唐存多，史紅玲，蔚曉華，張 梅，唐青海，岳 超，姚倫廣，夏 敏，闞云超,*（.南陽(yáng)師范學(xué)院 昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 4706；.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽(yáng) 4706；.蓬萊市市場(chǎng)監(jiān)督管理局，山東 蓬萊 65600）

新型GH5家族β-甘露聚糖酶的基因挖掘及表達(dá)鑒定

唐存多1，史紅玲1，蔚曉華2，張 梅3，唐青海1，岳 超1，姚倫廣1，夏 敏2，闞云超1,*
（1.南陽(yáng)師范學(xué)院 昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473061；2.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061；3.蓬萊市市場(chǎng)監(jiān)督管理局，山東 蓬萊 265600）

為了獲得性能優(yōu)良的新型β-甘露聚糖酶，本研究采用基因挖掘技術(shù)從米曲霉（Aspergillus oryzae）RIB40基因組中挖掘到了2 個(gè)假定的新型 GH5家族β-甘露聚糖酶基因，分別命名為Aoman5A和Aoman5B。對(duì)這兩條序列做了相關(guān)的生物信息學(xué)分析，同時(shí)借助pPIC9KM質(zhì)粒將兩個(gè)酶的成熟肽編碼基因在Pichia pastoris GS115中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化和鑒定。生物信息學(xué)分析的結(jié)果表明AoMan5A含有20 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，而AoMan5B含有21 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和12 個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)肽；序列比對(duì)的結(jié)果顯示兩個(gè)酶與目前已報(bào)道的序列最高的同源性分別為68%和79%，且AoMan5A的N端還攜帶有一個(gè)1家族的CBM；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，兩者均符合（α/β）8的TIM-桶狀結(jié)構(gòu)。表達(dá)鑒定的結(jié)果表明，在同樣表達(dá)條件下，reAoMan5A和reAoMan5B上清液的酶活力分別為2.9、12.5 IU/mL；純化后它們的酶比活力分別為8.3、104.2 IU/mg，前者的最適溫度為35 ℃，而后者的最適溫度為50 ℃，pH值特性的測(cè)定結(jié)果表明這兩種酶均為酸性酶。硫酸-苯酚法測(cè)得reAoMan5A和reAoMan5B的糖含量分別為 25.4%和12.6%，表明這兩種重組酶均經(jīng)過了糖基化修飾。本研究獲得了兩種新型的β-甘露聚糖酶，比較分析了它們的序列特征，并實(shí)現(xiàn)了它們的異源表達(dá)，為β-甘露聚糖酶的進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為其他新型酶的基因挖掘提供了可資借鑒的經(jīng)驗(yàn)。

β-甘露聚糖酶；基因挖掘；生物信息學(xué)分析；米曲霉；蛋白表達(dá)

β-甘露聚糖酶是一類能夠水解甘露聚糖的酶的總稱，近年來研究較多的主要是β-1,4-內(nèi)切甘露聚糖酶[1-2]。基于序列同源性及疏水簇分析，β-甘露聚糖酶可以被歸為糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH）第5、26和113家族，而報(bào)道最多、研究最廣的主要是GH5家族的β-甘露聚糖酶[3-4]。β-1,4-內(nèi)切甘露聚糖酶在β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶的協(xié)同作用下，可以高效地水解魔芋粉制備低聚甘露糖。迄今為止，盡管已有許多關(guān)于生物催化法制備低聚甘露糖的研究，但它的生產(chǎn)成本仍然居高不下。這主要?dú)w因于生產(chǎn)所需關(guān)鍵酶的催化活性較低、生產(chǎn)和使用成本較高以及在高溫環(huán)境下的穩(wěn)定性較差等[5]。如何獲得催化活性高、熱穩(wěn)定性好的優(yōu)良β-甘露聚糖酶，已成為企業(yè)和科研人員當(dāng)前所面臨的巨大挑戰(zhàn)，也是降低生物催化法制備低聚甘露糖的生產(chǎn)成本所必須突破的瓶頸[6]。自然界中蘊(yùn)藏著豐富的未被發(fā)掘的新型酶資源，如何去發(fā)掘這些未知的酶類并加以適當(dāng)?shù)母脑煲詽M足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，已漸漸吸引了廣大科研工作者的關(guān)注[7]。

