酸法測(cè)定上清液的總糖含量，判斷合適的反應(yīng)時(shí)間。

1.3.5唾液淀粉酶的活性抑制試驗(yàn)(1)葛根粗提物溶液的配制：取PREE粉末0.5g，加入70%乙醇溶液5mL，水浴加熱15min充分溶解，用70%乙醇定容至10mL。實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)一步用70%乙醇稀釋?zhuān)渲瞥?0、20、30、40、50 mg/mL的PREE梯度溶液，作為分析用試劑。(2)酶活性抑制試驗(yàn)：取上述淀粉溶液0.1mL，加0.05mol/L滅菌磷酸鉀緩沖液(pH=6.0) 0.3mL，混合均勻，按照表1分組加入試劑，在37℃震蕩水浴鍋中反應(yīng)30min，沸水浴5min停止反應(yīng)，加入95%乙醇1.5mL，攪拌均勻，靜置30min后，離心分離(5℃，8 000×g，5min)。采用苯酚硫酸法測(cè)定各組上清液的總糖含量。淀粉的酶解率(%)由(D-B)/C*100計(jì)算得出，并根據(jù)淀粉的酶解率與反應(yīng)液PREE濃度的線性回歸方程求出半抑制濃度(IC50)。

表1　實(shí)驗(yàn)組別

1.3.6陰溝腸桿菌的增殖培養(yǎng)試驗(yàn)按照中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供的操作步驟和培養(yǎng)條件將菌種培養(yǎng)恢復(fù)。取LB液體培養(yǎng)基20mL，加0.1mL菌懸液，在37℃條件下震蕩培養(yǎng)。在5、20、30h處，取0.5mL菌懸液測(cè)定660 nm的吸光度值。同時(shí)取0.1mL菌懸液，用生理鹽水稀釋104～108倍后，取稀釋菌懸液0.1mL涂布于LB固體平板培養(yǎng)基，在37℃條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)測(cè)菌落數(shù)。確認(rèn)菌落數(shù)與吸光度值的線性回歸關(guān)系。

1.3.7陰溝腸桿菌的增殖抑制試驗(yàn)按上述液體培養(yǎng)法預(yù)培養(yǎng)5h的菌液作為試驗(yàn)菌液。分4組取18mL液體培養(yǎng)基于50mL滅菌三角瓶中，按照表2分別加入試劑，在37℃條件下震蕩培養(yǎng)7h后，取0.5mL菌懸液測(cè)定660nm的吸光度值。菌的增殖率(%)=D/C*100，并根據(jù)增殖率(%)與培養(yǎng)基PREE濃度的線性回歸方程求出PREE的IC50。

表2　試驗(yàn)組別

1.3.8試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel(2007)處理數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與分析

2.1葛根的營(yíng)養(yǎng)成分

表3結(jié)果顯示，4個(gè)樣品的粗蛋白、粗脂肪、可溶性膳食纖維的含量都不高，品種間的差異較小?；曳趾?.4%～6.1%，Kudzu-D最高，整體上與甘薯、土豆等根菜類(lèi)的含量類(lèi)似[19，20]。Kudzu-A、B、C的不溶性膳食纖維含量12.4%～15.7%，品種間的差異不大，但Kudzu-D的膳食纖維含量達(dá)57.0%，遠(yuǎn)高于其他樣品，這或許是品種的特性，也可能是采樣地點(diǎn)的小環(huán)境條件造成的，需要求證。

表3　葛根的營(yíng)養(yǎng)成分

注：糖分(%)=100-(粗蛋白質(zhì)+粗脂肪+粗膳食纖維+灰分)

2.2葛根粗提物的主要異黃酮成分

由表4可知，野葛Kudzu-A的葛根素、大豆苷、大豆苷元含量均最高，特別是葛根素含量與大豆苷和大豆苷元之和相當(dāng)，與從前的分析結(jié)果類(lèi)似[21，22]。3個(gè)栽培品種的各種異黃酮含量表示了一定差異，有的甚至有顯著差異，但3種異黃酮的總和值(總異黃酮含量)差異不大，7.5%～8.6%，約是野葛Kudzu-A的1/2。

表4　葛根粗提物(PREE)的異黃酮含量　　單位：%

注：*總異黃酮(%)=葛根素(%)+大豆苷(%)+大豆苷元(%)

2.3唾液淀粉酶活性抑制作用

由圖1可知，30min之前水解速度直線上升，之后顯示了明確的拐點(diǎn)，40min后淀粉幾乎被完全分解，所以，在本反應(yīng)條件下，唾液淀粉酶活性抑制試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間定為30min以內(nèi)比較適宜。

圖1　淀粉水解與反應(yīng)時(shí)間的變化

圖2顯示，反應(yīng)液的PREE濃度與淀粉的分解率之間呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，4種PREE對(duì)唾液淀粉酶活性都具有顯著的抑制作用。野葛Kudzu-A在2mg/mL以下濃度時(shí)表現(xiàn)了最強(qiáng)的抑制效果，但濃度大于2mg/mL后，對(duì)唾液淀粉酶活性的抑制效果與3個(gè)栽培粉葛的表現(xiàn)相近，說(shuō)明高濃度下反映不出不同品種來(lái)源PREE的差異，因此，評(píng)價(jià)試驗(yàn)的PREE添加濃度在2mg/mL以下為宜。

