鐘鳴，周思凡，張新全，黃秀，嚴(yán)海東，張愛玲，羅茜，黃琳凱

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130)

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利用EST-SSR、IT-ISJ分子標(biāo)記研究四倍體與八倍體柳枝稷的遺傳多樣性

鐘鳴**，周思凡**，張新全，黃秀，嚴(yán)海東，張愛玲，羅茜，黃琳凱*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130)

柳枝稷是重要的能源植物之一，為研究四倍體Alamo與通過秋水仙素加倍后的八倍體之間的遺傳差異，本研究以65份四倍體Alamo與其誘變的八倍體為研究材料，通過EST-SSR與IT-ISJ兩種分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明，EST-SSR引物共擴(kuò)增出245條帶，多態(tài)性比率為99.59%，觀測(cè)等位基因Na為1.9878，有效等位基因Ne為1.1718，基因多樣性指數(shù)H為0.1308，Shannon信息指數(shù)I為0.2388，其中四倍體Alamo的各遺傳參數(shù)(226條，88.93%，1.8816，1.1823，0.1349，0.2398)多高于八倍體Alamo(217條，92.24%，1.9184，1.1652，0.1228，0.2234)。IT-ISJ引物共擴(kuò)增出165條條帶，多態(tài)性比率為96.36%，觀測(cè)等位基因Na為1.9878，有效等位基因Ne為1.5777，基因多樣性指數(shù)H為0.3354，Shannon信息指數(shù)I為0.4999，四倍體Alamo各項(xiàng)指數(shù)(145條，94.55%，1.9333，1.6366，0.3602，0.5280)均高于八倍體Alamo(139條，84.24%，1.7515，1.4377，0.2573，0.3864)。通過UPGMA分析表明，65個(gè)柳枝稷材料中四倍體與八倍體沒有明顯區(qū)分開，表明其沒有產(chǎn)生明顯的遺傳分化。通過AMOVA分析表明，EST-SSR和IT-ISJ的遺傳變異分別有94.78%和80.76%發(fā)生在倍性內(nèi)，有5.22%和19.24%發(fā)生在倍性間，表明柳枝稷倍性間沒有明顯的差異。

柳枝稷；EST-SSR；IT-ISJ；Alamo；分子標(biāo)記；遺傳多樣性

柳枝稷(Panicumvirgatum)是一種禾本科多年生C4植物，具有地域分布廣，基因型豐富，纖維素含量高等優(yōu)勢(shì)[1]。在美國，柳枝稷已被作為能源模式物種被廣泛研究；在中國，柳枝稷的開發(fā)利用也逐步得到重視和發(fā)展。柳枝稷作為異花授粉植物經(jīng)歷了漫長的進(jìn)化演變后，其倍性材料主要有四倍體、六倍體和八倍體。其中，多倍體由于基因的劑量和互作效應(yīng)往往會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生一系列生理生化功能的變化[2]，在柳枝稷種質(zhì)資源中八倍體較四倍體有新的表型和特性，比如器官增大，抗旱性、抗病蟲性、木質(zhì)纖維素構(gòu)成變化等。柳枝稷豐富的倍性引起的表型變異使得柳枝稷遺傳多樣性豐富，遺傳差異較大[3]。

