鐘鳴，周思凡，張新全，黃秀，嚴海東，張愛玲，羅茜，黃琳凱

(四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，四川 成都 611130)

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利用EST-SSR、IT-ISJ分子標記研究四倍體與八倍體柳枝稷的遺傳多樣性

鐘鳴**，周思凡**，張新全，黃秀，嚴海東，張愛玲，羅茜，黃琳凱*

(四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，四川 成都 611130)

柳枝稷是重要的能源植物之一，為研究四倍體Alamo與通過秋水仙素加倍后的八倍體之間的遺傳差異，本研究以65份四倍體Alamo與其誘變的八倍體為研究材料，通過EST-SSR與IT-ISJ兩種分子標記進行遺傳分析。結(jié)果表明，EST-SSR引物共擴增出245條帶，多態(tài)性比率為99.59%，觀測等位基因Na為1.9878，有效等位基因Ne為1.1718，基因多樣性指數(shù)H為0.1308，Shannon信息指數(shù)I為0.2388，其中四倍體Alamo的各遺傳參數(shù)(226條，88.93%，1.8816，1.1823，0.1349，0.2398)多高于八倍體Alamo(217條，92.24%，1.9184，1.1652，0.1228，0.2234)。IT-ISJ引物共擴增出165條條帶，多態(tài)性比率為96.36%，觀測等位基因Na為1.9878，有效等位基因Ne為1.5777，基因多樣性指數(shù)H為0.3354，Shannon信息指數(shù)I為0.4999，四倍體Alamo各項指數(shù)(145條，94.55%，1.9333，1.6366，0.3602，0.5280)均高于八倍體Alamo(139條，84.24%，1.7515，1.4377，0.2573，0.3864)。通過UPGMA分析表明，65個柳枝稷材料中四倍體與八倍體沒有明顯區(qū)分開，表明其沒有產(chǎn)生明顯的遺傳分化。通過AMOVA分析表明，EST-SSR和IT-ISJ的遺傳變異分別有94.78%和80.76%發(fā)生在倍性內(nèi)，有5.22%和19.24%發(fā)生在倍性間，表明柳枝稷倍性間沒有明顯的差異。

柳枝稷；EST-SSR；IT-ISJ；Alamo；分子標記；遺傳多樣性

柳枝稷(Panicumvirgatum)是一種禾本科多年生C4植物，具有地域分布廣，基因型豐富，纖維素含量高等優(yōu)勢[1]。在美國，柳枝稷已被作為能源模式物種被廣泛研究；在中國，柳枝稷的開發(fā)利用也逐步得到重視和發(fā)展。柳枝稷作為異花授粉植物經(jīng)歷了漫長的進化演變后，其倍性材料主要有四倍體、六倍體和八倍體。其中，多倍體由于基因的劑量和互作效應往往會導致植物產(chǎn)生一系列生理生化功能的變化[2]，在柳枝稷種質(zhì)資源中八倍體較四倍體有新的表型和特性，比如器官增大，抗旱性、抗病蟲性、木質(zhì)纖維素構(gòu)成變化等。柳枝稷豐富的倍性引起的表型變異使得柳枝稷遺傳多樣性豐富，遺傳差異較大[3]。