圖2　PREE對(duì)唾液淀粉酶的抑制作用

根據(jù)其趨勢(shì)線方程計(jì)算出IC50，Kudzu-A 0.31 mg/mL最低、Kudzu-B 1.14 mg/mL最高，Kudzu-C 0.88mg/mL、Iudzu-D 0.96mg/mL。IC50與各種單一異黃酮之間呈現(xiàn)較低的相關(guān)性，甚至沒(méi)有，但與總異黃酮含量之間呈現(xiàn)了顯著的負(fù)相關(guān)性(圖3)。

圖3　總異黃酮量與IC50的關(guān)系

2.4陰溝腸桿菌增殖抑制作用

圖4顯示，陰溝腸桿菌的增殖開(kāi)始呈線性上升，20h后，增殖達(dá)到頂峰，而后出現(xiàn)死亡和減少的趨勢(shì)，因此在本培養(yǎng)條件下，陰溝腸桿菌增殖抑制試驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間定為20h以內(nèi)比較適宜。圖5結(jié)果顯示，陰溝腸桿菌的增殖數(shù)(菌落數(shù))與培養(yǎng)菌液吸光度值之間有顯著的線性回歸關(guān)系，說(shuō)明將菌液吸光度值作為陰溝腸桿菌的增殖指標(biāo)是可行的，可以縮短和簡(jiǎn)化增殖抑制評(píng)價(jià)試驗(yàn)工作。

圖4陰溝腸桿菌的培養(yǎng)試驗(yàn)

圖5菌落數(shù)與菌液吸光度值的線性關(guān)系

圖6　PREE對(duì)陰溝腸桿菌增殖的抑制作用

圖6可知，4種PREE都顯示了顯著的抑制效果。隨培養(yǎng)基PREE濃度的增高，陰溝腸桿菌增殖速度下降最快的是添加野葛Kudzu-A的試驗(yàn)，最慢的為Kudzu-B，Kudzu-C與D幾乎相同。根據(jù)其趨勢(shì)線方程計(jì)算出IC50，Kudzu-A為0.49 mg/mL、Kudzu-B 0.56 mg/mL、Kudzu-C 0.54 mg/mL、Kudzu-D 0.53 mg/mL。IC50與總異黃酮含量之間呈現(xiàn)了較高的負(fù)相關(guān)性(圖7)，與唾液淀粉酶活性抑制結(jié)果相似，因此可推斷葛根異黃酮抑制唾液淀粉酶活性與陰溝腸桿菌增殖需要各種異黃酮協(xié)同作用，預(yù)示著異黃酮組成也是重要因素。

圖7　IC50與總異黃酮含量的關(guān)系

3　結(jié)論

通過(guò)以上結(jié)果分析，可得出如下結(jié)論：

(1)野葛與粉葛的基本營(yíng)養(yǎng)成分沒(méi)有顯著的差異，但異黃酮成分的含量和組成差異顯著，反映了種間、地域間、生長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生的不同。(2)本研究構(gòu)建的人唾液淀粉酶活性試驗(yàn)方法和陰溝腸桿菌增殖培養(yǎng)試驗(yàn)作為探討葛根異黃酮作用機(jī)理的評(píng)價(jià)體系是可行的，具有操作方便、重復(fù)性高、效率較好、不需高端設(shè)備等特點(diǎn)，適合于一般實(shí)驗(yàn)條件推廣應(yīng)用。(3)在1mg/mL基質(zhì)濃度、2U/mL酶濃度下，酶解反應(yīng)時(shí)間不能超過(guò)30min，異黃酮添加濃度小于2mg/mL為宜。(4)葛根異黃酮對(duì)唾液淀粉酶活性和陰溝腸桿菌的增殖均具有抑制效果，且與組成物整體濃度之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，表明葛根異黃酮類(lèi)物質(zhì)在降血糖、預(yù)防肥胖上的功效作用首先是通過(guò)直接影響糖代謝的途徑實(shí)現(xiàn)的。(5)葛根異黃酮的種類(lèi)與組成也可能是重要因素。今后需要開(kāi)展高純度單一成分、成分配伍等詳細(xì)試驗(yàn)，異黃酮阻礙唾液淀粉酶的方式，以及陰溝腸桿菌的應(yīng)答模式等研究工作?！?/p>

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(責(zé)任編輯李婷婷)

Inhibition Effect of Isoflavones from Kudzu Root on Saliva amylase and Enterobacter cloacae

LIANG Jie1，2，LI Lin1，2，SHAN Yang1，3，TANG Han-jun1，2，3

(1Longping Branch Graduate School，Central South University，Changsha 410125，China；2Research Team of Crop Starch Chemistry and Metabonomics，Hunan Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410125，China；3Hunan Agricultural Product Processing Institute，Changsha 410125，China)

isoflavones from kudzu root；Salivaamylase；Enterobactercloacae；inhibition effect

湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物淀粉化學(xué)與代謝組學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2014TD06)。

梁潔(1991—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：作物淀粉化學(xué)與代謝組學(xué)。

唐漢軍(1964—)，男，博士,副研究員，研究方向：作物淀粉化學(xué)與代謝組學(xué)。