高 鵬，韓金志，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍，張 充，別小妹*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

廣譜抗菌乳酸菌的分離鑒定及細菌素的提取和純化

高 鵬，韓金志，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍，張 充，別小妹*
（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

本研究從黑龍江傳統(tǒng)自制酸菜中分離到1 株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的乳酸菌HLJ-174，其發(fā)酵產(chǎn)物排除有機酸、H2O2等干擾因素后對大腸桿菌、熒光假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌和藤黃微球菌等食品中常見的致病菌有廣譜抑菌活性。通過形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA序列分析鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），命名為Lactobacillus plantarum HLJ-174。研究了利用有機溶劑萃取的方法提取細菌素，發(fā)現(xiàn)正丁醇、乙酸乙酯萃取效果較好，正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、丙酮、乙醇等沒有效果。使用不同體積的正丁醇和乙酸乙酯（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 倍發(fā)酵液體積）萃取，發(fā)現(xiàn)1.5 倍發(fā)酵液體積的正丁醇效果最好。利用Sephadex LH-20對萃取產(chǎn)物進行了進一步分離，得到的活性物質(zhì)對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌等具有較強的抑菌活性。

乳酸菌；細菌素；菌株鑒定；萃取

細菌素是某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，對革蘭氏陽性細菌和一些親緣關(guān)系相近的乳酸菌有抑制作用[1]。乳酸菌是“公認安全”（generally recognized as safe，GRAS）的微生物，其產(chǎn)物允許應(yīng)用于食品中[2]。到目前為止乳酸菌細菌素沒有發(fā)現(xiàn)耐藥菌，能抑制病原微生物、腐敗性細菌的生長繁殖，在食品添加劑、飼料添加劑、醫(yī)藥等方面都有應(yīng)用前景。

根據(jù)Bactibase數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計顯示，目前發(fā)現(xiàn)且闡明一級結(jié)構(gòu)的細菌素已經(jīng)超過了170 種[3]，Nisin是被食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認可的唯一作為食品防腐劑的細菌素，在80多個國家和地區(qū)廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)[4-5]。在乳桿菌屬中，很多植物乳桿菌都可以產(chǎn)生細菌素，比如Lb. plantarum KLDS1.0391[6]、Lb. plantarum LB-B1[7]、Lb. plantarum LPCO10[8]和Lb. plantarum KLAB21[9]等。一般細菌素的抑菌譜窄，提取制備成本高，限制了其在食品工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用。篩選抑菌活性強和抑菌譜寬的細菌素產(chǎn)生菌是國內(nèi)外細菌素研究的主要內(nèi)容之一。

我國傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品種類多樣，各地都形成了獨特的發(fā)酵乳制品。為研究人員篩選抑菌譜廣、抑菌活性強的細菌素產(chǎn)生菌提供了很好的條件。例如，周佳等[10]從川西高原奶渣中分離出了腸球菌SAU-2，它產(chǎn)生的細菌素對熱很穩(wěn)定。張國強等[11]從泡菜中篩選出一株產(chǎn)細菌素的乳酸菌SD-22，其產(chǎn)物對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均具有較好的抑制作用，對部分真菌也有抑制作用，但對酵母菌和青霉無抑制作用。楊吉霞等[12]從來自西藏、云南等地的牦牛奶酪中篩選出具有廣譜抗菌性的Y13、X29和X30共3 株乳酸菌。本研究從黑龍江農(nóng)家自制酸菜中分離出一株抑菌譜較寬的產(chǎn)細菌素乳酸菌，鑒定為植物乳桿菌，并對其細菌素的提取純化做了初步的研究，旨在為天然防腐劑開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑龍江傳統(tǒng)酸菜制品，樣品取回后貯藏于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

MRS培養(yǎng)基、BCP培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基、精氨酸產(chǎn)氨培養(yǎng)基、葡萄糖/葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸產(chǎn)氣培養(yǎng)基、碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基、產(chǎn)硫化氫培養(yǎng)基。