物種的遺傳多樣性是種質(zhì)資源開發(fā)利用與保護(hù)的基礎(chǔ)。分子標(biāo)記是目前研究植物遺傳多樣性最準(zhǔn)確、最主流的檢測(cè)方法之一，它不僅可以直接反映基因組DNA上的變化，而且也能反映基因序列上的單個(gè)核苷酸變異[4]。目前，分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、目的基因定位以及種質(zhì)資源研究等[5]，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(random amplification polymorphic DNA，RAPD)構(gòu)建苜蓿(Medicago)的遺傳連鎖圖譜[6]，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(simple sequence repeats，SSR)定位斯卑爾脫小麥(Triticumspelta)YrSp基因[7]，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA標(biāo)記(random amplification polymorphic DNA，RAPD)研究高羊茅(Festucaarundinacea)種質(zhì)資源遺傳多樣性[8]。本試驗(yàn)利用EST-SSR(expressed sequence tag-simple sequence repeat)和IT-ISJ(intron targeted intron-exon splice junction)分子標(biāo)記進(jìn)行四倍體Alamo與八倍體Alamo的遺傳多樣性分析。在眾多標(biāo)記中，簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)具有多態(tài)性高、多等位性、共顯性、重復(fù)性高、易用于PCR檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[9]。SSR可分為基因組SSR(g-SSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(EST-SSR)等，而EST-SSR與其他相比較經(jīng)濟(jì)，利用相對(duì)充分[10]。目前，EST-SSR用于柳枝稷種質(zhì)資源研究已有報(bào)道[11-13]。Weining等[14]根據(jù)內(nèi)含子-外顯子拼接位點(diǎn)的保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增內(nèi)含子或外顯子的ISJ標(biāo)記引物，并應(yīng)用于大麥(Hordeumvulgare)和小麥(Triticumaestivum)，發(fā)現(xiàn)ISJ單引物PCR擴(kuò)增效果差，而ISJ引物與α-淀粉酶基因保守序列引物組合的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增效果好。西南大學(xué)的張正圣實(shí)驗(yàn)室根據(jù)植物基因內(nèi)含子剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的IT-ISJ分子標(biāo)記，其正反引物可進(jìn)行自由的組合，成本低，重現(xiàn)性好，已成功用于陸地棉(Gosspiumhirsutum)重組近交系群體構(gòu)建遺傳圖譜[15]，也可用于比較基因組學(xué)的研究。目前在棉花[16]、花生(Arachishypogaea)[17]等物種上都得到了運(yùn)用，但尚未應(yīng)用于能源植物中。兩種分子標(biāo)記的結(jié)合，不僅可以驗(yàn)證兩種分子標(biāo)記在柳枝稷多態(tài)性上的可行性，還可對(duì)比驗(yàn)證柳枝稷不同倍性間的遺傳多樣性[18-20]。

本研究采用EST-SSR和IT-ISJ對(duì)柳枝稷Alamo四倍體及通過秋水仙素離體誘導(dǎo)獲得的柳枝稷八倍體Alamo進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以了解這些多倍體材料的遺傳背景和DNA遺傳多樣性分析，有助于全面深入了解柳枝稷四倍體Alamo與八倍體Alamo的遺傳背景信息，為柳枝稷品種的定向選育和其他禾本科多倍化遺傳變異研究提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料

本試驗(yàn)采用65份柳枝稷品種Alamo不同倍性的材料(表1)，其中28份為柳枝稷四倍體Alamo材料(編號(hào)1-22為隨機(jī)選取的四倍體單株，編號(hào)23-28為從四倍體中選擇的出愈率和轉(zhuǎn)化率高的種子)，37份為柳枝稷八倍體Alamo材料(其中編號(hào)29為四倍體Alamo材料經(jīng)秋水仙素加倍得來[3]，編號(hào)30-65為編號(hào)29自交產(chǎn)生的子一代)。實(shí)驗(yàn)材料于2012年4月種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安草學(xué)試驗(yàn)基地，其新鮮幼嫩葉片于2014年7月采摘，放入裝有足量變色硅膠的收集袋中干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　柳枝稷供試材料

1.2基因組DNA的提取和濃度測(cè)定

每份材料選取長勢(shì)良好的一個(gè)單株，隨機(jī)取5片幼嫩葉片混合，采用植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)進(jìn)行基因組DNA的提取，對(duì)提取出的DNA采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度儀檢測(cè)其純度和濃度，經(jīng)提純合格后稀釋至20 ng/μL的工作濃度，-20 ℃冷藏備用。

1.3EST-SSR和IT-ISJ標(biāo)記擴(kuò)增

選取柳枝稷四倍體4Alamo、HR6和八倍體8Alamo、8Alamo-17四個(gè)供試材料作為DNA模板，分別對(duì)24對(duì)禾本科通用EST-SSR引物[11]及參考鄭靚等[15]實(shí)驗(yàn)中11條上游IT-ISJ引物和34條下游IT-ISJ引物隨機(jī)組合產(chǎn)生的40對(duì)IT-ISJ引物進(jìn)行篩選，從中選出條帶清晰，多態(tài)性好的引物進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增。所篩選出的EST-SSR引物和IT-ISJ引物詳細(xì)內(nèi)容見表2。

表2　EST-SSR和IT-ISJ引物信息

注：a表示EST-SSR引物，b表示IT-ISJ引物。

Note: a means EST-SSR primers, while b means IT-ISJ primers.