物種的遺傳多樣性是種質(zhì)資源開發(fā)利用與保護的基礎。分子標記是目前研究植物遺傳多樣性最準確、最主流的檢測方法之一，它不僅可以直接反映基因組DNA上的變化，而且也能反映基因序列上的單個核苷酸變異[4]。目前，分子標記已廣泛應用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、目的基因定位以及種質(zhì)資源研究等[5]，如隨機擴增多態(tài)DNA(random amplification polymorphic DNA，RAPD)構(gòu)建苜蓿(Medicago)的遺傳連鎖圖譜[6]，微衛(wèi)星DNA標記(simple sequence repeats，SSR)定位斯卑爾脫小麥(Triticumspelta)YrSp基因[7]，隨機擴增多態(tài)DNA標記(random amplification polymorphic DNA，RAPD)研究高羊茅(Festucaarundinacea)種質(zhì)資源遺傳多樣性[8]。本試驗利用EST-SSR(expressed sequence tag-simple sequence repeat)和IT-ISJ(intron targeted intron-exon splice junction)分子標記進行四倍體Alamo與八倍體Alamo的遺傳多樣性分析。在眾多標記中，簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)具有多態(tài)性高、多等位性、共顯性、重復性高、易用于PCR檢測等優(yōu)點[9]。SSR可分為基因組SSR(g-SSR)和表達序列標簽SSR(EST-SSR)等，而EST-SSR與其他相比較經(jīng)濟，利用相對充分[10]。目前，EST-SSR用于柳枝稷種質(zhì)資源研究已有報道[11-13]。Weining等[14]根據(jù)內(nèi)含子-外顯子拼接位點的保守序列設計擴增內(nèi)含子或外顯子的ISJ標記引物，并應用于大麥(Hordeumvulgare)和小麥(Triticumaestivum)，發(fā)現(xiàn)ISJ單引物PCR擴增效果差，而ISJ引物與α-淀粉酶基因保守序列引物組合的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增效果好。西南大學的張正圣實驗室根據(jù)植物基因內(nèi)含子剪接位點設計合成的IT-ISJ分子標記，其正反引物可進行自由的組合，成本低，重現(xiàn)性好，已成功用于陸地棉(Gosspiumhirsutum)重組近交系群體構(gòu)建遺傳圖譜[15]，也可用于比較基因組學的研究。目前在棉花[16]、花生(Arachishypogaea)[17]等物種上都得到了運用，但尚未應用于能源植物中。兩種分子標記的結(jié)合，不僅可以驗證兩種分子標記在柳枝稷多態(tài)性上的可行性，還可對比驗證柳枝稷不同倍性間的遺傳多樣性[18-20]。

本研究采用EST-SSR和IT-ISJ對柳枝稷Alamo四倍體及通過秋水仙素離體誘導獲得的柳枝稷八倍體Alamo進行了遺傳多樣性分析，以了解這些多倍體材料的遺傳背景和DNA遺傳多樣性分析，有助于全面深入了解柳枝稷四倍體Alamo與八倍體Alamo的遺傳背景信息，為柳枝稷品種的定向選育和其他禾本科多倍化遺傳變異研究提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料

本試驗采用65份柳枝稷品種Alamo不同倍性的材料(表1)，其中28份為柳枝稷四倍體Alamo材料(編號1-22為隨機選取的四倍體單株，編號23-28為從四倍體中選擇的出愈率和轉(zhuǎn)化率高的種子)，37份為柳枝稷八倍體Alamo材料(其中編號29為四倍體Alamo材料經(jīng)秋水仙素加倍得來[3]，編號30-65為編號29自交產(chǎn)生的子一代)。實驗材料于2012年4月種植于四川農(nóng)業(yè)大學雅安草學試驗基地，其新鮮幼嫩葉片于2014年7月采摘，放入裝有足量變色硅膠的收集袋中干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　柳枝稷供試材料

1.2基因組DNA的提取和濃度測定

每份材料選取長勢良好的一個單株，隨機取5片幼嫩葉片混合，采用植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)進行基因組DNA的提取，對提取出的DNA采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度儀檢測其純度和濃度，經(jīng)提純合格后稀釋至20 ng/μL的工作濃度，-20 ℃冷藏備用。

1.3EST-SSR和IT-ISJ標記擴增

選取柳枝稷四倍體4Alamo、HR6和八倍體8Alamo、8Alamo-17四個供試材料作為DNA模板，分別對24對禾本科通用EST-SSR引物[11]及參考鄭靚等[15]實驗中11條上游IT-ISJ引物和34條下游IT-ISJ引物隨機組合產(chǎn)生的40對IT-ISJ引物進行篩選，從中選出條帶清晰，多態(tài)性好的引物進行后續(xù)擴增。所篩選出的EST-SSR引物和IT-ISJ引物詳細內(nèi)容見表2。

表2　EST-SSR和IT-ISJ引物信息

注：a表示EST-SSR引物，b表示IT-ISJ引物。

Note: a means EST-SSR primers, while b means IT-ISJ primers.

