董久鳴，孫海燕，陳偉國(guó)，楊一平，張　芬

（1.浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 310020； 2.海寧市蠶桑技術(shù)服務(wù)站，浙江 嘉興 314400）

桑葉農(nóng)藥殘留的酶抑制速測(cè)與生物檢測(cè)比較

董久鳴1，孫海燕2，陳偉國(guó)2，楊一平2，張芬2

（1.浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 310020； 2.海寧市蠶桑技術(shù)服務(wù)站，浙江 嘉興 314400）

采用家蠶生物毒性測(cè)定方法驗(yàn)證CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀檢測(cè)桑葉農(nóng)藥殘留，建立了兩種方法對(duì)十余種常用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的對(duì)應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明：隨著桑葉添毒時(shí)間的延長(zhǎng)，家蠶死亡率和殘留農(nóng)藥測(cè)定儀的檢測(cè)抑制率均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，絕大部分農(nóng)藥對(duì)家蠶的死亡率與檢測(cè)抑制率之間同步性較好，但乙酰甲胺磷的檢測(cè)抑制率明顯偏低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，酶抑制速測(cè)法可作為養(yǎng)蠶前桑葉農(nóng)藥殘留粗篩檢測(cè)，也可在家蠶中毒事故發(fā)生后作為判斷農(nóng)藥種類的快速檢測(cè)方法。

農(nóng)藥殘留；快速檢測(cè)；酶抑制法；生物檢測(cè)

桑葉是家蠶的唯一飼料，在生長(zhǎng)、采摘、運(yùn)輸、貯藏和飼喂過程中均有可能受農(nóng)藥污染，導(dǎo)致家蠶中毒造成經(jīng)濟(jì)損失，其中以桑園或周邊農(nóng)作物施用農(nóng)藥污染桑葉最多［1］。因此檢測(cè)桑葉農(nóng)藥殘留是保障養(yǎng)蠶生產(chǎn)安全的主動(dòng)預(yù)防措施，由于氣相色譜、液相色譜等農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法儀器昂貴、技術(shù)要求高、耗時(shí)過長(zhǎng)，難以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普及應(yīng)用。目前技術(shù)指導(dǎo)的主要預(yù)防措施是要求蠶農(nóng)采取提前試喂桑葉，但存在缺少試材、耗時(shí)較長(zhǎng)等問題，在生長(zhǎng)忙季往往被忽視。

近年來，基層農(nóng)技推廣部門已普及酶抑制快速檢測(cè)儀器，廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)，能夠檢測(cè)目前農(nóng)作物使用量最大的有機(jī)磷和氨基甲酸酯兩大類農(nóng)藥［2-6］。鑒于此，我們對(duì)農(nóng)藥殘留速測(cè)儀應(yīng)用于桑葉農(nóng)殘檢測(cè)進(jìn)行了系統(tǒng)試驗(yàn)研究，尤其是針對(duì)桑葉樣品容易出現(xiàn)假陽性等問題優(yōu)化了桑葉的前處理方法，建立了CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀桑葉標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照庫［7］。為進(jìn)一步驗(yàn)證CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀檢測(cè)桑葉樣本的實(shí)際效果，采用與養(yǎng)蠶生物毒性同步的對(duì)比方法，明確了10余種農(nóng)藥的儀器檢測(cè)結(jié)果與生物毒性的對(duì)應(yīng)關(guān)系，為酶抑制快速檢測(cè)方法應(yīng)用于蠶桑生產(chǎn)的安全防范提供參考。

1　材料與方法

1.1供試材料

1.1.1儀器

CL-BⅢ八通道殘留農(nóng)藥測(cè)定儀（上海復(fù)博農(nóng)業(yè)科技有限公司）；電子天平，精確度0.1 g；可調(diào)移液槍，2～100 μl，50～5000 μl；其它玻璃儀器。

1.1.2試劑

CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀配套試劑：提取液，酶試劑，顯色劑，底物，由上海復(fù)博農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.1.3供試桑樹