迄今已有2 000多個(gè)微生物基因組信息被公開報(bào)道，而且這些數(shù)據(jù)仍在呈指數(shù)增長(zhǎng)[8]，這些日益豐富的基因組信息為新酶的發(fā)掘提供了豐富的資源[9]?！盎蛲诰颍╣enome mining）”這一術(shù)語(yǔ)已被用于多種領(lǐng)域，主要是指開發(fā)基因組信息以發(fā)現(xiàn)一些新的過程、靶點(diǎn)和產(chǎn)物[10-11]?；蛲诰蚣夹g(shù)可以實(shí)現(xiàn)從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)到真實(shí)酶數(shù)據(jù)庫(kù)的跨越，進(jìn)一步豐富了可被利用或改造的酶資源[7,12]。近年來，已有許多利用基因挖掘技術(shù)發(fā)現(xiàn)新酶的報(bào)道。Zhu Dunming等[13]借助基因挖掘技術(shù)，先搜索到98 個(gè)預(yù)測(cè)的腈水解酶序列，然后結(jié)合保守序列比對(duì)和氨基酸長(zhǎng)度控制等理性的設(shè)計(jì)，最后成功獲得了來源于慢生大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）USDA110的扁桃腈水解酶。Barriuso等[14]利用保守模塊搜索、進(jìn)化樹構(gòu)建及序列同源比對(duì)生物信息學(xué)分析的手段，從聯(lián)合基因組研究所（Joint Genome Institute，JGI）公布的128 個(gè)真菌基因組中尋找到了6 個(gè)具有固醇酯酶或脂肪酶活性的假定蛋白。本研究試圖借助基因挖掘技術(shù)從已報(bào)道的基因組信息中挖掘新型、假定的GH5家族β-甘露聚糖酶基因，并對(duì)獲得的序列進(jìn)行相應(yīng)的生物信息學(xué)分析及表達(dá)鑒定，為后續(xù)的理性改造、高效表達(dá)及其應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

A. oryzae RIB40菌株購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；E. coli JM109菌株昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室保藏；pMD19-T載體購(gòu)自大連寶生物有限公司；pPIC9KM質(zhì)粒和Pichia pastoris GS115菌株由江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院鄔敏辰教授饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；DNase I和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 美國(guó)賽默飛公司；Multi-Copy Pichia Expression Kit Invitrogen公司；Premix Ex Taq Hot Start Version、GXL高保真DNA聚合酶和DNA連接試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR I和Sal I New England Biolabs公司；角豆膠 美國(guó)Sigma公司；質(zhì)粒小量提取和PCR產(chǎn)物純化試劑盒 美國(guó)Axygen公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 常用培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：魔芋粉5 g/L、玉米粉10 g/L、豆餅粉30 g/L、硫酸銨5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、氯化鈣1 g/L、硫酸鎂1 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：由于需要收集菌體提RNA，所以培養(yǎng)基里面盡量不能出現(xiàn)固形物，先將4 g麩皮和6 g豆餅粉加200 mL水煮30 min，紗布過濾后將汁液定容至200 mL；5 g/L魔芋粉、體積分?jǐn)?shù)50%麩皮汁、5 g/L硫酸銨、3 g/L磷酸二氫鉀、1 g/L氯化鈣、1 g/L硫酸鎂，自然pH值（加水時(shí)預(yù)留出10%的接種量），121 ℃滅菌20 min。LB、YPD、MD、BMGY和BMMY培養(yǎng)基的配制參見Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊(cè)。

1.1.4 常用網(wǎng)站及軟件

DNAMAN 6.0：簡(jiǎn)單的序列比對(duì)及分析；BioEdit：測(cè)序彩圖的分析；Oligo 7：引物設(shè)計(jì)；Geneious 4.7.5：基因或蛋白質(zhì)序列的存儲(chǔ)與管理；Modeller 9.9：蛋白質(zhì)3-D結(jié)構(gòu)的模擬；PyMOL和Discovery Studio 3.0 Client：蛋白質(zhì)3-D結(jié)構(gòu)的閱讀與分析；CBS Prediction Servers（http://www.cbs.dtu.dk/ services/）：信號(hào)肽、前導(dǎo)肽及糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)；美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）（http://www. ncbi.nlm. nih.gov/）和CAZy（http://www.cazy.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)：蛋白質(zhì)、基因序列及蛋白質(zhì)3-D結(jié)構(gòu)的搜索。