革蘭氏染色試劑盒 杭州百思生物技術(shù)有限公司；細菌基因組提取試劑盒 美國Omega公司；Taq DNA聚合酶、Gel Extraction Kit 日本TaKaRa公司；過氧化氫酶 美國Sigma公司；細菌鑒定通用引物：16SF：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16SR：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TOMY-SX-700全自動高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Orion 3 STAR pH計 美國Thermo公司；Eclipse 80i光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；PTC-100TM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國MJ Research公司；PowPacTMHC164-5052高電流電泳儀美國Bio-Rad公司；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司。

1.1.4 指示菌

大腸桿菌（ATCC25922）、熒光假單胞菌（AS1.1802）、蠟樣芽孢桿菌（AS1.1846）、藤黃微球菌（CMCC（B）2800）、串珠鐮刀菌（30174） 中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

無菌鑷子夾取少量樣品（或無菌注射器抽取液體樣品）轉(zhuǎn)接于10 mL已滅菌的離心管，標(biāo)記編號，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 乳酸菌的分離

無菌環(huán)境下，取少許樣品置于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置富集培養(yǎng)8 h。增菌培養(yǎng)液用無菌生理鹽水按10 倍稀釋法稀釋，取10－3、10－4、10－53 個濃度梯度各100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，隨機挑取菌落，繼續(xù)在BCP固體培養(yǎng)基中劃線分離，重復(fù)幾次，最后得到黃色圈明顯、菌落形態(tài)單一的單菌落，挑取單菌落。

1.2.3 產(chǎn)廣譜抗菌作用細菌素乳酸菌的初篩

乳酸菌產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的初篩具體流程如下：分離出的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，測定得發(fā)酵液pH值為3.5，8 000 r/min離心15 min，取上清液。將指示菌（蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、藤黃微球菌）分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)10 h，按體積分?jǐn)?shù)1%接種于含1.8%瓊脂的LB培養(yǎng)基，制成帶指示菌的固體培養(yǎng)基。用5 mm的打孔器打孔，再分別加入50 μL的上清液，37 ℃培養(yǎng)8 h，測量抑菌圈直徑大小（大于5 mm為有抑菌活性）。

1.2.4 產(chǎn)廣譜抗菌細菌素乳酸菌的復(fù)篩

乳酸菌產(chǎn)生的活性抗菌物質(zhì)有有機酸、過氧化氫等物質(zhì)，故需要逐一排除。

1.2.4.1 抗菌能力的篩選

初篩得到的菌株活化后，按體積分?jǐn)?shù)1%接種新培養(yǎng)基，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，4 ℃條件下5 000×g離心15 min，得上清液，上清液采用瓊脂擴散法測試其抑菌活性[13-14]。

1.2.4.2 過氧化氫的排除

發(fā)酵離心得上清液，濃縮一倍備用。取濃縮上清液0.5 mL加入0.5 mL過氧化氫酶溶液（溶劑為pH值為5.2的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）），另取濃縮上清液0.5 mL加入0.5 mL pH 5.2的PBS溶劑為空白對照，37 ℃水浴處理2 h后采用瓊脂擴散法測試其抑菌活性，觀察加了過氧化氫酶的處理及對照抑菌圈變化[15]。

1.2.4.3 有機酸的排除

發(fā)酵離心得上清液，以用乳酸調(diào)節(jié)pH值為3.5（與發(fā)酵48 h后發(fā)酵液pH值相同）的MRS培養(yǎng)基作為空白對照，采用瓊脂擴散法測試其抑菌活性（鑒于細菌素的產(chǎn)量都非常低，故某些菌株的上清液有必要濃縮1 倍，提高細菌素的濃度，對照則同樣濃縮處理）[16]。

1.2.5 種屬鑒定

1.2.5.1 生理生化鑒定

菌株從以下七方面（菌落形態(tài)及菌體觀察、精氨酸產(chǎn)氨實驗、葡萄糖和葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗、運動能力、硫化氫能力檢測、碳水化合物發(fā)酵實驗、耐鹽性實驗）進行生理生化鑒定，實驗方法按照《伯杰細菌鑒定手冊》[17]及《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[18]。

