李俊輝，劉青云，，杜曉東，，鄧岳文，，王慶恒，

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧530021）

馬氏珠母貝養(yǎng)殖群體早期生長(zhǎng)階段的遺傳多樣性與有效親本數(shù)量估計(jì)

李俊輝1，劉青云1，3，杜曉東1，2，鄧岳文1，2，王慶恒1，2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧530021）

從大亞灣野生群體選擇親本繁育1個(gè)養(yǎng)殖群體，受精第6天、23天與80天分別進(jìn)行優(yōu)選，按50%選留比率選留快生長(zhǎng)個(gè)體，分別在受精后第3天、30天120天取樣，利用8對(duì)SSR標(biāo)記分析養(yǎng)殖群體遺傳多樣性與估計(jì)有效親本數(shù)量。結(jié)果表明，在3個(gè)生長(zhǎng)階段每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)分別為3.750、3.875和3.625，平均觀察雜合度分別為0.324 2、0.527 3和0.372 4，平均期望雜合度分別為0.551 1、0.561 3和0.504 8。有效親本數(shù)量的估計(jì)分別為38、28和30，3個(gè)生長(zhǎng)階段估算的有效親本數(shù)量均比實(shí)際所用到的親本數(shù)量少。選優(yōu)管養(yǎng)措施導(dǎo)致養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與有效親本數(shù)量降低。

馬氏珠母貝；遺傳多樣性；有效群體數(shù)量；SSR標(biāo)記

有效群體數(shù)量是指群體內(nèi)所具有的相當(dāng)于理想群體（含量在世代間保持恒定、群體內(nèi)隨機(jī)交配、無世代重疊、無其它遺傳效應(yīng)影響的群體）繁殖個(gè)體的數(shù)目［1-2］。目前，有效群體數(shù)量是具有相同遺傳變異損失速率和近親繁殖速率的理想種群大小，即真實(shí)種群的有效種群大小。苗種培育過程中，如果親本數(shù)量偏少，導(dǎo)致子代群體的有效群體數(shù)量減少，因多代累積導(dǎo)致的近交效應(yīng)，致使子代養(yǎng)殖的性狀退化。對(duì)于懷卵量高的養(yǎng)殖動(dòng)物，在育苗過程中若常使用較少數(shù)量親本繁育苗種，并且使用性別比例不平衡的親本等，將引起對(duì)子代群體的有效親本及遺傳多樣性的不利影響，這已經(jīng)在很多水產(chǎn)養(yǎng)殖物種的研究中得到了證明［3-4］。此外，高產(chǎn)卵量的養(yǎng)殖動(dòng)物早期發(fā)育過程中死亡率也會(huì)較高，這樣也會(huì)導(dǎo)致子代群體的有效親本數(shù)量出現(xiàn)明顯的變化［5］。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類，主要用于培育海水有核珍珠。近幾年馬氏珠母貝珍珠產(chǎn)量與質(zhì)量均明顯下滑，主要原因在于養(yǎng)殖群體生長(zhǎng)與育珠性狀退化與海區(qū)環(huán)境的污染，其中養(yǎng)殖群體生長(zhǎng)與育珠性狀退化可能與其遺傳多樣性的降低有關(guān)。由于成熟的馬氏珠母貝雌性個(gè)體的產(chǎn)卵量高，為節(jié)約成本，在育苗過程中常利用少數(shù)量親本繁育子代群體，由此因少數(shù)量親本引起的瓶頸效應(yīng)導(dǎo)致養(yǎng)殖群體遺傳多樣性降低，同時(shí)，在幼體培育與海區(qū)養(yǎng)殖過程中常進(jìn)行多次選優(yōu)淘汰生長(zhǎng)較慢的個(gè)體，這種管養(yǎng)措施對(duì)馬氏珠母貝的養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性有什么影響？本論文通過建立1個(gè)養(yǎng)殖群體，在幼體期、變態(tài)期與稚貝期分別進(jìn)行選優(yōu)，利用SSR標(biāo)記分析選優(yōu)管養(yǎng)措施對(duì)養(yǎng)殖群體遺傳多樣性與有效親本數(shù)量的影響，以期望為遺傳育種提供參考。