1.2 方法

1.2.1 新型β-甘露聚糖酶的基因挖掘

以研究比較透徹、催化活性較高的GH5家族β-甘露聚糖酶AoMan5A的蛋白序列為查詢序列進(jìn)行BLAST分析，從查詢的結(jié)果中找出一系列基因組信息來源的且未經(jīng)表達(dá)鑒定、假定的GH5家族β-甘露聚糖酶基因。對(duì)這些序列進(jìn)行開放讀碼框的預(yù)測(cè)，并進(jìn)行序列比對(duì)分析，以期在某一微生物基因組中找出2 個(gè)目的β-甘露聚糖酶序列，其中一個(gè)含有碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（carbohydratebinding module，CBM），另一個(gè)不含CBM。本研究最終選定了2 個(gè)A. oryzae RIB40基因組中未經(jīng)表達(dá)鑒定的GH5家族的β-甘露聚糖酶為研究對(duì)象，2 個(gè)基因分別命名為Aoman5A和Aoman5B，對(duì)應(yīng)的酶命名為AoMan5A和AoMan5B。

1.2.2 新型β-甘露聚糖酶的基因克隆

基于上述基因挖掘的結(jié)果，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，引物序列如表1所示。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取A. oryzae RIB40的總RNA，總RNA經(jīng)DNase I酶處理后用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，然后分別用上述的特異性引物進(jìn)行目的基因的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增。擴(kuò)增的目的片段經(jīng)電泳純化回收后，連接到pMD19-T載體上，并轉(zhuǎn)化到宿主菌JM109。經(jīng)藍(lán)白斑篩選及菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證后，陽(yáng)性克隆子送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序?？寺〖皽y(cè)序的步驟均采用高保真的DNA聚合酶做了3 次平行實(shí)驗(yàn)。

表1 新型GHH55 β-甘露聚糖酶基因克隆及表達(dá)所需的引物Table 1 Sequences of the primers used for cloning and expression of novel GGHH55 β-mannannaasseess

1.2.3 新型β-甘露聚糖酶序列的生物信息學(xué)分析

將上述獲得基因序列先利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行翻譯，獲得氨基酸序列。然后參照Tang Cunduo等[15]的方法分別對(duì)獲得的序列進(jìn)行理論的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、糖基化位點(diǎn)及三維結(jié)構(gòu)等的預(yù)測(cè)和分析，為后續(xù)的異源表達(dá)及酶學(xué)特性分析奠定理論基礎(chǔ)。

1.2.4 β-甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)

基于上述信號(hào)肽和成熟肽預(yù)測(cè)的結(jié)果，分別設(shè)計(jì)表達(dá)AoMan5A和AoMan5B成熟肽的引物，引物序列如表1所示，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。重組畢赤酵母的構(gòu)建、篩選、表達(dá)及產(chǎn)物的純化參見唐存多等[16]所發(fā)表的文獻(xiàn)，重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化用Sal I進(jìn)行。

1.2.5 β-甘露聚糖酶酶活性及蛋白分析

采用改進(jìn)的二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定樣品β-甘露聚糖酶活性[2]。2.4 mL 0.5 g/100 mL角豆膠溶液（pH 3.6）加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，40 ℃條件下反應(yīng)10 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴中顯色7 min，測(cè)定OD540nm值。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖（以甘露糖計(jì)）所需的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（IU）。采用Bradford法[17]測(cè)定蛋白的濃度，以牛血清白蛋白為參照標(biāo)準(zhǔn)。用12.5%的分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[18]，并用Quantity One軟件計(jì)算目的蛋白的表觀分子質(zhì)量。采用硫酸-苯酚法測(cè)定純化后重組酶的糖含量。

1.2.6 溫度對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響

分別在30～55 ℃條件下，按1.2.5節(jié)中的方法測(cè)定酶活性，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，Topt表示酶的最適溫度。將酶分別在25～55 ℃條件下保溫1 h后，再在各自的Topt條件下測(cè)定其酶活力，以未處理的酶活力為100%計(jì)算殘留酶活力。