1.2.5.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株基因組DNA提?。罕２氐木?74接種活化后于MRS培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)14 h，取5 mL菌液4 ℃、5 000×g離心10 min，得菌體，按照細菌基因組提取試劑盒操作說明提取細菌總DNA。

PCR擴增：PCR擴增引物選擇細菌鑒定通用引物，16SF和16SR。PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、2×PCR mixture 12.5 μL、ddH2O補足25 μL，設(shè)陰性對照。PCR反應(yīng)循環(huán)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳觀察，割膠回收，測序，測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的GenBank序列數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，在基因庫中進行同源性比較，鑒定到種。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：測序所得的16S rRNA序列校對后，與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，根據(jù)序列同源性，選取不同的模式菌株，采用MEGA 5.0的鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬關(guān)系。

1.2.6 細菌素初步分離純化

1.2.6.1 有機溶劑種類對萃取效果的影響

將發(fā)酵液以8 000 r/min離心15 min，取上清。發(fā)酵上清液以1∶3的體積比與乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷分別進行萃取，靜置過夜，吸出有機相，45 ℃旋蒸，對旋蒸的產(chǎn)物用甲醇復(fù)溶。以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，瓊脂擴散法檢測其抑菌活性[19]。

1.2.6.2 有機溶劑使用量對萃取效果的影響

以1.2.6.1節(jié)的結(jié)果選出萃取效果最好的2 種有機試劑，分別以不同的比例（有機溶劑的體積分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 倍的發(fā)酵液體積）與發(fā)酵液混合萃取，靜置過夜，吸出有機相，45 ℃旋蒸，對旋蒸的產(chǎn)物用甲醇復(fù)溶。以大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌和串珠鐮刀菌為指示菌，瓊脂擴散法檢測其抑菌活性[20]。

1.2.6.3 Sephadex LH-20純化

Sephadex LH-20充分溶脹后裝柱，80%甲醇平衡2 個柱體積后，有機溶劑萃取得到的樣品上樣1 mL，80%甲醇洗脫，流速3 mL/9 min，利用自動收集器收集餾分，每餾分接3 mL。餾分收集后，以大腸桿菌為指示菌，瓊脂擴散法檢測其抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)廣譜抗菌作用細菌素乳酸菌的分離及篩選

從黑龍江來源的發(fā)酵食品中共分離純化出菌株720 株，其中共篩選出對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌都有抑制效果的乳酸菌73 株。經(jīng)過復(fù)篩、排酸實驗、排除過氧化氫實驗確定31 株菌的抑菌效果較好，它們對指示菌的抑菌效果如表1所示。其中菌株174的抑菌效果最好，對4 株指示菌熒光假單胞菌、大腸桿菌、藤黃微球菌和蠟樣芽孢桿菌均具有廣譜抑菌效果，并發(fā)現(xiàn)菌株174產(chǎn)物能夠抑制真菌串珠鐮刀菌。菌株174抑菌效果最好，抑菌譜最廣，選定菌株174為研究菌株。

表1 乳酸菌發(fā)酵液對指示菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial activity of Lactobacilllluuss isoollaattee iinn fermentation brrootthh

2.2 目標(biāo)菌株鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

菌株174在MRS培養(yǎng)基上生長良好；菌落呈乳白色，圓形，表面光滑，凸起，培養(yǎng)液中生長物很混濁；革蘭氏染色為革蘭氏陽性菌；菌體無鞭毛，無芽孢產(chǎn)生，呈桿狀形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株174菌落形態(tài)（A）及革蘭氏染色圖（B）Fig. 1 Colony morphology (A) of strain 174 and its Gram staining (B)

