尹　鵬，于　倩*，李　忻，孫　巖，陳　雪，王恩鵬

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長春 130033；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

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HPLC法測定酵母菌細(xì)胞內(nèi)維生素B1含量

尹鵬1，于倩1*，李忻1，孫巖2，陳雪2，王恩鵬2

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長春 130033；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

目的建立酵母菌細(xì)胞內(nèi)維生素B1的含量測定方法。方法采用Thermo DBS-C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為水-甲醇(70∶30)，流速1.2 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長為238 nm。結(jié)果維生素B1在濃度1.0～5.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(Y=294 400.5X-65 837.9，r=0.997 9)，方法回收率為88%～92%，重現(xiàn)性在RSD=0.8%～1.24%(n=5)。結(jié)論本測定方法準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好，可用于測定酵母菌細(xì)胞內(nèi)維生素B1含量。

酵母菌；維生素B1；HPLC

酵母是一種可食用的、營養(yǎng)豐富的單細(xì)胞微生物，含有較多的蛋白質(zhì)(占細(xì)胞干重的40%～60%)，消化吸收率很高，酵母蛋白質(zhì)中富含人體必需的8種氨基酸，特別是谷物中含量較少的賴氨酸含量較高[1-3]。酵母中氨基酸的組成比例接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)推薦的理想氨基酸組成，由于酵母菌體中富含維生素B1,其含量高于某些蔬菜、水果、雞蛋、魚、肉，且含有海藻糖、輔酶A等特殊療效物質(zhì)，而近年來新興開發(fā)的一些食用酵母可在人體內(nèi)很快被吸收與利用，所以研究酵母菌體內(nèi)維生素B1有很大的經(jīng)濟價值與應(yīng)用前景[4-6]。維生素 B1的測定方法已有很多報道,如熒光目測法、熒光計法、紫外分光光度法及偶氮染料比色法等，然而這些方法大多數(shù)耗費時間長，操作繁瑣，不確定因素較多[7-9]。因此本文采用HPLC法對酵母菌細(xì)胞內(nèi)維生素B1含量進(jìn)行測定，為研究酵母菌體內(nèi)維生素B1含量測定方法提供了依據(jù)。

1　實驗材料

菌種實驗采用了酵母TY-3，本實驗室保存菌種。試劑維生素B1對照品，購于中國生物制品檢定所。蛋白胨(天津市化學(xué)試劑批發(fā)廠)，麥芽浸膏(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，處理瓊脂(北京化學(xué)試劑公司)，甲醇為色譜純(天津永大生物技術(shù)中心)，其他試劑為分析純(北京化工廠)。離心機LD5-2A(北京醫(yī)用離心機廠)，DL102型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市試驗儀器廠)，生化培養(yǎng)箱(生化培養(yǎng)箱)，電子天平JA12002(上海精科儀器廠)，SPD-10A高效液相色譜儀(日本島津公司)，TDA-8002型水浴鍋(天津中環(huán)實驗電爐有限公司)，TGL16 g高速臺式離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基(YEPD)、固體種子培養(yǎng)基，酵母固體基本培養(yǎng)基與文獻(xiàn)報道[10]一致。

2　實驗方法

2.1菌體培養(yǎng)150 mL三角瓶裝有50 mL種子培養(yǎng)基2.1.5(1)接斜面種子1-2環(huán)，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為1級種子液。然后在500 mL三角瓶中裝入100 mL YEPD，以10%的接種量接入1級種子液，30 ℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)。后離心(3 000 r/min，10 min)并用無菌水洗滌2次，收集菌體備用。2.2色譜條件色譜柱：Thermo DBS-C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：水-甲醇(70∶30)，流速1.2 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長：238 nm。

2.3供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取一定量酵母，加入0.1 mol/L HCl溶液，振蕩搖勻。121 ℃加熱30 min，3 000 r/min離心10 min后洗滌，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，備用，參照食品中硫胺素(VB1)的測定，GB/T5009.84-2003。

2.4對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精確稱取0.01 g維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品，先分別用少量三蒸水配制的0.01 mol鹽酸溶解，再分別定容至100 mL棕色容量瓶中，制成濃度為0.1 mg/mL的溶液。精確量取適量上述溶液，再分別稀釋制成0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 mg/mL的維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5加標(biāo)回收率實驗樣品制備取2個25 mL棕色容量瓶，分別移入相同體積的0.001 mg/mL維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液和作為空白對照的甲醇，并用酵母提取液稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)高效液相色譜檢測3次后計算其平均回收率。3次回收率實驗中選擇加入的0.001 mg/mL維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液體積分別為5.0、7.5、10.0 mL(即2、3、4 μg/mL)。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取2.4項下不同濃度1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL的對照品溶液各10 μL注入色譜儀測定，以維生素B1濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7加樣回收率試驗分別以3種不同的提取液和不同的添加量進(jìn)行了3次實驗，不同的提取液濃度分別為1.32、1.45、1.27 μg/mL為基底，對應(yīng)添加量為2、3、4 μg/mL的維生素B1對照品溶液，依照含量測定方法測定加樣回收率。