海寧市蠶桑技術(shù)服務(wù)站試驗(yàn)桑園，強(qiáng)桑1號(hào)品種，5年生，低桿養(yǎng)成，每667 m2桑園栽600株。

1.1.4供試家蠶

蠶品種為白玉×秋豐，浙江省海寧市新興蠶種制造有限公司生產(chǎn)，按照試驗(yàn)時(shí)間要求，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)按常規(guī)方法飼養(yǎng)到3齡起蠶，備用。

1.1.5供試農(nóng)藥

有機(jī)磷農(nóng)藥7種，氨基甲酸酯類農(nóng)藥3種，兩類農(nóng)藥混配4種，見表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1噴藥方法

將供試農(nóng)藥按表1濃度稀釋成藥液，在海寧市蠶桑技術(shù)服務(wù)站試驗(yàn)桑園內(nèi)噴藥，每種藥劑噴5株桑樹，采用農(nóng)邦WBS-16L-A手動(dòng)噴霧器，藥液均勻噴濕桑葉正反面，噴藥桑樹四周至少間隔2株桑樹作為保護(hù)行。噴藥在傍晚進(jìn)行，噴藥后24 h內(nèi)無雨。

1.2.2采葉時(shí)間

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，確定不同供試農(nóng)藥噴于桑樹后的殘毒檢測(cè)和養(yǎng)蠶采葉間隔時(shí)間。試驗(yàn)檢測(cè)開始后以每天為1個(gè)處理，采摘桑葉后先取樣供農(nóng)殘速測(cè)儀檢測(cè)，余葉用于養(yǎng)蠶試驗(yàn)，補(bǔ)喂桑葉均采摘農(nóng)藥處理桑葉，持續(xù)飼養(yǎng)1個(gè)齡期，直至不再出現(xiàn)中毒、死亡為止。

1.2.3養(yǎng)蠶方法

從3齡起蠶開始喂飼各農(nóng)藥處理的桑葉，以新鮮無毒桑葉為對(duì)照處理，每小區(qū)30頭蠶，重復(fù)3次，逐日調(diào)查記載各小區(qū)死亡蠶頭數(shù)。

1.2.4檢測(cè)方法

桑葉樣品檢測(cè)的前處理方法為：從成熟桑葉葉尖部分剪取整塊，并稱準(zhǔn)2 g，將葉背朝上從剪斷面向葉尖卷成直徑1 cm左右的管狀，然后將其盤成圈后放入提取瓶中，加入10 ml提取液，浸泡15 min，大致均分3個(gè)時(shí)段搖晃提取瓶，每次搖晃10下。后續(xù)檢測(cè)按CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀常規(guī)方法操作，選擇標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照庫中的桑葉。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，保存儀器檢測(cè)的抑制率數(shù)據(jù)。檢測(cè)結(jié)果以CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀顯示合格（抑制率＜50%）為參照標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果與分析

2.1桑葉農(nóng)藥殘留檢測(cè)抑制率與生物毒性對(duì)應(yīng)關(guān)系

從圖1可見，14組農(nóng)藥殘留抑制率與家蠶中毒死亡率均隨著噴藥后間隔時(shí)間延長(zhǎng)而下降，但不同農(nóng)藥的下降速率差異較大。圖1（a）辛硫磷1000倍與圖1（b）辛硫磷1000倍+敵敵畏1000倍，噴藥后1 d的抑制率與死亡率接近100%；噴藥后2～4 d的抑制率均高于50%，死亡率則快速下降；噴藥后5～7 d的抑制率均下降到50%以下，死亡率全部為零；圖1（b）雖然在圖1（a）的基礎(chǔ)上增加了敵敵畏，但抑制率僅略有提高，死亡率相近，表明辛硫磷起主導(dǎo)作用。圖1（c）敵敵畏1000倍，噴藥后1～3 d的抑制率均低于50%，死亡率均為零，也印證了圖1（b）的結(jié)果。

表1　14種供試農(nóng)藥Table 1　14 kinds of pesticides

圖1　14組農(nóng)藥處理桑葉的檢測(cè)抑制率和家蠶死亡率Figure 1　Detection inhibition rate and silkworm mortality of treated mulberry leaves with 14 kinds of pesticides