菌株174不產(chǎn)過氧化氫酶；在含0、3 g/100 mL NaCl的培養(yǎng)基中生長，4.5、18 g/100 mL NaCl培養(yǎng)基中不能生長；不發(fā)酵精氨酸產(chǎn)氨；不產(chǎn)硫化氫；無運動性；能發(fā)酵葡萄糖但不能產(chǎn)氣，但是能夠在發(fā)酵葡萄糖酸鈉的同時產(chǎn)氣，當(dāng)發(fā)酵核糖時，能夠發(fā)酵核糖，但是不產(chǎn)氣，糖代謝實驗結(jié)果如表2所示。

表2 菌株174生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identifi cation of strain 174

2.2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

利用16S rRNA引物進行PCR擴增，得到約1 600 bp的PCR擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2。

圖2 16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of PCR-amplifi ed products of 16S rRNA

16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物回收，測序共得到1 590 個堿基，采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序比對菌株的16S rRNA序列和GenBank中的核酸數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)菌株與植物乳桿菌的相似性為99%。基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，由2.2.1節(jié)中的生理生化鑒定結(jié)果結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，鑒定該菌株為植物乳桿菌，命名為Lactobacillus plantarum HLJ-174。

圖3 菌株Lactobacillus plantaarruumm HLJ-174的系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Lactobacillus plantarum HLJ-174 based on 16S rRNA sequence

2.3 Lactobacillus plantarum HLJ-174細菌素提取方法研究

2.3.1 不同有機溶劑抽提細菌素效果比較

表3 不同有機溶劑萃取相抑菌效果Table 3 Antibacterial effects of extracts obtained with different organic solvents

首先采用有機溶劑萃取法，對發(fā)酵濃縮液進行萃取提純，結(jié)果見表3。在有機溶劑與發(fā)酵濃縮液體積比為3∶1的條件下，正丁醇和乙酸乙酯的萃取效果較好，均出現(xiàn)了明顯的分層現(xiàn)象，沒有沉淀出現(xiàn)，上層有機相旋蒸后得到粗提物，有明顯的抑菌作用，萃余相沒有抑菌活性。而正己烷、二氯化碳、三氯化碳、四氯化碳萃取后形成分層狀態(tài)，沒有沉淀出現(xiàn)，在萃取相中沒有檢測到抑菌活性，萃余相有抑菌活性。丙酮與乙醇萃取后不分層，也無沉淀產(chǎn)生。抑菌作用如圖4所示，a和b分別為正丁醇和乙酸乙酯萃取得到，萃取相有抑菌作用，萃余相無活性，抑菌圈直徑分別可以達到17.02、12.18 mm。c、d、e、f、g和h為正己烷、二氯化碳、三氯化碳、四氯化碳、丙酮和乙醇萃取后產(chǎn)物抑菌圖，萃取相沒有抑菌活性，而萃余相還保留有抑菌活性。由上述結(jié)果可以看出正丁醇和乙酸乙酯是適合的萃取劑，而正丁醇能最大限度得到細菌素產(chǎn)物，效果最好。

圖4 不同有機溶劑抽提細菌素產(chǎn)物抑菌效果Fig. 4 Antibacterial effects of bacteriocins extracted with different organic solvents

2.3.2 單一有機溶劑、不同有機溶劑用量抽提效果比較

由2.3.1節(jié)可以知道，正丁醇和乙酸乙酯是萃取效果較好的2 種有機溶劑，在此基礎(chǔ)上，分別利用不同體積的正丁醇和乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，旋蒸產(chǎn)物的抑菌效果結(jié)果如圖5所示，不論是使用正丁醇還是乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，在發(fā)酵液與有機溶劑的體積比達到1∶1.5之后，萃取的效果基本不變，所以確定1.5 倍有機溶劑體積為最佳的有機溶劑用量。同時，由圖5可知，正丁醇的萃取效果好于乙酸乙酯。綜合以上的實驗結(jié)果，當(dāng)使用1.5 倍正丁醇萃取發(fā)酵液時，萃取效果最好。

圖5 不同正丁醇和乙酸乙酯與發(fā)酵液比例萃取產(chǎn)物的抑菌效果Fig. 5 Antibacterial effects of extracts obtained with different ratios of butanol and acetate to the fermentation broth