2.8重現(xiàn)性考察取酵母菌體，按2.3供試品溶液的制備項下方法操作，制備3種不同濃度的酵母提取液，分別重復(fù)進(jìn)樣5次，考察其重現(xiàn)性。

3　結(jié)果

3.1液相條件的確定對不同的流動相進(jìn)行了大量實驗，發(fā)現(xiàn)以甲醇和水的組合流動相效果相對較好，通過進(jìn)一步實驗確定甲醇和水最優(yōu)配比為V甲醇∶V水=30∶70，并確定流速1.0 mL/min。

3.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按2.6項下方法操作，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)作圖，得1條近似過原點的直線，回歸方程為Y=294 400.5X-65 837.9，r=0.999 5，表明維生素B1的標(biāo)準(zhǔn)品在濃度1.0～5.0 μg/mL之間，進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

3.3回收率試驗按照2.7項下方法操作測定回收率，得出3次實驗的加樣回收率范圍在(88.7%～92%)，結(jié)果見表1，與文獻(xiàn)報道[11]結(jié)果一致，說明本方法的測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1　維生素B1提取液中添加不同量維生素B1的回收率

3.4重現(xiàn)性實驗按照2.8項下方法操作，其重現(xiàn)性結(jié)果范圍在RSD=0.8%～1.24%，表明維生素B1的含量以本法測定維生素B1含量的重復(fù)性良好。

4　小結(jié)

本實驗在分離度上、精密度以及重現(xiàn)性上都有著較好的表征，測定酵母菌體內(nèi)維生素B1含量的方法是否準(zhǔn)確、快捷必將對后面實驗結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性帶來直接的影響。因此研究快速準(zhǔn)確的維生素B1檢測技術(shù)是十分必要的。目前用于檢測提取液維生素B1含量的方法主要有分光光度法和高效液相色譜法。分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來測定其含量的一項技術(shù)，雖然設(shè)備、操作簡單，但受所測溶液體系內(nèi)其他成分的影響比較明顯，測定結(jié)果誤差較大。高效液相色譜法其在適用范圍、分析速度、分離效能、檢測靈敏度和操作自動化方面都達(dá)到了分光光度計無法企及的程度。為測定酵母菌細(xì)胞內(nèi)維生素B1含量提供了重要依據(jù)。

[1]WILLS R H.Analysis of water soluble vitamins by high pressure liquid chromatography[J].Journal of Chromatographic Science,1997(15):262-266.

[2]金鵬飛,夏路風(fēng),李錚,等.高效液相色譜同時測定多維元素片中的維生素B1,維生素B6,維生素C,煙酰胺和泛酸[J].藥物分析雜志,2012,32(9):1606-1609.

[3]羅曼.HPLC法測定燕泰膠囊中維生素B1和維生素B6的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2005,6(2):16-18.

[4]A.H.恩斯明格.美國《食物與營養(yǎng)百科全書》選輯(4)營養(yǎng)素[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1989.

[5]KEAGY P M,BORENSTEIN B,RANUM P,et al.Natural levels of nutrients in commercially milled wheat flours,II,vitamin analysis[J].Cereal Chemistry,1980(57):59-65.

[6]KAMMAN J F.Kinetics of thiamin and riboflavin loss in paste during processingand storage under steady state and unsteady state conditions of temperature andwater activity[J].Dissertation Abstracts Intemational,1981(4):2543.

[7]段秀萍,楊玉紅.用偏最小二乘紫外光譜法同時測定維生素B混合物[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2002(4):20-24.

[8]郭亞東,馬銀海,李燕華,等.維生素B1、B2含量測定方法比較[J].食品科學(xué),2004(6):153-156.

[9]TAN Hongliang,LI Qian,ZHOU Zhengchen,et al.A sensitive fluorescent assay for thiamine based on metal-organic frameworks with intrinsic peroxidase-like activity[J].Analytica Chimica Acta,2015(856):90-95.

[10]杜連祥,路福平.微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2005.

[11]朱明華.儀器分析[M].4版.北京:高等教育出版社,2008.

Determination of vitamin B1in yeast cells by HPLC

YIN Peng1,YU Qian1*,LI Xin1,SUN Yan2,CHEN Xue2,WANG Enpeng2

(1.China-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun 130033,China;2.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo establish the determination method of vitamin B1in yeast cells.MethodsThe analytical column was Thermo DBS-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)with a mobile phase consisting of water methanol (70∶30) as mobile phase at a flow rate of l.2mL/min,the column temperature was 35 ℃ and UV detection was set at 238 nm.ResultsThe linear range of thiamine was 1.0-5.0 μg/mL (Y=294 400.5X-65 837.9,r= 0.997 9),the method recovery rate rang was 88%-92% with RSD of 0.8%-1.24%(n=5).ConclusionThe method is accurate,reliable and repeatable which can be used to detect vitamin B1in yeast cells.

yeast;Vitamin B1;HPLC

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.012

吉林省教育廳項目(20150344)；長春市科技局重大科技攻關(guān)項目(14KG057)。

尹鵬(1987-)，男，大學(xué)本科，藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究。

于倩，女，博士，主任藥師，電話-13664419002，電子信箱-819389186@qq.com

R284.3

A

2095-6258(2016)05-0914-03

2016-03-15)