EST-SSR的擴(kuò)增反應(yīng)體系為15 μL：DNA 1 μL (20 ng/μL)，上下游引物各1 μL(10 pmol/μL)，Taq DNA酶0.5 μL(2.5 U/μL)，Mix混合液7.5 μL(包含Mg2+、dNTPs、10×PCR buffer)，ddH2O 3.5 μL。EST-SSR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；9 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃變性30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

IT-ISJ 擴(kuò)增采用15 μL反應(yīng)體系：DNA 2 μL (20 ng/μL)，上下游引物0.75 μL(10 pmol/μL)，Taq DNA酶0.5 μL(2.5 U/μL)，Mix 混合液7.5 μL(包含Mg2+、dNTPs、10×PCR buffer)，ddH2O 3.5 μL。IT-ISJ擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，50～55 ℃退火45 s，72 ℃變性1 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

EST-SSR和IT-ISJ擴(kuò)增產(chǎn)物均用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，400 V電壓下電泳90 min，以DL2000 DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，電泳結(jié)束后沖洗膠板，1 g/L AgNO3染色14 min，顯影后拍照保存(圖1，圖2)。

圖1　EST-SSR引物51擴(kuò)增圖譜Fig.1　Result of PCR amplification of No.51 EST-SSR primer

圖2　IT-ISJ引物5F5R擴(kuò)增圖譜Fig.2　Result of PCR amplification of 5F5R IT-ISJ primer

1.4擴(kuò)增譜帶統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)EST-SSR和IT-ISJ擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果分別比對(duì)與校正后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量標(biāo)記，對(duì)擴(kuò)增條帶在電泳圖譜上的位置，從大到小依次編號(hào)和統(tǒng)計(jì)，對(duì)有擴(kuò)增條帶(包括強(qiáng)帶或清晰弱帶)的記為“1”,無帶的記為“0”。將建立的EST-SSR和IT-ISJ 標(biāo)記0，1原始矩陣采用Excel 2010和POPGENE V1.32軟件[21]分別計(jì)算65個(gè)供試柳枝稷材料的各個(gè)遺傳多樣性參數(shù)，包括總擴(kuò)增條帶數(shù)(TNB)、多態(tài)性條帶數(shù)(NPB)、多態(tài)性條帶百分比(PP)、基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon指數(shù)(I)、觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)。利用UPGMA法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，算術(shù)平均非加權(quán)配組法)進(jìn)行聚類分析。并通過AMOVE 1.55軟件對(duì)柳枝稷四倍體Alamo和八倍體Alamo間與內(nèi)的遺傳距離進(jìn)行分子變異方差分析(analysis of molecular variance)。

2　結(jié)果與分析

2.1EST-SSR和IT-ISJ擴(kuò)增多樣性分析

從18對(duì)EST-SSR引物和40對(duì)IT-ISJ引物中分別篩選得到12和15對(duì)具有較好擴(kuò)增結(jié)果的引物，其擴(kuò)增條帶大小分別在100～250 bp和100～500 bp之間。EST-SSR和IT-ISJ標(biāo)記的多態(tài)性水平和信息量如表3所示。從中可以看出EST-SSR和IT-ISJ分別擴(kuò)增出條帶245和165條，多態(tài)性比率(PPB)分別為99.59%和96.36%。兩種標(biāo)記的多態(tài)性比例都比較高，且差異不大。但兩種標(biāo)記效率的比較分析可見，EST-SSR的有效多元比率(EMR)和標(biāo)記指數(shù)(MI)均高于IT-ISJ，且高達(dá)一倍左右。表明EST-SSR標(biāo)記具有較強(qiáng)的品種辨別能力和引物效率。

對(duì)EST-SSR和IT-ISJ分子標(biāo)記的遺傳參數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示觀測(cè)等位基因Na分別為1.9878和1.9455，有效等位基因Ne分別為1.1718和1.5777，基因多樣性指數(shù)H分別為0.1308和0.3354，Shannon信息指數(shù)I分別為0.2388和0.4999(表4，表5)。兩分子標(biāo)記測(cè)得的觀測(cè)等位基因結(jié)果基本一致，但I(xiàn)T-ISJ測(cè)得的有效等位基因、基因多樣性指數(shù)與Shannon指數(shù)分別都高于EST-SSR。除EST-SSR的四倍體Alamo的Na低于八倍體Alamo，EST-SSR和IT-ISJ標(biāo)記的四倍體Alamo相應(yīng)各遺傳參數(shù)(Na、Ne、H和I)均高于八倍體Alamo。

