劉曉巖，劉美玉，卞宏生，李廷利

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理教研室，哈爾濱 150040)

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酸棗仁皂苷A對(duì)果蠅睡眠影響的量效關(guān)系與時(shí)效關(guān)系研究

劉曉巖，劉美玉，卞宏生，李廷利*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理教研室，哈爾濱 150040)

目的研究酸棗仁皂苷A對(duì)野生型CS品系果蠅睡眠作用影響的量效關(guān)系與時(shí)效關(guān)系。方法選擇野生型CS品系7 d齡雄性果蠅為研究對(duì)象,采用液體給藥的方式，利用果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，觀察不同濃度酸棗仁皂苷A對(duì)果蠅睡眠影響的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。結(jié)果1 mg/mL劑量為最佳給藥濃度，給藥3 d為最佳給藥時(shí)間，并可以明顯延長(zhǎng)果蠅白天平均睡眠的總時(shí)間和夜晚平均睡眠的總時(shí)間，增強(qiáng)果蠅的片段化睡眠。結(jié)論酸棗仁皂苷A對(duì)野生型CS品系7 d齡雄果蠅的睡眠具有一定的改善作用。

酸棗仁皂苷A；果蠅；睡眠

酸棗仁是鼠李科棗屬植物酸棗的干燥成熟種子[1],具有補(bǔ)肝、寧心、斂汗、生津的功效。主治虛煩不眠、驚悸多夢(mèng)、體虛多汗、津傷口渴等癥。酸棗仁的化學(xué)成分比較多[2-4]，目前已從酸棗仁中分離得到達(dá)瑪烷型三萜皂苷、三萜類化合物、黃酮類化合物、生物堿、脂肪油和各種維生素等活性化學(xué)成分，并有研究確定酸棗仁皂苷元有鎮(zhèn)靜催眠作用，酸棗仁皂苷A是酸棗仁中含量較高的有效成分之一。目前對(duì)此單體物質(zhì)的藥理、毒理、構(gòu)效關(guān)系、量效關(guān)系、譜效關(guān)系及臨床的研究還很少。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophila melnogaster)(由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供) 飼養(yǎng)于自動(dòng)定時(shí)光控系統(tǒng)。實(shí)行每天12 h∶12 h的明暗光照周期處理，溫度(24±1)℃，相對(duì)濕度50%～60%，光照強(qiáng)度為400 lux[5-6]。

1.2藥物與試劑酸棗仁皂苷A，外觀為白色結(jié)晶粉末，HPLC≥98.60%，批號(hào)：MUST-15020411(成都曼思特生物科技有限公司中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所)。蔗糖(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140111)；瓊脂(細(xì)菌學(xué)級(jí)，產(chǎn)地日本，批號(hào)：201501)；酵母粉(食品級(jí)，安琪酵母股份有限公司，批號(hào)：20150512)；玉米粉(食品級(jí))。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器果蠅雌雄分離裝置(自制)果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(DAMS，USA.)；二氧化碳麻醉裝置(自制)；鑷子、毛筆、果蠅培養(yǎng)指管、脫脂棉。

2　方法

2.1培養(yǎng)基的配制

2.1.1果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制(用于果蠅的飼養(yǎng))[7-8]準(zhǔn)確量取蔗糖(31 g)、瓊脂(3 g)和蒸餾水(300 mL)，三者充分混勻攪拌，加熱煮沸至瓊脂完全熔化，形成A液體；準(zhǔn)確量取玉米粉(42 g)與蒸餾水(160 mL)，兩者充分混勻攪拌，形成B液體；將A液體和B液體充分混勻，并不斷攪拌，煮沸至糊狀，停止加熱；待A、B糊狀混合液溫度降至60～70 ℃，加入酵母粉(3 g)，充分?jǐn)嚢韬?，加入丙?3 mL)，攪拌均勻，立即分裝于潔凈的培養(yǎng)指管中，每管培養(yǎng)基厚度為1.5～2 cm，待培養(yǎng)基完全凝固后，將培養(yǎng)管倒置于操作室內(nèi)，待完全冷卻凝固后即可使用。

2.1.2果蠅液體培養(yǎng)基配制(用于空白組)[9]準(zhǔn)確量取2.5 g的蔗糖，置于50 mL燒杯內(nèi)，加入50 mL的蒸餾水，不斷攪拌使其溶解均勻。用移液管移入10 mL容量瓶中定容，充分搖勻后備用(用于實(shí)驗(yàn)空白組)。

2.1.3果蠅含藥培養(yǎng)基配制(用于給藥組)[10-12]首先配制5%的蔗糖溶液待用，準(zhǔn)確量取酸棗仁皂苷A 2.5、5、10、20、40 mg，分別置于50 mL燒杯內(nèi)，分別加入10 mL的5%的蔗糖溶液，移入10 mL容量瓶中定容，配制成不同劑量的溶液，分別為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL，搖勻混合后備用。