2.4 Lactobacillus plantarum HLJ-174產(chǎn)細菌素的Sephadex LH-20凝膠過濾純化

以1.5 倍發(fā)酵液體積的正丁醇萃取得到的產(chǎn)物濃縮30 倍得到的活性樣品，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠過濾后，以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌檢測，得到一個活性洗脫峰，如圖6所示，第58～61管均檢測到抑菌活性。同時將洗脫下來的活性峰物質(zhì)進行抑菌檢測，發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、熒光假單胞菌和串珠鐮刀菌等都有抑菌活性。

圖 66 Lactobacillus plantarum HLJ-174產(chǎn)細菌素的Sephadex LH--2200洗脫曲線和抑菌活性Fig. 6 Elution curve of bacteriocin from Lactobacillus plantarum HLJ-174 on Sephadex LH-20 and detection of the active fractions

3 討 論

本研究從來自黑龍江的酸菜中篩選出一株具有較強抑菌活性的菌株，經(jīng)過菌株生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，確認該菌株為植物乳桿菌，命名為Lactobacillus plantarum HLJ-174。細菌素一般抑制與產(chǎn)生菌同種近源的菌株，絕大部分乳酸菌細菌素能夠抑制革蘭氏陽性菌等致病菌和腐敗菌。從目前已經(jīng)報道的植物乳桿菌細菌素來看，只有一部分的細菌素能夠同時抑制革蘭氏陽性與陰性菌株，對真菌也有抑菌效果的很少。比如張艾青[20]泡菜中篩出的植物乳桿菌產(chǎn)的細菌素對革蘭氏陽性和部分革蘭氏陰性菌有抑菌效果，未見對真菌有抑菌作用。劉書亮等[21]等從醪糟中篩選出的P185對多數(shù)的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌及一些真菌具有較強抑制作用。而本研究Lactobacillus plantarum HLJ-174的產(chǎn)物可以抑制大腸桿菌、熒光假單胞菌、藤黃微球菌、蠟樣芽孢桿菌等多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，同時還能夠抑制串珠鐮刀菌等真菌的生長，屬于廣譜的細菌素。

在植物乳桿菌細菌素產(chǎn)物分離純化中，一般采取硫酸銨沉淀、疏水層析、離子交換色譜、超濾法、凝膠色譜和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）。比如沈雷[22]通過硫酸銨沉淀、離子交換、凝膠過濾和反向高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）的方法分離得到Plantaricin ZJ217。陳琳等[23]利用超濾方法截留植物乳桿菌KLDS1.0391發(fā)酵液中的細菌素，獲得了很好的效果。在Lactobacillus plantarum HLJ-174產(chǎn)物的提取與純化中，首先使用了有機溶劑萃取[24]的方法。實驗以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，從多種有機溶劑中篩選出正丁醇和乙酸乙酯作為萃取劑對發(fā)酵液進行萃取獲得產(chǎn)物，同時找到了合適的萃取劑用量，在綜合考慮成本以及后續(xù)處理問題后，以1.5 倍發(fā)酵液體積為萃取有機溶劑用量。實驗結(jié)果表明正丁醇的效果好于乙酸乙酯。細菌素是一段短的肽鏈形成，是兩性分子，同時具有親水性和疏水性，正丁醇的疏水性強于乙酸乙酯，且正丁醇的極性比乙酸乙酯大，使用正丁醇的萃取效果好，說明此細菌素的極性較大，更易溶于強極性溶劑。萃取劑的疏水性也并非是決定細菌素在有機溶劑中溶解度的決定性因素，比如魯吉珂等[25]就發(fā)現(xiàn)利用有機溶劑提取Nisin時，溶劑疏水性差異可能不是決定Nisin分離提取的主要因素，而Nisin在有機相和水相的交界處富集濃縮存在溶劑特異性。所以，最后選定正丁醇作為最佳的萃取劑，以1.5 倍發(fā)酵液體積的正丁醇體積為最佳用量。在此基礎(chǔ)上測得抑制大腸桿菌抑菌圈直徑達到19 mm以上，抑制蠟樣芽孢桿菌抑菌圈直徑可以達到18 mm以上。萃取后產(chǎn)物濃縮30 倍，利用LH-20分離，得到一個活性峰，對大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌和串珠鐮刀菌等有強抑菌效果。

[1] 陳靜, 張玉蒼, 何連芳. 乳酸菌產(chǎn)細菌素的研究進展及其應(yīng)用前景[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(4): 1925-1927. DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2011.04.015.