1.2.7 pH值對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響

分別在pH值為2.5～7.0的條件下，按1.2.5節(jié)中的方法在各自的Topt條件下測(cè)定其酶活力，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。將酶分別與pH 2.5～7.0的緩沖液按體積比1∶1混合，在4 ℃條件下保溫1 h后，再在各自的Topt條件下測(cè)定其酶活力，以未處理的酶活力為100%計(jì)算殘留酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-甘露聚糖酶的基因克隆

圖1 1 β-甘露聚糖酶基因的RT-PCR擴(kuò)增PCRFig. 1 RT-PCR amplifi cation of β-mannanase genes

根據(jù)1.2.2節(jié)中的方法，分別以AoMan5A-F和AoMan5A-R為引物RT-PCR擴(kuò)增出編碼AoMan5A的cDNA片段，以AoMan5B-F和AoMan5B-R為引物RT-PCR擴(kuò)增出編碼AoMan5B的cDNA片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果如圖1所示。泳道1為AoMan5A產(chǎn)物的電泳圖譜，在1 400 bp左右的位置出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，與預(yù)期的大小一致；而泳道2為AoMan5B產(chǎn)物的電泳圖譜，在1 200 bp左右的位置出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，同樣也與預(yù)期的大小一致。由于PCR產(chǎn)物均較純，為了保證回收產(chǎn)物的濃度，因此直接進(jìn)行了PCR產(chǎn)物純化回收?；厥盏漠a(chǎn)物連接至pMD19-T載體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)出的序列與基因組中推測(cè)的編碼序列基本一致，其中Aoman5A的CDS序列為1 392 個(gè)堿基，編碼463 個(gè)氨基酸殘基，與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列完全一致；而Aoman5B的CDS序列為1 137 個(gè)堿基，編碼378 個(gè)氨基酸殘基，與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的序列存在2 個(gè)堿基的差異，并呈現(xiàn)出1 個(gè)氨基酸的差異。

2.2 β-甘露聚糖酶序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 信號(hào)肽及糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及分析

利用SignalP 4.1服務(wù)器[19]對(duì)推測(cè)出的AoMan5A氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示AoMan5A含有一段20 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。利用ProP 1.0 Server預(yù)測(cè)AoMan5A的前導(dǎo)肽序列，結(jié)果顯示AoMan5A中無前導(dǎo)肽序列。利用NetNGlyc 1.0 Server對(duì)AoMan5A進(jìn)行潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明AoMan5A中存在1 個(gè)潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)Asn87-Lys88-Ser89。利用NetOGlyc 4.0 Server對(duì)AoMan5A進(jìn)行潛在的O-連接的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明AoMan5A中存在26 個(gè)潛在的O-連接的糖基化位點(diǎn)。采用同樣的方法對(duì)AoMan5B的序列也進(jìn)行信號(hào)肽、前導(dǎo)肽及糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析。信號(hào)肽預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示AoMan5B中有一段21 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。此外，前導(dǎo)肽預(yù)測(cè)的結(jié)果也表明在AoMan5B中還存在一段12 個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)肽。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，AoMan5B中存在1 個(gè)潛在的N連接的糖基化位點(diǎn)Asn328-Thr329-Thr330和1 個(gè)潛在的O-連接的糖基化位點(diǎn)。

2.2.2 序列的同源比對(duì)及分析

利用DNAMAN 6.0軟件分別將Aoman5A和Aoman5B的堿基序列翻譯成了氨基酸序列，并分別命名為AoMan5A和AoMan5B。將AoMan5A的成熟肽序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)與其同源性較高的為1 株Aspergillus fumigatus Af293來源的GH5家族β-甘露聚糖酶序列，其同源性為68%；而與AoMan5B的同源性最高的為Aspergillus terreus NIH2624來源的GH5家族β-甘露聚糖酶序列，其同源性為79%。將這2 個(gè)序列與本研究得比較透徹的AoMan5A的序列一起進(jìn)行多序列比對(duì)，可以找出它們7 個(gè)最為保守的氨基酸殘基，分別為R53、N167、E168、H241、Y243、E275和D312，其中E168和E275為2 個(gè)假定的Glu催化殘基。此外，在AoMan5A的N端存在1 個(gè)明顯的CBM和連接肽。對(duì)CBM作進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)它與CBM1家族的序列同源性較高，與Lu Haiqiang等[20]報(bào)道的結(jié)果一致。