圖1（d）亞胺硫磷1000倍噴藥后1～4 d的抑制率均在80%以上，死亡率也較高；噴藥5 d后抑制率逐漸下降到50%以下，死亡率均為零；表明本方法檢測(cè)亞胺硫磷的抑制率偏高。

圖1（e）殺螟硫磷1500倍的起始抑制率64.27%，隨著時(shí)間推移緩慢下降，表明本方法檢測(cè)殺螟硫磷的抑制率偏低；圖1（f）在圖1（e）的基礎(chǔ)上增加了辛硫磷1000倍，起始抑制率高達(dá)99.86%，噴藥后5 d快速下降到58.17%，但兩者的生物毒性表現(xiàn)一致；表明辛硫磷是推高圖1（f）抑制率的主要因素，而真正導(dǎo)致家蠶死亡率高的是殺螟硫磷的作用。圖1（e）殺螟硫磷噴藥后8 d死亡率為零，而圖1（f）噴藥后10 d死亡率為零，表明這兩種有機(jī)磷農(nóng)藥混用后可能導(dǎo)致殘毒期延長(zhǎng)。

圖1（g）滅多威1500倍與圖1（h）滅多威1500倍+辛硫磷1000倍的起始抑制率都在95%以上，表明本方法檢測(cè)滅多威的抑制率偏高；兩組農(nóng)藥的死亡率與抑制率均有較高對(duì)應(yīng)關(guān)系。殘殺威與滅多威同為氨基甲酸酯類農(nóng)藥，圖1（i）殘殺威1500倍與圖1（j）殘殺威1500倍+辛硫磷1000倍試驗(yàn)結(jié)果與圖1（g）和圖1（h）相似，但在桑葉上的殘毒期略有延長(zhǎng)。

圖1（k）敵百蟲1500倍起始抑制率較高，隨時(shí)間推移抑制率和家蠶死亡率均逐漸下降，檢測(cè)結(jié)果與生物毒性的對(duì)應(yīng)關(guān)系良好，殘毒期約11 d。

圖1（l）毒死蜱1500倍在桑葉上的降解較慢，噴藥后14 d對(duì)3齡家蠶的死亡率仍達(dá)到100%，檢測(cè)抑制率達(dá)到84.56%；因此檢測(cè)從噴藥后13 d開始，噴藥后22 d對(duì)家蠶無中毒致死作用，檢測(cè)抑制率下降到41.15%。

圖1（m）乙酰甲胺磷1500倍在桑葉上的殘毒期較長(zhǎng)，噴藥后13～23 d的家蠶死亡率從60.00%下降到0，但抑制率從50.19%下降到36.70%，即抑制率在50%以下時(shí)仍然對(duì)家蠶有較高的生物毒性，表明本方法對(duì)乙酰甲胺磷靈敏度較低。

圖1（n）丁硫克百威1500倍是供試農(nóng)藥中殘毒期最長(zhǎng)的，噴藥后13 d的家蠶死亡率75.00%，抑制率高達(dá)95.40%，表明本方法對(duì)丁硫克百威靈敏度較高；噴藥后29 d對(duì)家蠶無中毒致死作用。

2.2生物毒性與檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比校正

由表2可見，14組農(nóng)藥處理的桑葉飼喂3齡起蠶無中毒間隔天數(shù)與桑葉農(nóng)殘速測(cè)抑制率＜50%的天數(shù)對(duì)比，77.5%敵敵畏乳油1000倍等9組吻合，20%亞胺硫磷乳油1000倍的養(yǎng)蠶無中毒天數(shù)比檢測(cè)合格天數(shù)短1d，20%滅多威乳油1500倍+40%辛硫磷乳油1000倍、8%殘殺威可濕性粉劑1500倍、480 g/L毒死蜱乳油1500倍的養(yǎng)蠶無中毒天數(shù)比檢測(cè)合格天數(shù)長(zhǎng)1 d，而30%乙酰甲胺磷乳油1500倍的養(yǎng)蠶無中毒天數(shù)比檢測(cè)合格天數(shù)長(zhǎng)9 d。

