李　靜，龐歡瑛，簡(jiǎn)紀(jì)常，魯義善，湯菊芬，吳灶和

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東　湛江　524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江　524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東　湛江　524088；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東　廣州　510225）

溶藻弧菌III型分泌系統(tǒng)vscP基因的克隆與生物信息學(xué)分析

李靜1，2，3，龐歡瑛1，2，3，簡(jiǎn)紀(jì)常1，2，3，魯義善1，2，3，湯菊芬1，2，3，吳灶和2，3，4

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州510225）

根據(jù)NCBⅠ上登錄的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）全基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)克隆溶藻弧菌HY9901株ⅠⅠⅠ型分泌系統(tǒng)“分子尺”蛋白 VscP全長(zhǎng)基因的特異性引物，PCR擴(kuò)增獲得基因的全長(zhǎng)片段。結(jié)果顯示，vscP（GenBank登錄號(hào)FR780678）開(kāi)放閱讀框ORF為1 206 bp，共編碼401個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量約為44.4 ku，等電點(diǎn)為5.72。Signal 4.1 Server和TMHMM Server 2.0預(yù)測(cè)結(jié)果表明，VscP無(wú)信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)域。SoftBerry-Psite預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，VscP含有3個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，2個(gè)cAMP及cGMP依賴(lài)性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)酪蛋白激酶ⅠⅠ磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)，1個(gè)酰胺化位點(diǎn)和3個(gè)微體C末端靶信號(hào)位點(diǎn)。運(yùn)用MEGA6.0構(gòu)建的VscP系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，溶藻弧菌VscP與副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）聚為一簇。應(yīng)用SWⅠSS-MODEL軟件構(gòu)建VscP亞基三維結(jié)構(gòu)模型發(fā)現(xiàn)，其與鞭毛FilK蛋白有相似構(gòu)型。

溶藻弧菌；ⅠⅠⅠ型分泌系統(tǒng)；基因克??；生物信息學(xué)分析；vscP

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一種嗜鹽嗜溫型的革蘭陰性細(xì)菌，可引起魚(yú)、蝦、貝等養(yǎng)殖動(dòng)物鰭間組織潰爛、表皮出血、腎臟發(fā)白、肝胰臟腫大充血等病變［1］。隨著養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，溶藻弧菌引起的弧菌病時(shí)有暴發(fā)［2-4］，這與其產(chǎn)生的黏附因子、脂多糖、胞外產(chǎn)物、III型分泌系統(tǒng)、外毒素和載鐵體等毒力因子密切相關(guān)［5-8］。

III型分泌系統(tǒng)（Type 3 secretion system，T3SS）是一種接觸依賴(lài)性、宿主細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)運(yùn)毒力因子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，近年來(lái)已成為病原菌的研究熱點(diǎn)之一。溶藻弧菌通過(guò)T3SS主動(dòng)將效應(yīng)蛋白靶向輸送到宿主細(xì)胞，誘發(fā)宿主細(xì)胞快速凋亡或自我吞噬、細(xì)胞變圓和滲透性溶脹等病理變化［6-7］。T3SS注射裝置是養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌領(lǐng)域中的一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)之一，目前對(duì)溶藻弧菌T3SS蛋白已有少量研究，主要集中在其生物學(xué)功能和免疫功能上［9-10］，而該系統(tǒng)“針狀樣”注射裝置的內(nèi)腔通路尚未解釋清楚。T3SS注射裝置形成中空的針，從基座橫跨細(xì)菌內(nèi)外膜向胞外延伸并錨定于宿主，該針長(zhǎng)度受T3SS嚴(yán)密的調(diào)控，而VscP蛋白是控制針長(zhǎng)度的“分子尺”［11］。本研究通過(guò)克隆溶藻弧菌T3SS“分子尺”VscP蛋白，并對(duì)其序列特征、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以初步了解溶藻弧菌“分子尺”蛋白的表征，為進(jìn)一步研究“分子尺”蛋白的功能提供理論基礎(chǔ)，也為揭示溶藻弧菌T3SS注射裝置的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒溶藻弧菌強(qiáng)毒株 HY9901，分離自廣東省湛江海域患病的紅笛鯛魚(yú)，并保存于廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（下稱(chēng)“本實(shí)驗(yàn)室”） 。大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T克隆載體購(gòu)于大連TaKaRa生物有限公司。