EST-SSR的擴增反應體系為15 μL：DNA 1 μL (20 ng/μL)，上下游引物各1 μL(10 pmol/μL)，Taq DNA酶0.5 μL(2.5 U/μL)，Mix混合液7.5 μL(包含Mg2+、dNTPs、10×PCR buffer)，ddH2O 3.5 μL。EST-SSR擴增反應程序為：95 ℃預變性10 min；9 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃變性30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

IT-ISJ 擴增采用15 μL反應體系：DNA 2 μL (20 ng/μL)，上下游引物0.75 μL(10 pmol/μL)，Taq DNA酶0.5 μL(2.5 U/μL)，Mix 混合液7.5 μL(包含Mg2+、dNTPs、10×PCR buffer)，ddH2O 3.5 μL。IT-ISJ擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，50～55 ℃退火45 s，72 ℃變性1 min，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

EST-SSR和IT-ISJ擴增產(chǎn)物均用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，400 V電壓下電泳90 min，以DL2000 DNA Marker作為標準分子量對照，電泳結(jié)束后沖洗膠板，1 g/L AgNO3染色14 min，顯影后拍照保存(圖1，圖2)。

圖1　EST-SSR引物51擴增圖譜Fig.1　Result of PCR amplification of No.51 EST-SSR primer

圖2　IT-ISJ引物5F5R擴增圖譜Fig.2　Result of PCR amplification of 5F5R IT-ISJ primer

1.4擴增譜帶統(tǒng)計分析

對EST-SSR和IT-ISJ擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果分別比對與校正后，根據(jù)標準分子質(zhì)量標記，對擴增條帶在電泳圖譜上的位置，從大到小依次編號和統(tǒng)計，對有擴增條帶(包括強帶或清晰弱帶)的記為“1”,無帶的記為“0”。將建立的EST-SSR和IT-ISJ 標記0，1原始矩陣采用Excel 2010和POPGENE V1.32軟件[21]分別計算65個供試柳枝稷材料的各個遺傳多樣性參數(shù)，包括總擴增條帶數(shù)(TNB)、多態(tài)性條帶數(shù)(NPB)、多態(tài)性條帶百分比(PP)、基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon指數(shù)(I)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)。利用UPGMA法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，算術(shù)平均非加權(quán)配組法)進行聚類分析。并通過AMOVE 1.55軟件對柳枝稷四倍體Alamo和八倍體Alamo間與內(nèi)的遺傳距離進行分子變異方差分析(analysis of molecular variance)。

2　結(jié)果與分析

2.1EST-SSR和IT-ISJ擴增多樣性分析

從18對EST-SSR引物和40對IT-ISJ引物中分別篩選得到12和15對具有較好擴增結(jié)果的引物，其擴增條帶大小分別在100～250 bp和100～500 bp之間。EST-SSR和IT-ISJ標記的多態(tài)性水平和信息量如表3所示。從中可以看出EST-SSR和IT-ISJ分別擴增出條帶245和165條，多態(tài)性比率(PPB)分別為99.59%和96.36%。兩種標記的多態(tài)性比例都比較高，且差異不大。但兩種標記效率的比較分析可見，EST-SSR的有效多元比率(EMR)和標記指數(shù)(MI)均高于IT-ISJ，且高達一倍左右。表明EST-SSR標記具有較強的品種辨別能力和引物效率。