[2] FRANKOS V H, SCHMITT D F, HAWS L C, et al. Generally recognized as safe (GRAS) evaluation of hexylresorcinol for use as a processing aid for prevention of melanosis in shrimp[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 1991, 14(2): 202-212. DOI:10.1016/0273-2300(91)90007-I.

[3] HAMMAMI R, ZOUHIR A, HAMIDA J B, et al. BACTIBASE: a new web-accessible database for bacteriocin characterization[J]. BMC Microbiology, 2007, 7(1): 89. DOI:10.1186/1471-2180-7-89.

[4] 袁靜, 李元端, 劉變芳, 等. 乳酸菌的細菌素及乳鏈菌肽在食品工業(yè)中的發(fā)酵與應(yīng)用[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2002, 18(5): 533; 544-549. DOI:10.3969/j.issn.1672-0946.2002.05.018.

[5] 李平蘭, 張篪, 江漢湖. 乳酸菌細菌素研究進展[J]. 微生物學(xué)通報, 1998, 25(5): 295-298. DOI:10.13344/j.microbiol.china.1998.05.015.

[6] GONG H S, MENG Xiecheng, WANG Han. Plantaricin MG active against Gram-negative bacteria produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 isolated from “Jiaoke”, a traditional fermented cream from China[J]. Food Control, 2010, 21(1): 89-96. DOI:10.1016/ j.foodcont.2009.04.005.

[7] XIE Ying, AN Haoran, HAO Yanling, et al. Characterization of an anti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LB-B1 isolated from koumiss, a traditionally fermented dairy product from China[J]. Food Control, 2011, 22(7): 1027-1031. DOI:10.1016/ j.foodcont.2010.12.007.

[8] JIMéNEZ-DíAZ R, RIOS-SANCHEZ R, DESMAZEAUD M, et al. Plantaricins S and T, two new bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum LPCO10 isolated from a green olive fermentation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(5): 1416-1424. DOI:10.1128/aem.00034-0170.

[9] PARK H D, RHEE C H. Antimutagenic activity of Lactobacillus plantarum KLAB21 isolated from kimchi Korean fermented vegetables[J]. Biotechnology Letters, 2001, 23(19): 1583-1589. DOI:10.1023/A:1011921427581.

[10] 周佳, 劉書亮，胡欣潔, 等. 產(chǎn)寬譜pH細菌素乳酸菌的篩選鑒定、毒力檢測及細菌素特性研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(11): 194-199.

[11] 張國強, 樊明濤, 師俊玲, 等. 一株從泡菜中分離的產(chǎn)細菌素乳桿菌的鑒定及細菌素特性研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(3): 171-175.

[12] 楊吉霞, 賀稚非, 陳宗道. 牦牛奶酪中產(chǎn)細菌素乳酸菌菌株的篩選[J].食品科學(xué), 2015, 36(3): 122-126. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201503023.

[13] LUO Fan, FENG Su, SUN Qun, et al. Screening for bacteriocinproducing lactic acid bacteria from kurut, a traditional naturallyfermented yak milk from Qinghai-Tibet plateau[J]. Food Control, 2011, 22(1): 50-53. DOI:10.1016/j.foodcont.2010.05.006.

[14] SCHILLINGER U, LüCKE F K. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55(8): 1901-1906.

[15] 張國強, 師俊玲, 楊自文. 1株乳酸菌所產(chǎn)類細菌素Lactobacillin SD-22的初步研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(5): 51-54. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2008.05.002.