2.2.3 理論理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)及分析

利用Protparam服務(wù)器分別對(duì)AoMan5A和AoMan5B成熟肽的理化性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示它們的理論分子質(zhì)量分別為48 078.2 D和38 030.8 D，理論等電點(diǎn)pI值分別為5.05和4.64，分子式分別為C2135H3203N559O679S16和C1711H2507N437O536S8；蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)分別為25和14.96，均是較穩(wěn)定的蛋白；另外，它們的脂溶性指數(shù)分別為61.26和68.43，總的平均疏水指數(shù)分別為－0.454和－0.354，均為親水蛋白。

2.2.4 高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及分析

利用Predict Protein服務(wù)器分別預(yù)測(cè)了AoMan5A和AoMan5B成熟肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示兩者均由8 個(gè)α-螺旋、8 個(gè)β-折疊片和一些無規(guī)卷曲組成。以PDB號(hào)為3WH9、1QNO和3WFL的3 個(gè)3-D結(jié)構(gòu)為模板，利用Modeller 9.9軟件[21]分別對(duì)AoMan5A和AoMan5B進(jìn)行多模板的同源建模，并將獲得的2個(gè)3-D結(jié)構(gòu)用Pymol軟件進(jìn)行比較分析，結(jié)果如圖2所示。AoMan5A和AoMan5B的氨基酸序列盡管相差較大，但除去AoMan5A中的CBM序列以后，兩者的3-D結(jié)構(gòu)非常相似，均為典型的（α/β）8-TIM桶狀結(jié)構(gòu)，兩者推測(cè)的催化殘基在空間的位置也能重疊。此外，3-D結(jié)構(gòu)的表面模型顯示，2個(gè)推測(cè)的催化殘基恰好位于凹槽的內(nèi)側(cè)，符合典型的內(nèi)切酶的特征[22]。這些特征也進(jìn)一步證明了獲得的2個(gè)新型β-甘露聚糖酶為GH5家族和GH clan-A超家族的成員[23]。

圖2 AoMan5A與AoMan5B三維結(jié)構(gòu)的比對(duì)Fig. 2 Alignment of 3-D structure between AoMan5A and AoMan5B

2.3 β-甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)

按照1.2.4節(jié)中的方法將AoMan5A和AoMan5B成熟肽的編碼基因整合入了P. pastoris GS115的基因組中，構(gòu)建出了含有目的基因的重組畢赤酵母GS115/Aoman5A和GS115/Aoman5B。利用5’-AOX和3’-AOX通用引物對(duì)GS115、GS115/Aoman5A和GS115/Aoman5B進(jìn)行菌落PCR鑒定的結(jié)果如圖3所示。泳道2和3為GS115/ Aoman5A菌落PCR產(chǎn)物的圖譜，除了有2 100 bp左右醇氧化酶基因片段外，分別還有一條1 700 bp左右的條帶；而泳道4和5為GS115/Aoman5B菌落PCR產(chǎn)物的圖譜，除了有2 100 bp左右醇氧化酶基因片段外，分別還有一條1 600 bp左右的條帶；這也表明目的基因均已成功整合入酵母基因組中。

圖3 畢赤酵母的菌落PCR鑒定Fig. 3 PCR identifi cation of individual bacterial colonies from Pichia pastoris

重組酵母GS115/Aoman5A和GS115/Aoman5B經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1%甲醇誘導(dǎo)96 h，離心后測(cè)發(fā)酵上清液的酶活力，篩選出重組β-甘露聚糖酶reAoMan5A和reAoMan5B表達(dá)水平最高的重組子，篩選重組β-甘露聚糖酶reAoMan5A和reAoMan5B表達(dá)水平最高的克隆，其酶活力分別達(dá)到2.9 IU/mL和12.5 IU/mL。表達(dá)上清液經(jīng)(NH4)2SO4沉淀、超濾除鹽、濃縮及Sephadex G-75凝膠過濾，獲得電泳純的reAoMan5A和reAoMan5B，如圖4所示。利用光密度掃描法估算得出純化后重組酶的純度大于95%，其表觀分子質(zhì)量分別約為68 kD和41 kD，明顯大于它們的理論分子質(zhì)量。reAoMan5A和reAoMan5B糖含量測(cè)定的結(jié)果分別為25.4%和12.6%，結(jié)合糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果，進(jìn)一步說明這2 種重組酶均經(jīng)過了糖基化修飾，可以初步確定表觀分子質(zhì)量的偏大是由糖基化所致。在pH 3.6和40 ℃時(shí)測(cè)得reAoMan5A和reAoMan5B的酶比活力分別為8.3 IU/mg和104.2 IU/mg，在此條件下后者的酶比活力明顯高于前者。