對EST-SSR和IT-ISJ分子標記的遺傳參數(shù)計算結(jié)果顯示觀測等位基因Na分別為1.9878和1.9455，有效等位基因Ne分別為1.1718和1.5777，基因多樣性指數(shù)H分別為0.1308和0.3354，Shannon信息指數(shù)I分別為0.2388和0.4999(表4，表5)。兩分子標記測得的觀測等位基因結(jié)果基本一致，但IT-ISJ測得的有效等位基因、基因多樣性指數(shù)與Shannon指數(shù)分別都高于EST-SSR。除EST-SSR的四倍體Alamo的Na低于八倍體Alamo，EST-SSR和IT-ISJ標記的四倍體Alamo相應各遺傳參數(shù)(Na、Ne、H和I)均高于八倍體Alamo。

表3　EST-SSR和IT-ISJ標記效率比較分析

表4　2種倍性柳枝稷EST-SSR分析結(jié)果

表5　2種倍性柳枝稷IT-ISJ分析結(jié)果

2.265份柳枝稷不同倍性Alamo材料的資源遺傳聚類分析

利用UPGMA法對供試柳枝稷材料EST-SSR、IT-ISJ以及EST-SSR與IT-ISJ數(shù)據(jù)進行了聚類分析(圖3，圖4，圖5)。EST-SSR數(shù)據(jù)表明四倍體Alamo與八倍體Alamo沒有明顯區(qū)分開，總體來看，65份供試材料主要可分為三類。類群1為2個四倍體Alamo和22個八倍體Alamo，類群2為9個四倍體Alamo和15個八倍體Alamo，類群3為17個四倍體Alamo。根據(jù)IT-ISJ聚類圖顯示，四倍體Alamo與八倍體Alamo大體分開，65份材料可分為兩大類。其中第1類為6個四倍體Alamo和36個八倍體Alamo，第2類為22個四倍體Alamo和1個八倍體Alamo。將兩種分子標記聯(lián)合分析可得出，65個材料可分為三大類，且四倍體Alamo與八倍體Alamo沒有完全分開。其中第1類包含6個四倍體Alamo和35個八倍體Alamo，第2類包含12個四倍體Alamo和2個八倍體Alamo，第3類包含10個四倍體Alamo。

圖3　EST-SSR標記對65個柳枝稷植株親緣關(guān)系聚類圖Fig.3　Dendrogram of the relationship UPGMA cluster of 65 switchgrass based on EST-SSR markers

圖4　IT-ISJ標記對65個柳枝稷植株親緣關(guān)系聚類圖Fig.4　Dendrogram of the relationship unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster of 65 switchgrass based on IT-ISJ markers

圖5　EST-SSR和IT-ISJ標記對65個柳枝稷植株親緣關(guān)系聚類圖Fig.5　Dendrogram of the relationship UPGMA cluster of 65 switchgrass based on EST-SSR and IT-ISJ markers

2.365份柳枝稷不同倍性Alamo材料遺傳分化分析

對柳枝稷兩個倍性Alamo材料建立的EST-SSR和IT-ISJ原始矩陣，運用AMOVA分析了兩個倍性群體的遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：兩個標記總的遺傳變異中有95%(EST-SSR)和81%(IT-ISJ)發(fā)生在柳枝稷Alamo兩倍性之內(nèi)，而Alamo兩倍性之間的遺傳變異較低，只有5%(EST-SSR)和19%(IT-ISJ)，兩個標記Alamo倍性群體之間和之內(nèi)的差異均極顯著(P<0.001)(表6和表7)。此外，兩標記得到的Alamo倍性間的遺傳分化系數(shù)Фst值0.052(EST-SSR)和0.192(IT-ISJ)，也說明遺傳結(jié)構(gòu)的變異主要存在于倍性之內(nèi)。