表3　EST-SSR和IT-ISJ標(biāo)記效率比較分析

表4　2種倍性柳枝稷EST-SSR分析結(jié)果

表5　2種倍性柳枝稷IT-ISJ分析結(jié)果

2.265份柳枝稷不同倍性Alamo材料的資源遺傳聚類分析

利用UPGMA法對(duì)供試柳枝稷材料EST-SSR、IT-ISJ以及EST-SSR與IT-ISJ數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類分析(圖3，圖4，圖5)。EST-SSR數(shù)據(jù)表明四倍體Alamo與八倍體Alamo沒有明顯區(qū)分開，總體來看，65份供試材料主要可分為三類。類群1為2個(gè)四倍體Alamo和22個(gè)八倍體Alamo，類群2為9個(gè)四倍體Alamo和15個(gè)八倍體Alamo，類群3為17個(gè)四倍體Alamo。根據(jù)IT-ISJ聚類圖顯示，四倍體Alamo與八倍體Alamo大體分開，65份材料可分為兩大類。其中第1類為6個(gè)四倍體Alamo和36個(gè)八倍體Alamo，第2類為22個(gè)四倍體Alamo和1個(gè)八倍體Alamo。將兩種分子標(biāo)記聯(lián)合分析可得出，65個(gè)材料可分為三大類，且四倍體Alamo與八倍體Alamo沒有完全分開。其中第1類包含6個(gè)四倍體Alamo和35個(gè)八倍體Alamo，第2類包含12個(gè)四倍體Alamo和2個(gè)八倍體Alamo，第3類包含10個(gè)四倍體Alamo。

圖3　EST-SSR標(biāo)記對(duì)65個(gè)柳枝稷植株親緣關(guān)系聚類圖Fig.3　Dendrogram of the relationship UPGMA cluster of 65 switchgrass based on EST-SSR markers

圖4　IT-ISJ標(biāo)記對(duì)65個(gè)柳枝稷植株親緣關(guān)系聚類圖Fig.4　Dendrogram of the relationship unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster of 65 switchgrass based on IT-ISJ markers

圖5　EST-SSR和IT-ISJ標(biāo)記對(duì)65個(gè)柳枝稷植株親緣關(guān)系聚類圖Fig.5　Dendrogram of the relationship UPGMA cluster of 65 switchgrass based on EST-SSR and IT-ISJ markers

2.365份柳枝稷不同倍性Alamo材料遺傳分化分析

對(duì)柳枝稷兩個(gè)倍性Alamo材料建立的EST-SSR和IT-ISJ原始矩陣，運(yùn)用AMOVA分析了兩個(gè)倍性群體的遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：兩個(gè)標(biāo)記總的遺傳變異中有95%(EST-SSR)和81%(IT-ISJ)發(fā)生在柳枝稷Alamo兩倍性之內(nèi)，而Alamo兩倍性之間的遺傳變異較低，只有5%(EST-SSR)和19%(IT-ISJ)，兩個(gè)標(biāo)記Alamo倍性群體之間和之內(nèi)的差異均極顯著(P<0.001)(表6和表7)。此外，兩標(biāo)記得到的Alamo倍性間的遺傳分化系數(shù)Фst值0.052(EST-SSR)和0.192(IT-ISJ)，也說明遺傳結(jié)構(gòu)的變異主要存在于倍性之內(nèi)。