2.4 溫度對(duì)重組酶活力的影響

reAoMan5A和reAoMan5B最適溫度（Topt）的測(cè)定結(jié)果如圖5A所示，前者的最適溫度為35 ℃，后者為50 ℃；它們熱穩(wěn)定性的結(jié)果如圖5B所示，reAoMan5A的熱穩(wěn)定性較差，40 ℃保溫1 h后殘留酶活力僅為10.6%；而reAoMan5B在45 ℃保溫1 h后殘留酶活力仍能維持在85%以上。

圖5 reAoMan5A和reAoMan5B的溫度特性分析Fig. 5 Temperature characteristic analysis of the expressed reAoMan5A and reAoMan5B

2.5 pH值對(duì)重組酶活力的影響

圖6 reAoMan5A和reAoMan5B的pH值特性分析Fig. 6 pH characteristic analysis of the expressed reAoMan5A and reAoMan5B

reAoMan5A和reAoMan5B最適pH值的測(cè)定結(jié)果如圖6A所示，兩者的最適pH值均偏酸性，屬于酸性β-甘露聚糖酶，前者的最適pH值為4.0，后者的最適pH值為3.5。它們pH穩(wěn)定性的結(jié)果如圖6B所示，在pH 3.0～6.0之間均較穩(wěn)定，殘留酶活力都可維持在85%以上。

3 討 論

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物基因組測(cè)序的成本越來越低，已報(bào)道的微生物基因組序列也日趨增多，從海量的微生物基因組信息中挖掘新酶基因?qū)?huì)成為一種非常高效的獲取新酶基因的手段，迄今為止也出現(xiàn)了大量的利用基因挖掘技術(shù)獲得新酶基因的報(bào)道[12,24-25]。本研究利用基因挖掘技術(shù)從已報(bào)道的A. oryzae RIB40基因組序列中挖掘到了2 個(gè)GH5家族的β-甘露聚糖酶基因，序列比對(duì)的結(jié)果顯示它們與已報(bào)道的序列相似度最高的也分別僅為79%和68%，能夠定義為2 個(gè)新酶基因。將本課題組克隆出的序列與A. oryzae RIB40基因組中的序列進(jìn)行了比較，Aoman5A的基因序列與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列完全一致，而Aoman5B的基因序列與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列存在2 個(gè)堿基的差異，并呈現(xiàn)出1 個(gè)氨基酸殘基的差異。由于本實(shí)驗(yàn)過程中所有的逆轉(zhuǎn)錄和PCR均是采用高保真的酶，而且每一個(gè)克隆都是重復(fù)了3 次，因此，堿基的差異基本可以排除是由PCR引入的，而是克隆β-甘露聚糖酶基因所用的米曲霉可能與別人測(cè)定基因組的米曲霉的確存在一定的差異。此外，AoMan5A的N端存在一個(gè)天然的CBM結(jié)構(gòu)，與Benech等[26]報(bào)道的序列結(jié)構(gòu)相似，這對(duì)研究天然CBM對(duì)β-甘露聚糖酶特性的影響具有很大的幫助。

常用的pPIC9K和pPICZαA質(zhì)粒由于受酶切位點(diǎn)的限制，均不能在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)帶有天然N端蛋白的表達(dá)[27]，因此利用它們表達(dá)出的重組酶不利于酶學(xué)特性的研究。本研究利用改造過的pPIC9KM質(zhì)粒能夠?qū)崿F(xiàn)AoMan5A和AoMan5B基因在畢赤酵母中的天然N端表達(dá)，研究酶學(xué)特性時(shí)能夠消除N端多余殘基對(duì)酶學(xué)特性的影響。AoMan5A基因在畢赤酵母中的表達(dá)量較高，但重組酶reAoMan5A的酶比活力非常低，僅有8.3 IU/mg，而且它的最適溫度很低、熱穩(wěn)定性也較差，這可能與CBM的存在有一定關(guān)系。因?yàn)閞eAoMan5A中N端的CBM存在著大量的Ser和Gly，它們會(huì)使蛋白的柔性增強(qiáng)、熱穩(wěn)定性降低[28]。在下一步的研究中可以考慮將CBM去除或者將它移接至AoMan5A催化域的C端，進(jìn)一步研究CBM對(duì)β-甘露聚糖酶酶學(xué)特性的影響。此外，盡管reAoMan5B的酶比活力明顯高于reAoMan5A，但它在畢赤酵母中的表達(dá)量過低，因此在表達(dá)上清液中的酶活力也僅為12.5 IU/mL，明顯低于宇佐美曲霉和黑曲霉來源的β-甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)水平[2,29]，它的表達(dá)條件還有待進(jìn)一步的優(yōu)化。重組酶的表觀分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量存在明顯的差異，鑒于糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)及糖含量測(cè)定的結(jié)果，可以初步確定分子質(zhì)量的差異是由糖基化所致。