1.1.2主要試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，ExTaq DNA聚合酶購(gòu)于大連TaKaRa生物有限公司，引物合成和DNA測(cè)序均由上海生物工程有限公司完成。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌總DNA 的提取溶藻弧菌HY9901按1∶100比例接種于TSB液體培養(yǎng)基，在28℃、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)12h以上。取適量菌液以轉(zhuǎn)速10 000r/min離心2min收集菌體，參照試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，- 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2vscP基因的克隆對(duì) GenBank上登錄的溶藻弧菌全基因序列（登錄號(hào) GU074526）設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物P1：ATGCGCATTACCCCAACA，下游引物P2：TCATAGGTCATTCTCCGCTT。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件為：95℃ 4min；95℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 1.5min，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取4μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。余下PCR產(chǎn)物按照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)純化。

1.2.3目的片段的連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序PCR純化產(chǎn)物與載體pMD-18T在16℃條件下水浴10h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定后陽(yáng)性克隆送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4生物信息學(xué)分析序列運(yùn)用不同的在線程序和軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析（表1）。

表1　生物信息學(xué)分析所需在線程序和軟件Table 1　Online program and software of bioinformatics analysis required

續(xù)表1（Continued）

2　結(jié) 果

2.1vscP基因的全長(zhǎng)克隆

PCR擴(kuò)增獲得一條約1 200 bp的特異性條帶（圖1）。測(cè)序顯示，vscP基因含有一個(gè)1 206 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），共編碼401個(gè)氨基酸（圖2）。將vscP基因提交至GeneBank，登錄號(hào)為FR780678。

圖1　vscP 基因的克隆Fig.1　Cloning of vscP gene

圖2　vscP基因核苷酸及其編碼的氨基酸序列Fig.2　vscP gene sequences and putative amino acid sequences

2.2vscP的理化性質(zhì)

用 ExPASy 軟件分析溶藻弧菌VscP 蛋白，結(jié)果顯示其原子總數(shù)為 6 232，分子式為C1906H3110N564O648S4。理論分子質(zhì)量為44.4232 ku，理論 pI 值為 5.72。不穩(wěn)定系數(shù) 52.97，脂肪系數(shù)為74.21，總平均親水性為- 0.941。酸性氨基酸殘基（Asp + Glu）總數(shù)為60個(gè)，堿性氨基酸（Arg + Lys）總數(shù)為50個(gè)，N端是甲硫氨酸（Met）。在酵母和大腸桿菌中表達(dá)的半衰期分別大于 20h 和 10h，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中體外培養(yǎng)表達(dá)的半衰期為 30h。

2.3序列分析

Signal 4.1 Server程序預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，VscP氨基酸序列的N端信號(hào)肽結(jié)構(gòu)無(wú)明顯的信號(hào)肽切割位點(diǎn)，不存在信號(hào)肽。TMHMM Server 2.0程序預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)VscP蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。利用SoftBerry-Psite程序預(yù)測(cè)顯示，VscP含有3個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，2個(gè)cAMP及cGMP依賴(lài)性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)，1個(gè)酰胺化位點(diǎn)和3個(gè)微體C末端靶信號(hào)位點(diǎn)。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示VscP位于細(xì)胞外。

2.4同源性及進(jìn)化分析

通過(guò)BLAST對(duì)溶藻弧菌HY9901強(qiáng)毒株VscP氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌VscP與弧菌屬其他物種同源性較高，其中與副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）氨基酸序列的同源性最高，達(dá)95%。多序列相似性比較表明，VscP在弧菌中是相對(duì)保守的，其高度保守區(qū)位于C-末端100多個(gè)氨基酸殘基（圖3）。

圖3　vscP基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性比較Fig.3　Multiple sequence alignments of vscP amino acid sequence with other vibrios