表6　EST-SSR 柳枝稷群體分子變異方差分析

表7　IT-ISJ 柳枝稷群體分子變異方差分析

3　討論

目前，關(guān)于其他植物多倍體的遺傳多樣性研究有較多報(bào)道，所得到結(jié)果基本呈兩種分化，一種為倍性材料DNA水平間沒有明顯的差異[22-23]；而另一種為在倍性材料間發(fā)現(xiàn)了明顯的基因差異[24-25]。根據(jù)柳枝稷材料間遺傳關(guān)系的聚類圖來看(圖3，4，5)，各材料的聚類分布與其倍性間沒有存在明顯的差異。本研究中EST-SSR和IT-ISJ標(biāo)記在柳枝稷Alamo兩倍性間，四倍體Alamo相應(yīng)各遺傳參數(shù)(Na、Ne、H和I)多數(shù)略高于八倍體Alamo(表3，4，5)，根據(jù)相關(guān)柳枝稷倍性的研究表明，柳枝稷兩個(gè)生態(tài)型之間遺傳差異不大，但四倍體具有較高水平的多態(tài)性，且具有異位顯性基因和互補(bǔ)的基因作用，通常將四倍體作為雜種優(yōu)勢(shì)群體[26]。Brunken等[27]的研究表明，整倍體倍性變異和非整倍體倍性變異能夠增加位點(diǎn)的等位基因數(shù)，但這種情況在等位頻率極低的條件下不會(huì)發(fā)生或者可能發(fā)生，這與群體內(nèi)染色體數(shù)目變異的狀況一致。本試驗(yàn)所得結(jié)果與之基本相似，分析導(dǎo)致這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因：其一，可能由于本實(shí)驗(yàn)中八倍體Alamo是由四倍體Alamo經(jīng)過秋水仙素人工加倍而來，所以基因組總體差異不大，但是在秋水仙素誘變過程中的影響可能導(dǎo)致兩群體間產(chǎn)生差異[28]；其二，通過基因加倍后，八倍體在某些基因位點(diǎn)經(jīng)過基因重復(fù)后某些特異性條帶變成了非特異性條帶，基因更趨于穩(wěn)定，從而減少了八倍體的多態(tài)性。柳枝稷有低地型和高地型兩種生態(tài)型，其中低地型為四倍體，植株高大生物產(chǎn)量高；高地型多為八倍體，抗寒能力強(qiáng)[29]。采用雜交育種方式聚合兩種生態(tài)型一直是育種家致力于解決的問題，但兩種倍性間雜交相對(duì)較難，低地型八倍體的創(chuàng)制及遺傳多樣性的信息可為兩種生態(tài)型雜交育種提供寶貴的物質(zhì)和數(shù)據(jù)支撐。

本試驗(yàn)采用的兩個(gè)分子標(biāo)記分別從12對(duì)EST-SSR和15對(duì)IT-ISJ引物中擴(kuò)增出245和165條清晰可辨條帶(TNB)，分子標(biāo)記檢測(cè)效率的評(píng)價(jià)指標(biāo)很多，目前廣泛應(yīng)用的有MI、PIC、DI、EMR等[30]。本研究對(duì)EST-SSR和IT-ISJ的PPB、PIC、EMR、MI指標(biāo)進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，對(duì)于EST-SSR和IT-ISJ來說，都能產(chǎn)生各自有效的多態(tài)性條帶，但多態(tài)性水平及檢測(cè)效率各不相同。EST-SSR的基本重復(fù)單元是由幾十個(gè)核苷酸組成的，重復(fù)次數(shù)一般為10～50，同一類微衛(wèi)星DNA可分布在基因組的不同位置上[19]，基因組中EST-SSR多態(tài)性較高，并且等位基因數(shù)目多，呈共顯性遺傳，所以可提供的多態(tài)性信息量較高，結(jié)果穩(wěn)定可靠[20]，因此，被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性研究。隨著EST-SSR標(biāo)記位點(diǎn)在圖譜上的豐富，它以高度的多態(tài)性信息量和PCR技術(shù)的方便性使其表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。IT-ISJ作為一種新興的分子標(biāo)記方式，在技術(shù)上可能略顯不成熟，還需要進(jìn)一步完善。IT-ISJ作為一種新型的DNA分子標(biāo)記，迄今尚未在能源草上應(yīng)用，本研究探討了其在柳枝稷上的應(yīng)用效果?，F(xiàn)今報(bào)道的植物遺傳多樣性相關(guān)研究多是單一分子標(biāo)記鑒定的結(jié)果，本研究運(yùn)用EST-SSR和IT-ISJ標(biāo)記技術(shù)同時(shí)對(duì)柳枝稷遺傳多樣性進(jìn)行了分析，不僅驗(yàn)證了兩種分子標(biāo)記的可行性，還對(duì)比了柳枝稷不同倍性間的遺傳多樣性差異。試驗(yàn)表明，EST-SSR和IT-ISJ標(biāo)記對(duì)柳枝稷同一群體多樣性的評(píng)價(jià)存在一定的差異，四倍體Alamo和八倍體Alamo沒有明顯的遺傳分化，但四倍體Alamo的遺傳多樣性高于八倍體Alamo。本試驗(yàn)結(jié)果可為柳枝稷種質(zhì)資源的開發(fā)利用、遺傳變異等方面的研究提供一定的參考。