表6　EST-SSR 柳枝稷群體分子變異方差分析

表7　IT-ISJ 柳枝稷群體分子變異方差分析

3　討論

目前，關(guān)于其他植物多倍體的遺傳多樣性研究有較多報道，所得到結(jié)果基本呈兩種分化，一種為倍性材料DNA水平間沒有明顯的差異[22-23]；而另一種為在倍性材料間發(fā)現(xiàn)了明顯的基因差異[24-25]。根據(jù)柳枝稷材料間遺傳關(guān)系的聚類圖來看(圖3，4，5)，各材料的聚類分布與其倍性間沒有存在明顯的差異。本研究中EST-SSR和IT-ISJ標記在柳枝稷Alamo兩倍性間，四倍體Alamo相應各遺傳參數(shù)(Na、Ne、H和I)多數(shù)略高于八倍體Alamo(表3，4，5)，根據(jù)相關(guān)柳枝稷倍性的研究表明，柳枝稷兩個生態(tài)型之間遺傳差異不大，但四倍體具有較高水平的多態(tài)性，且具有異位顯性基因和互補的基因作用，通常將四倍體作為雜種優(yōu)勢群體[26]。Brunken等[27]的研究表明，整倍體倍性變異和非整倍體倍性變異能夠增加位點的等位基因數(shù)，但這種情況在等位頻率極低的條件下不會發(fā)生或者可能發(fā)生，這與群體內(nèi)染色體數(shù)目變異的狀況一致。本試驗所得結(jié)果與之基本相似，分析導致這一實驗結(jié)果的原因：其一，可能由于本實驗中八倍體Alamo是由四倍體Alamo經(jīng)過秋水仙素人工加倍而來，所以基因組總體差異不大，但是在秋水仙素誘變過程中的影響可能導致兩群體間產(chǎn)生差異[28]；其二，通過基因加倍后，八倍體在某些基因位點經(jīng)過基因重復后某些特異性條帶變成了非特異性條帶，基因更趨于穩(wěn)定，從而減少了八倍體的多態(tài)性。柳枝稷有低地型和高地型兩種生態(tài)型，其中低地型為四倍體，植株高大生物產(chǎn)量高；高地型多為八倍體，抗寒能力強[29]。采用雜交育種方式聚合兩種生態(tài)型一直是育種家致力于解決的問題，但兩種倍性間雜交相對較難，低地型八倍體的創(chuàng)制及遺傳多樣性的信息可為兩種生態(tài)型雜交育種提供寶貴的物質(zhì)和數(shù)據(jù)支撐。

本試驗采用的兩個分子標記分別從12對EST-SSR和15對IT-ISJ引物中擴增出245和165條清晰可辨條帶(TNB)，分子標記檢測效率的評價指標很多，目前廣泛應用的有MI、PIC、DI、EMR等[30]。本研究對EST-SSR和IT-ISJ的PPB、PIC、EMR、MI指標進行了比較研究。結(jié)果表明，對于EST-SSR和IT-ISJ來說，都能產(chǎn)生各自有效的多態(tài)性條帶，但多態(tài)性水平及檢測效率各不相同。EST-SSR的基本重復單元是由幾十個核苷酸組成的，重復次數(shù)一般為10～50，同一類微衛(wèi)星DNA可分布在基因組的不同位置上[19]，基因組中EST-SSR多態(tài)性較高，并且等位基因數(shù)目多，呈共顯性遺傳，所以可提供的多態(tài)性信息量較高，結(jié)果穩(wěn)定可靠[20]，因此，被廣泛應用于遺傳多樣性研究。隨著EST-SSR標記位點在圖譜上的豐富，它以高度的多態(tài)性信息量和PCR技術(shù)的方便性使其表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢。IT-ISJ作為一種新興的分子標記方式，在技術(shù)上可能略顯不成熟，還需要進一步完善。IT-ISJ作為一種新型的DNA分子標記，迄今尚未在能源草上應用，本研究探討了其在柳枝稷上的應用效果。現(xiàn)今報道的植物遺傳多樣性相關(guān)研究多是單一分子標記鑒定的結(jié)果，本研究運用EST-SSR和IT-ISJ標記技術(shù)同時對柳枝稷遺傳多樣性進行了分析，不僅驗證了兩種分子標記的可行性，還對比了柳枝稷不同倍性間的遺傳多樣性差異。試驗表明，EST-SSR和IT-ISJ標記對柳枝稷同一群體多樣性的評價存在一定的差異，四倍體Alamo和八倍體Alamo沒有明顯的遺傳分化，但四倍體Alamo的遺傳多樣性高于八倍體Alamo。本試驗結(jié)果可為柳枝稷種質(zhì)資源的開發(fā)利用、遺傳變異等方面的研究提供一定的參考。