[16] 袁瑋. 貴州省苗族腌酸湯中產(chǎn)乳酸菌素菌的篩選與初步研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[17] 布坎南R E, 吉本斯N E. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組, 譯. 北京: 科學(xué)出版社, 1984: 729-795.

[18] 凌代文. 乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999: 110-128.

[19] 許亦峰, 羅曉蕾, 施碧紅. 不同提取劑對粗細菌素提取效果的影響[J]. 微生物學(xué)雜志, 2013, 33(1): 35-38. DOI:10.3969/ j.issn.1005-7021.2013.01.008.

[20] 張艾青. 產(chǎn)廣譜細菌素植物乳桿菌的初步研究及其在在泡菜中的應(yīng)用[D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[21] 劉書亮, 張艾青, 田剛, 等. 植物乳桿菌P158的生長曲線及其細菌素的特性[J]. 核農(nóng)學(xué)報, 2009, 23(6): 1021-1025.

[22] 沈雷. 植物乳桿菌ZJ217產(chǎn)細菌素的研究[D]. 杭州: 浙江工商大學(xué), 2013.

[23] 陳琳, 孟祥晨. 超濾法分離植物乳桿菌KLDS1.0391發(fā)酵液中的細菌素[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(5): 198-201.

[24] 謝繼輝, 陳曉琳, 張明. 有關(guān)細菌素分離純化方法的評價[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報, 2008, 14(15): 60-61. DOI:10.3969/ j.issn.1007-7731.2008.15.026.

[25] 魯吉珂, 黎業(yè)娟, 吳霄玥, 等. 有機溶劑沉淀法提取乳酸鏈球菌素的效果[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(10): 84-86.

Isolation and Identifi cation of Lactic Acid Bacterial Strain with Broad-Spectrum Antibacterial Activity and Extraction and Purifi cation of Bacteriocin Produced by It

GAO Peng, HAN Jinzhi, LU Zhaoxin, Lü Fengxia, ZHAO Haizhen, ZHANG Chong, BIE Xiaomei*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

A lactic acid bacterial strain, Lactobacillus HLJ-174, was isolated from naturally fermented Chinese sauerkraut from Heilongjiang province. The bacteriocin produced by it showed a strong antibacterial activity against Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus and Micrococcus aureus after elimination of some interference factors such as organic acid and hydrogen peroxide. Based on morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis, the strain HLJ-174 was identifi ed as Lactobacillus plantarum. The bacteriocin from HLJ-174 was extracted with organic solvent, and higher extraction effi ciency was obtained using butanol and ethyl acetate, but it was not extractable with other organic solvents such as hexane, methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, acetone and ethanol. Furthermore, the addition of different volumes (0.5-, 1.0-, 1.5-, 2.0-, 2.5- and 3.0-fold) of butanol or ethyl acetate to the fermentation broth was applied to extract the bacteriocin, and the results showed that the best extraction efficiency was achieved by using 1.5-fold volume of butanol as the extraction solvent. The extract was further purifi ed by Sephadex LH-20 chromatography, and the purifi ed product exhibited a strong antibacterial activity against Escherichia coli and Bacillus cereus.

Lactobacillus; bacteriocin; strain identifi cation; extraction

10.7506/spkx1002-6630-201611028

TS252.54

A

1002-6630（2016）11-0160-07

高鵬, 韓金志, 陸兆新, 等. 廣譜抗菌乳酸菌的分離鑒定及細菌素的提取和純化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 160-166.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611028. http://www.spkx.net.cn

GAO Peng, HAN Jinzhi, LU Zhaoxin, et al. Isolation and identifi cation of lactic acid bacterial strain with broad-spectrum antibacterial activity and extraction and purifi cation of bacteriocin produced by it[J]. Food Science, 2016, 37(11): 160-166. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611028. http://www.spkx.net.cn

2015-08-06

高鵬（1991—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：2014808088@njau.edu.cn

*通信作者：別小妹（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物及生物技術(shù)。E-mail：bxm43@njau.edu.cn