1　材料與方法

1.1養(yǎng)殖群體繁育與取樣

2009年5月從大亞灣收集野生馬氏珠母貝群體，運(yùn)回湛江承梧海區(qū)養(yǎng)殖。2012年4月，挑選性腺成熟的個(gè)體作為繁育親本，其中雌、雄親本分別為30、20只，解剖性腺，人工授精。在幼體期（第6天）、變態(tài)期（第23天）與稚貝期（第80天）分別進(jìn)行選優(yōu)，選留生長(zhǎng)最快的個(gè)體，每次優(yōu)選比例均約為50%，按照生產(chǎn)常見技術(shù)進(jìn)行幼體培育與稚貝海區(qū)養(yǎng)殖。

在幼體期、變態(tài)附著期與稚貝期共3個(gè)生長(zhǎng)階段進(jìn)行取樣，取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)為受精后第3、30和120天，利用75%（φ）酒精溶液固定樣品，4℃保存。

1.2DNA提取以及SSR分析

參照文獻(xiàn)［6］利用吐溫法提取第3天的樣品DNA，對(duì)第30天的樣品先將其外殼剝離，再用吐溫法進(jìn)行DNA的提取，兩個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)樣品數(shù)量均為96個(gè)。吐溫法提取 DNA的過程：在 1.5 mL離心管加入15μL裂解液（10 mmol Tris-HCl，50 mmol KCl，0.5%Tween-20，0.3 mg/mL蛋白酶K，pH=8.0），輕微離心；在55℃恒溫裂解3h，85℃15min滅活蛋白酶K；3000r/min離心5min，保留上清液備用。

稚貝 DNA的提取采用上海生工生物工程公司的Universal Genomic DNA Mini-Isolation Kit，參照試劑盒說明書進(jìn)行，樣品數(shù)量均為96個(gè)。

選用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的8對(duì)SSR引物，引物的詳細(xì)信息見表 1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件見劉青云（2013）［7］，具體如下：PCR反應(yīng)體系15 μL，包括：DNA 2μL，10×PCR buffer（10 mM）1.5μL，dNTPs（4 mM）1μL，MgCl2（2.5 mM）1.5μL，Taq polymerse（2.5u/mol）1μL，引物1μL，ddH2O 7μL，然后根據(jù)各對(duì)引物條件的不同進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性42 s，相應(yīng)退火溫度下退火50 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Popgene32計(jì)算等位基因頻率、有效等位基因數(shù)（ne）、等位基因數(shù)（na）、觀察雜合度（Ho）以及期望雜合度（He）；根據(jù)各位點(diǎn)的等位基因頻率通過PIC-CALC進(jìn)行計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）。

利用COLONY2.0軟件的同胞重建法估算3個(gè)不同生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖群體的有效親本數(shù)量。COLONY的原理是根據(jù)孟德爾遺傳法則運(yùn)用最大似然法將子代劃分為全同胞和半同胞，并推斷親本的基因型。根據(jù)公式ΔF=1/2Ne計(jì)算近交率。

2　結(jié)果與分析

2.13個(gè)生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖群體遺傳多樣性

利用8對(duì)SSR引物對(duì)3個(gè)生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，在第3、30和120天分別檢測(cè)到30、31和29等位基因。各生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖群體各位點(diǎn)等位基因頻率見表 2。不同取樣點(diǎn)3M-10位點(diǎn)的擴(kuò)增圖譜見圖1。

表1　微衛(wèi)星引物序列及退火溫度Table 1　Primer sequence and annealing temperature of microsatellite DNA

表2　不同生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖群體各位點(diǎn)等位基因頻率Table 2　Allele frequency in the loci in the stock of pearl oyster Pinctada fucata martensii at three different growth stages

3個(gè)生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖群體的平均觀察雜合度分別為 0.3242、0.5273與 0.3724，期望雜合度分別為0.5511、0.5613與0.5048；3個(gè)階段養(yǎng)殖群體平均多態(tài)信息含量分別為0.4770、0.4846與0.4445。

表3　馬氏珠母貝養(yǎng)殖群體3個(gè)生長(zhǎng)階段遺傳多樣性的比較Table 3　Genetic variability of the stock of pearl oyster Pinctada fucata martensii at three different growth stages

圖1　3PM-10引物在第120天樣品的擴(kuò)增圖譜Fig.1　The silver staining PAGE image of locus 3PM-10 amplified by the samples at days 120 after fertilization

2.2養(yǎng)殖群體3個(gè)生長(zhǎng)階段有效親本數(shù)量估計(jì)