2.2量效關(guān)系研究方法選擇7 d齡雄性果蠅為研究對(duì)象，收集12 h內(nèi)剛羽化未交配的雄性果蠅，飼養(yǎng)6 d后，分為空白組和不同劑量給藥組，每組32只，將果蠅移入監(jiān)測(cè)管中，適應(yīng)6 h，啟動(dòng)DAMS，記錄早7∶00到次日早7∶00果蠅24 h睡眠活動(dòng)時(shí)間。

2.3時(shí)效關(guān)系研究方法選擇7 d齡雄性果蠅為研究對(duì)象，收集12 h內(nèi)剛羽化未交配的雄性果蠅，飼養(yǎng)6 d后，給予量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)中最佳劑量，按照不同給藥天數(shù)分組，每組32只，將果蠅移入監(jiān)測(cè)管中，適應(yīng)6 h，啟動(dòng)DAMS，記錄早7∶00到次日早7∶00果蠅24 h睡眠活動(dòng)時(shí)間。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理通過(guò)EXCEL軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，2組以上比較時(shí)采用單因素方差分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用LSD法進(jìn)行兩兩比較；2組間比較時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1酸棗仁皂苷A對(duì)果蠅鎮(zhèn)靜催眠作用的量效關(guān)系見(jiàn)表1。

表1　酸棗仁皂苷A對(duì)雄果蠅睡眠影響的量效關(guān)系±s)

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.2酸棗仁皂苷A對(duì)果蠅鎮(zhèn)靜催眠作用的時(shí)效關(guān)系見(jiàn)表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥2 d后，果蠅的全體平均睡眠時(shí)間延長(zhǎng)，白天睡眠時(shí)間沒(méi)有顯著性差異，而夜晚睡眠時(shí)間有顯著性差異。給藥3 d后，果蠅的白天和夜晚平均睡眠時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，均有極顯著性差異，P<0.01。給藥4 d后，果蠅的睡眠時(shí)間均縮短。故確定最佳的給藥天數(shù)為3 d。

表2　酸棗仁皂苷A對(duì)雄果蠅睡眠影響的時(shí)效關(guān)系±s)

注：與空白組比較，#P<0.05,##P<0.01

4　小結(jié)

通過(guò)果蠅的預(yù)實(shí)驗(yàn)的前期工作,選擇了7 d齡果蠅作為觀察對(duì)象，并設(shè)計(jì)了5個(gè)酸棗仁皂苷A的給藥濃度，以監(jiān)測(cè)管內(nèi)液體給藥的方式進(jìn)行酸棗仁皂苷A對(duì)果蠅睡眠影響作用的量效關(guān)系研究，擺脫了培養(yǎng)基給藥定量不準(zhǔn)確的困擾，探索酸棗仁皂苷A對(duì)果蠅睡眠影響的最佳給藥劑量。并能通過(guò)睡眠覺(jué)醒的節(jié)律圖得到酸棗仁皂苷A對(duì)果蠅白天和夜晚睡眠片段化睡眠增強(qiáng)的影響[13-14],睡眠是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程[15]，前期研究證實(shí)，果蠅也有類似哺乳動(dòng)物的睡眠樣狀態(tài)[16-17]，而果蠅一直都是基因研究領(lǐng)域最重要的模式生物之一，有著繁殖快，易于操作，基因明確的優(yōu)勢(shì)，為后續(xù)利用分子生物學(xué)知識(shí)探求睡眠的機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

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Dose-effect and time-effect of Jujuboside A in drosophila sleep

LIU Xiaoyan,LIU Meiyu,BIAN Hongsheng,LI Tingli*

(Traditional Chinese Medicine Pharmacology Teaching and Research Section,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

ObjectiveTo study the dose-effect and time-effect of Jujuboside A in drosophila sleep.MethodsThe 7-day-old male drosophila as the research object,with the method of liquid dosage,using drosophila activity monitoring system,observe the different concentration of Jujuboside A in drosophila a sleep affects the dose-effect and time-effect.ResultsThe dose of 1 mg/mL the best drug concentration,3 days as the best delivery time,and can obviously prolong drosophila,on average,the total time of sleep during the day and night,on average,the total time of sleep.Enhance the drosophila with fragmented sleep.ConclusionJujuboside A can improve the 7-day-old male drosophilas sleep time

Juiuboside A;drosophila;sleep

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.009

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃”基金資助項(xiàng)目(2012RCL03)。

劉曉巖(1985-)，女，博士，講師，主要從事天然藥物生物活性與方法作用機(jī)理研究。

李廷利，博士，教授，電話-13804527211，電子信箱-ltlhlj@126.com

R285.5

A

2095-6258(2016)05-0905-03

2015-12-08)