表2　14組農(nóng)藥處理桑葉的檢測(cè)抑制率和養(yǎng)蠶死亡率Table 2　Detection inhibition rate and silkworm mortality of treated mulberry leaves with 14 kinds of pesticides

此外，從表2還可看出，辛硫磷與滅多威、殘殺威、殺螟硫磷混配后比單劑的生物毒性時(shí)間延長(zhǎng)。

3　小結(jié)與討論

CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀檢測(cè)桑葉農(nóng)藥殘留，其抑制率與家蠶生物毒性測(cè)定結(jié)果高度相關(guān)，檢測(cè)抑制率和家蠶死亡率均隨著農(nóng)藥處理后時(shí)間的推移而下降。但對(duì)乙酰甲胺磷的檢測(cè)抑制率明顯短于實(shí)際的生物毒性，表明其反應(yīng)靈敏度較差。

由于儀器檢測(cè)的酶抑制率以比色法吸光度的變化計(jì)算而來，植物體的內(nèi)容物會(huì)對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)生干擾，檢測(cè)液的顏色會(huì)有變化，可能影響檢測(cè)結(jié)果可靠性［3，8］。因此，CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀電腦版專門提供了檢測(cè)不同蔬菜的校正曲線，但桑葉未列入其中，本試驗(yàn)按照CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀檢測(cè)桑葉農(nóng)藥殘留前處理方法操作［7］，并以家蠶生物毒性測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證。

桑葉農(nóng)藥殘留關(guān)系到能否安全養(yǎng)蠶，酶抑制法作為一種快速檢測(cè)技術(shù)有其方便、快捷、覆蓋農(nóng)藥種類廣等優(yōu)點(diǎn)，但也存在對(duì)不同農(nóng)藥的反應(yīng)靈敏度差異等問題。在現(xiàn)實(shí)條件下，高精檢測(cè)儀器尚無法用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀等快速檢測(cè)設(shè)備已經(jīng)普遍應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)和流通環(huán)節(jié)。探索桑葉農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)技術(shù)，能夠充分利用現(xiàn)有設(shè)備，為養(yǎng)蠶安全提供有效的輔助手段。本試驗(yàn)初步建立了CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測(cè)定儀檢測(cè)桑葉農(nóng)藥殘留抑制率與養(yǎng)蠶生物毒性的數(shù)據(jù)對(duì)比，涉及常用的10種常用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥單劑和4種復(fù)配組合，供預(yù)防養(yǎng)蠶農(nóng)藥中毒參考，也可供中毒事故發(fā)生后的初步定性。

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Enzyme Inhibition Detection of Pesticide Residues on Mulberry Leaves and Compared With Biological Detection

DONG Jiu-ming1，SUN Hai-yan2，CHEN Wei-guo2，YANG Yi-ping2，ZHANG Fen2
（1.Extension Center for Agricultural Technology of Zhejiang Province，Hangzhou 310020，China；2.Haining Sericulture Technology Service Station，Jiaxing 314400 Zhejiang，China）

This article mainly validated the detection of pesticide residues in mulberry leaves by CL-BⅢ with detection of biological toxicity of silkworm method.And the corresponding relationship between the two methods for 14 kinds of commonly used organophosphate and carbamate pesticides were established.The results showed that with the time extension of mulberry leaves with the pesticides，the silkworm mortality and detection inhibition rate of CL-BⅢwere decreased.The synchronization between silkworm mortality rate and detection inhibition rate were all good with most pesticides.However，the detection inhibition rate of Acephate was obviously low.So the enzyme inhibition detection of pesticide residues on mulberry leaves could be a fast detection method for pesticide category.

pesticide residues；fast detection；enzyme inhibition detection；biological detection

S888

A

0258-4069［2016］01-018-05

浙江省三農(nóng)六方科技協(xié)作計(jì)劃中青年項(xiàng)目；浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011R50028-19）

董久鳴（1982-），男，吉林集安人，碩士，農(nóng)藝師。主要從事蠶?？萍佳芯考凹夹g(shù)推廣工作。E-mail：jiuming0828@126.com