根據(jù)8個(gè)SSR位點(diǎn)在3個(gè)生長(zhǎng)階段各96個(gè)個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)，進(jìn)行同胞重建的分析；將第3天的樣品劃分為 25對(duì)全同胞，426對(duì)半同胞；將第30天樣品劃分為31對(duì)全同胞，594對(duì)半同胞；將第120天樣品劃分為16對(duì)全同胞，578對(duì)半同胞。有效親本數(shù)量在 3個(gè)生長(zhǎng)階段分別推算為 38、28和30，分別占實(shí)際親本比例為76%，56%和60%。根據(jù)公式ΔF=1/2Ne算出每個(gè)階段的近交率分別為0.013、0.018和0.017（表4）。

表4　馬氏珠母貝養(yǎng)殖群體3個(gè)生長(zhǎng)階段幼蟲的同胞重建信息Table 4　Sib identification in the stock of pearl oyster Pinctada fucata martensii at three different growth stages

3　討論

本研究中采用的SSR標(biāo)記均為多態(tài)性型標(biāo)記，在3個(gè)不同生長(zhǎng)階段都能檢測(cè)到較高的多態(tài)信息含量（PIC）。依據(jù)Botstein等［8］的研究，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，表示該位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)；當(dāng) 0.25＜PIC＜0.5時(shí)，表示該位點(diǎn)為中度多態(tài)性位點(diǎn)；當(dāng) PIC＜0.25時(shí)，表示該位點(diǎn)為低度多態(tài)性位點(diǎn)。在第1個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，8個(gè)SSR包含4個(gè)高度、3個(gè)中度與1個(gè)低度多態(tài)性位點(diǎn)；在第2個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，8個(gè)SSR位點(diǎn)包含5個(gè)高度與3個(gè)中度多態(tài)性位點(diǎn)；在第3個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，8個(gè)SSR位點(diǎn)包含中3個(gè)高度、4個(gè)中度與1個(gè)低度多態(tài)性位點(diǎn)；3 個(gè)階段養(yǎng)殖群體平均多態(tài)信息含量分別為 0.477 0、0.484 6與0.444 5（表3），表明本研究中所用的8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均包含較高的信息含量，多態(tài)性較好。

雜合度是評(píng)價(jià)遺傳多樣性常用指標(biāo)，若群體的雜合度越高，說明群體的遺傳多樣性越豐富?，F(xiàn)有研究表明，利用SSR標(biāo)記分析馬氏珠母貝野生群體與養(yǎng)殖群體的觀測(cè)雜合度為為0.15～0.72，期望雜合度為0.38～0.75［9-13］。例如，趙曉霞等［10］利用SSR標(biāo)記分析了利用不同數(shù)量親本繁育的4個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明這4個(gè)養(yǎng)殖群體的觀測(cè)雜合度為0.473 7～0.714 3，期望雜合度為0.527 9～0.592 6；王學(xué)穎等［12］利用SSR標(biāo)記馬氏珠母貝金黃殼色第3代選育群體與基礎(chǔ)群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明選育群體與基礎(chǔ)群體平均觀測(cè)雜合度分別為 0.411 9和 0.440 3，平均期望雜合度分別為 0.533 3 和0.546 4。本研究結(jié)果表明，3個(gè)不同生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖群體的觀測(cè)雜合度與期望雜合度分別為 0.324 3 ～0.527 3和0.504 8～0.561 3，與上述研究比較，本實(shí)驗(yàn)群體具有中等大小的遺傳多樣性。

本研究結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性出現(xiàn)了明顯變化。從第3天到第30天平均觀察雜合度從0.324 2增加到了0.527 3，這說明了到第 30天養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性有所提高，這個(gè)可能與生長(zhǎng)早期部分幼蟲具有引起適合度降低隱性基因有關(guān)，具有這些基因的個(gè)體容易死亡，從而使得第 30天養(yǎng)殖群體雜合個(gè)體數(shù)量所占的比例有所增加。關(guān)于純合致死現(xiàn)象已經(jīng)在其他貝類有過相關(guān)的報(bào)道［14］。