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Genetic diversity assessment of tetraploid and octoploid switchgrass using EST-SSR and IT-ISJ molecular markers

ZHONG Ming**, ZHOU Si-Fan**, ZHANG Xin-Quan, HUANG Xiu, YAN Hai-Dong, ZHANG Ai-Ling, LUO-Qian, HUANG Lin-Kai*

Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China

Switchgrass is an important bioenergy plant. In this study, the genetic diversity of 65 samples of tetraploid Alamo and mutated octoploid Alamo (using colchicine) was assessed using expressed sequence tag-simple sequence repeat (EST-SSR) and intron-targeted intron-exon splice junction (IT-ISJ) markers. The results showed that EST-SSR primers amplified 245 fragments; the percentage of polymorphic loci was 99.59%, the number of alleles (Na) was 1.9878, the effective number of alleles (Ne) was 1.1718, Nei’s gene diversity (H) was 0.1308, and Shannon’s information index (I) was 0.2388. These genetic parameters for the tetraploid Alamo were as follows: 226 fragments; 88.93% polymorphic loci; Na, 1.8816; Ne, 1.1823; H, 0.1349; and I, 0.2398. These values were higher than those obtained for octoploid Alamo: 217 fragments; 92.24% polymorphic loci; Na, 1.9184; Ne, 1.1652; H, 0.1228; and I, 0.2234. The IT-ISJ primers amplified 165 fragments and the percentage of polymorphic loci was 96.36%, Na was 1.9878, Ne was 1.5777, H was 0.3354, and I was 0.4999. These parameters for tetraploid Alamo were as follows: 145 fragments; 94.55% polymorphic loci; Na, 1.9333; Ne, 1.6366; H, 0.3602; and I, 0.5280. These values were higher than those obtained for octoploid Alamo: 139 fragments; 84.24% polymorphic loci; Na, 1.7515; Ne, 1.4337; H, 0.2573; and I, 0.3864. A clustering analysis with the unweighted pair-group method with arithmetic means did not clearly separate 68 samples of tetraploid Alamo and octoploid Alamo, which had a low level of genetic differentiation. An analysis of molecular variance showed that 94.78% and 80.76% of genetic diversity occurred within ploidy levels, while 5.22% and 19.24% of genetic diversity occurred between ploidy levels.

switchgrass (Panicumvirgatum); EST-SSR (expressed sequence tag-simple sequence repeat); IT-ISJ (intron targeted intron-exon splice junction); Alamo; molecular marker; genetic diversity

10.11686/cyxb2015554

2015-12-07；改回日期：2016-01-26

科技部“十二五”863計(jì)劃(2012AA101801-2)和國家自然基金(31201845)資助。

鐘鳴(1987-)，女，四川富順人，碩士。E-mail：zmzl7758@163.com。周思凡(1993-)，女，重慶人，在讀碩士。E-mail：swanchou93@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

Corresponding author. E-mail：huanglingkai@sicau.edu.cn

http://cyxb.lzu.edu.cn

鐘鳴, 周思凡, 張新全, 黃秀, 嚴(yán)海東, 張愛玲，羅茜，黃琳凱. 利用EST-SSR、IT-ISJ分子標(biāo)記研究四倍體與八倍體柳枝稷的遺傳多樣性. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(10): 113-123.

ZHONG Ming, ZHOU Si-Fan, ZHANG Xin-Quan, HUANG Xiu, YAN Hai-Dong, ZHANG Ai-Ling, LUO-Qian, HUANG Lin-Kai. Genetic diversity assessment of tetraploid and octoploid switchgrass using EST-SSR and IT-ISJ molecular markers. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(10): 113-123.