盡管本研究沒能獲得高活性和高熱穩(wěn)定性的重組β-甘露聚糖酶，但獲得的結(jié)果仍能為后續(xù)的高效表達(dá)、理性改造及其應(yīng)用奠定一些基礎(chǔ)。此外，本研究的成功開展進(jìn)一步豐富了基因挖掘技術(shù)的成功應(yīng)用的案例，可以為其他酶的基因挖掘提供可資借鑒的經(jīng)驗(yàn)。

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Gene Mining, Expression and Characterization of Novel GH5 Family β-Mannanases

TANG Cunduo1, SHI Hongling1, YU Xiaohua2, ZHANG Mei3, TANG Qinghai1, YUE Chao1, YAO Lunguang1, XIA Min2, KAN Yunchao1,*
(1. Henan Provincial Engineering Laboratory of Insect Bio-reactor, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China; 2. School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China; 3. Penglai Market Supervisory Authority, Penglai 265600, China)

In order to obtain novel β-mannanases with excellent performance, two putative novel GH5 family β-mannanase genes were excavated from the Aspergillus oryzae RIB40 genome by genome mining, named as Aoman5A and Aoman5B, respectively. The bioinformatic analysis of the two gene sequences was conducted using corresponding softwares or web server, and the genes encoding two mature peptides were expressed in Pichia pastoris GS115 with the aid of plasmid pPIC9KM, and then the expressed products were purifi ed and identifi ed. The results of bioinformatic analysis showed that AoMan5A contained a signal peptide with 20 amino acid residues, while AoMan5B contained a signal peptide with 21 amino acid residues and a propeptide with 12 amino acid residues. The results of sequence alignment displayed that the sequences of two enzymes had the highest similarity of 68% and 79% with the reported sequences, and the N-terminal of AoMan5A also carried a GH1 family CBM. The results of 3-D structure prediction showed that both of them were in accordance with the (α/β)8TIM-barrel structure. Under the same expression condition, the enzymes activities in supernatants from reAoMan5A and reAoMan5B were 2.9 and 12.5 IU/mL, respectively, with specific activity of 8.3 and 104.2 IU/mg, respectively, after purification. The optimum temperature for the former was 35 ℃, while that for the later was 50 ℃. It turned out that both of them were acidic enzymes. The carbohydrate contents of reAoMan5Aand reAoMan5B were determined to be 25.4% and 12.6% using the phenol sulfuric acid method indicating both to be glycosylated. This study will lay a solid foundation for further research and application of β-mannanases, and also provide a referential guidance for the gene mining of other novel enzymes.

β-mannanase; genome mining; bioinformatic analysis; Aspergillus oryzae; protein expression

10.7506/spkx1002-6630-201611016

Q814

A

1002-6630（2016）11-0090-07

唐存多, 史紅玲, 蔚曉華, 等. 新型GH5家族β-甘露聚糖酶的基因挖掘及表達(dá)鑒定[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 90-96. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611016. http://www.spkx.net.cn TANG Cunduo, SHI Hongling, YU Xiaohua, et al. Gene mining, expression and characterization of novel GH5 family β-mannanases[J]. Food Science, 2016, 37(11): 90-96. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611016. http://www.spkx.net.cn

2015-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401989）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目（15A416008）

唐存多（1987—），男，講師，博士，主要從事工業(yè)酶與生物催化研究。E-mail：tcd530@nynu.edu.cn

*通信作者：闞云超（1974—），男，教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail：kanyunchao@163.com