在親本的基因型信息未知情況下的家系分析中，基于分子標(biāo)記的同胞重建法獲得了廣泛的應(yīng)用［5，15］。在應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行有效親本數(shù)量估算時(shí)，為了提高準(zhǔn)確率，常使用很多種方法聯(lián)合估算，然而基于家系分析的對(duì)有效親本數(shù)量的估算被當(dāng)作是最準(zhǔn)確的一種方法［16-17］。本研究通過對(duì)馬氏珠母貝3個(gè)生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖群體進(jìn)行同胞重建分析，估算了馬氏珠母貝有效親本數(shù)量，第3天養(yǎng)殖群體有效親本數(shù)量為38個(gè)，占到實(shí)際親本數(shù)量的76%，親本數(shù)量已經(jīng)出現(xiàn)了明顯下降，第30天與120天養(yǎng)殖群體的有效親本數(shù)量分別為28和30，分別占實(shí)際親本數(shù)量的56%和60%。第3天養(yǎng)殖群體有效群體親本數(shù)量變小可能與人工繁殖所用到的親本性別比例不平衡有關(guān)，本研究中雌雄親本數(shù)量不等比例，分別為30與20；在第30天與120天養(yǎng)殖群體有效親本數(shù)量的減少可能是跟養(yǎng)殖方式有關(guān)，在幼體培育與稚貝培育過程中共進(jìn)行了3次選優(yōu)，即淘汰生長(zhǎng)緩慢的個(gè)體，留下快速生長(zhǎng)的個(gè)體。已有文獻(xiàn)報(bào)道了養(yǎng)殖過程中的優(yōu)選操作對(duì)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性的影響，并表明附著較慢的幼蟲對(duì)親本繁殖成功變異的縮小具有很重要的作用，因而那些在分級(jí)篩選中剔除掉的附著較慢的幼蟲使得親本繁殖成功出現(xiàn)偏差，從而對(duì)有效親本數(shù)量產(chǎn)生影響［18］。

群體選擇是貝類遺傳育種常見的技術(shù)手段，其核心問題是選育群體的有效親本數(shù)量。在群體選擇過程中，如果繁育子代群體的親本數(shù)量偏少，導(dǎo)致子代群體近交水平增加，影響選育進(jìn)展［19］。子代群體有效親本數(shù)量的影響因素包括產(chǎn)卵方式、性別比例與管養(yǎng)措施等方面。本研究結(jié)果表明，在苗種培育與海區(qū)養(yǎng)殖過程中選優(yōu)的管養(yǎng)模式會(huì)導(dǎo)致子代有效親本數(shù)量減少；同時(shí)，研究也表明利用SSR標(biāo)記能有效估計(jì)子代群體有效親本數(shù)量，這與筆者的前期結(jié)果［20］相一致。

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（責(zé)任編輯：陳莊）

Genetic Diversity and Effective Population Size Estimate in the Stock of Pearl Oyster Pinctada fucata martensii at Early Growth Stages

LI Jun-hui1，LIU Qing-yun1，3，DU Xiao-dong1，2，DENG Yue-wen1，2，WANG Qing-heng1，2
（1.Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.Pearl Breeding and Processing Engineering Technology Research Center of Guangdong Province，Zhanjiang 524088，China；3.Guangxi Academy of Fishery Sciences，Nanning 530021，China）

In this paper the effects of selection for faster growth on genetic diversity and effective population size in the stock of pearl oyster Pinctada fucata martensii is reported.In May of 2012，a stock was established by the breeders collected from Daya Bay wild population.The female and male breeder numbers were 30 and 20，respectively.Selection practices were performed at days 6，23 and 80 after fertilization.The selection percentage was 50% at each time.Animals were sampled at days 3，30 and 120 after fertilization.Genetic diversity and effective population size were analyzed by using eight SSR primer pairs.The results showed that the average numbers of alleles at each sampling time were 3.750，3.875 and 3.625，respectively.The average observed heterozygosities in the stock at each sampling time were 0.324 2，0.527 3 and 0.372 4，respectively.The average expected heterozygosities in the stock at each sampling time were 0.551 1，0.561 3 and 0.504 8，respectively.Effective population sizes at each sampling time were 38，28 and 30，respectively.A decrease in effective population size at each sampling time relative to the number of breeders used to develop the stock was detected.Thepresent results suggested that selection practices could result in decreases in genetic diversity and effective population size in the stock of pearl oyster P.fucata martensii.

Pinctada fucata martensii；Genetic diversity；Effective population size；SSR marker

S917.4

A

1673-9159（2016）04-00012-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.003

2016-03-31

廣東省海洋與漁業(yè)局科技專項(xiàng) （A201308A10，Z2014009） ；廣東省科技專項(xiàng)（2015A030302079）

李俊輝（1976—），女，講師，專業(yè)方向?yàn)闊o脊椎動(dòng)物增養(yǎng)殖。Email：lijunh@21cn.com

杜曉東（1962—），男，教授，專業(yè)方向?yàn)檎渲樨惢A(chǔ)生物學(xué)。Email：zjdxd@21cn.com