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Genetic diversity assessment of tetraploid and octoploid switchgrass using EST-SSR and IT-ISJ molecular markers

ZHONG Ming**, ZHOU Si-Fan**, ZHANG Xin-Quan, HUANG Xiu, YAN Hai-Dong, ZHANG Ai-Ling, LUO-Qian, HUANG Lin-Kai*

Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China

Switchgrass is an important bioenergy plant. In this study, the genetic diversity of 65 samples of tetraploid Alamo and mutated octoploid Alamo (using colchicine) was assessed using expressed sequence tag-simple sequence repeat (EST-SSR) and intron-targeted intron-exon splice junction (IT-ISJ) markers. The results showed that EST-SSR primers amplified 245 fragments; the percentage of polymorphic loci was 99.59%, the number of alleles (Na) was 1.9878, the effective number of alleles (Ne) was 1.1718, Nei’s gene diversity (H) was 0.1308, and Shannon’s information index (I) was 0.2388. These genetic parameters for the tetraploid Alamo were as follows: 226 fragments; 88.93% polymorphic loci; Na, 1.8816; Ne, 1.1823; H, 0.1349; and I, 0.2398. These values were higher than those obtained for octoploid Alamo: 217 fragments; 92.24% polymorphic loci; Na, 1.9184; Ne, 1.1652; H, 0.1228; and I, 0.2234. The IT-ISJ primers amplified 165 fragments and the percentage of polymorphic loci was 96.36%, Na was 1.9878, Ne was 1.5777, H was 0.3354, and I was 0.4999. These parameters for tetraploid Alamo were as follows: 145 fragments; 94.55% polymorphic loci; Na, 1.9333; Ne, 1.6366; H, 0.3602; and I, 0.5280. These values were higher than those obtained for octoploid Alamo: 139 fragments; 84.24% polymorphic loci; Na, 1.7515; Ne, 1.4337; H, 0.2573; and I, 0.3864. A clustering analysis with the unweighted pair-group method with arithmetic means did not clearly separate 68 samples of tetraploid Alamo and octoploid Alamo, which had a low level of genetic differentiation. An analysis of molecular variance showed that 94.78% and 80.76% of genetic diversity occurred within ploidy levels, while 5.22% and 19.24% of genetic diversity occurred between ploidy levels.

switchgrass (Panicumvirgatum); EST-SSR (expressed sequence tag-simple sequence repeat); IT-ISJ (intron targeted intron-exon splice junction); Alamo; molecular marker; genetic diversity

10.11686/cyxb2015554

2015-12-07；改回日期：2016-01-26

科技部“十二五”863計劃(2012AA101801-2)和國家自然基金(31201845)資助。

鐘鳴(1987-)，女，四川富順人，碩士。E-mail：zmzl7758@163.com。周思凡(1993-)，女，重慶人，在讀碩士。E-mail：swanchou93@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

Corresponding author. E-mail：huanglingkai@sicau.edu.cn

http://cyxb.lzu.edu.cn

鐘鳴, 周思凡, 張新全, 黃秀, 嚴海東, 張愛玲，羅茜，黃琳凱. 利用EST-SSR、IT-ISJ分子標記研究四倍體與八倍體柳枝稷的遺傳多樣性. 草業(yè)學報, 2016, 25(10): 113-123.

ZHONG Ming, ZHOU Si-Fan, ZHANG Xin-Quan, HUANG Xiu, YAN Hai-Dong, ZHANG Ai-Ling, LUO-Qian, HUANG Lin-Kai. Genetic diversity assessment of tetraploid and octoploid switchgrass using EST-SSR and IT-ISJ molecular markers. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(10): 113-123.