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，溶藻弧菌HY9901株III型分泌系統(tǒng)“分子尺”蛋白VscP與副溶血弧菌同聚一簇，表明它們?cè)谙鄳?yīng)系統(tǒng)的親緣關(guān)系較近（圖4），在進(jìn)化關(guān)系上極有可能源于同一個(gè)祖先。

圖4　基于NJ法構(gòu)建的vscP氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4　Phylogenetic trees of vscP constructed by neighbour-joining method

2.5功能結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

利用SMART 程序?qū)scP功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示VscP具有一個(gè)T3S4（第369～389氨基酸）結(jié)構(gòu)域（圖5：A）。SOPMA軟件對(duì)VscP進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，VscP的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為 α-螺旋占34.41%，無(wú)規(guī)則卷曲占43.64%，延伸鏈占15.46%，β-折疊占6.48%（圖5：B）。

圖5　VscP蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5　Predicting results of the domains and secondary structure of VscP

2.6VscP的亞基結(jié)構(gòu)

將VscP氨基酸序列提交至SWISS-MODEL程序，自動(dòng)搜索同源蛋白，選擇直系同源物FliK單亞基作為模板進(jìn)行同源建模，且獲得VscP單亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型，結(jié)果顯示，VscP的C-端100多個(gè)氨基酸殘基主要有2個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊（圖6：A），與其直系同源物FliK單亞基有相似的構(gòu)型（圖6：B）。

圖6　溶藻弧菌VscP（A）和鞭毛FilK（B）亞基三維結(jié)構(gòu)比較Fig.6　Solution structure of VscP from Vibrio alginolyticus Strain HY9901 （A） and flagellum FilK （B）

3　討 論

溶藻弧菌的 III型分泌系統(tǒng)通過(guò)一連續(xù)的分子通道（一橫跨細(xì)菌內(nèi)外膜的針狀樣蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)）將分泌的效應(yīng)蛋白直接從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主真核細(xì)胞，該系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)位蛋白具有相似結(jié)構(gòu)，如跨膜區(qū)段和卷曲螺旋區(qū)［12-13］。但本研究預(yù)測(cè)顯示，VscP蛋白不存在跨膜區(qū)，僅在C-端有兩個(gè)與鞭毛FliK相似的α-螺旋區(qū)。

不同細(xì)菌T3SS針狀毒力裝置均由唯一的分子標(biāo)尺來(lái)調(diào)控其針的長(zhǎng)度，如大腸桿菌的Orf6［14］、耶爾森氏菌（Yersinia）的 YscP［15］、假單胞菌（Pseudomonas）的PscP［16］、沙門(mén)氏菌（Salmonella）的 InvJ［17］和福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）的Spa32［18］。蛋白質(zhì)的N端無(wú)序多肽鏈連接著其C端球狀結(jié)構(gòu)稱(chēng)為“鎖鏈”架構(gòu)。Bergeron等［19］首次提出銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）“分子尺”P(pán)scP蛋白的“鎖鏈”架構(gòu)模型，本研究的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，VscP主要以 α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，此二級(jí)結(jié)構(gòu)亦可作為VscP具有類(lèi)似PscP蛋白“鎖鏈”架構(gòu)的佐證。Agrain等［11］指出，耶爾森氏菌“分子尺”蛋白的兩個(gè)獨(dú)立分泌信號(hào)分別位于蛋白的第1～35和97～137氨基酸殘基處。溶藻弧菌VscP二級(jí)結(jié)構(gòu)的N端無(wú)序多肽鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，預(yù)測(cè)其N(xiāo)端極可能存在與耶爾森氏菌“分子尺”蛋白功能相同的分泌信號(hào)，其位置未知。不同菌屬間的“分子尺”蛋白，其分泌信號(hào)的位置不同，而兩個(gè)分泌信號(hào)獨(dú)立執(zhí)行各自的功能，表明細(xì)菌中 III型分泌系統(tǒng)的“分子尺”蛋白是高度保守的。在注射裝置組裝的早期階段，耶爾森氏菌YscP的分泌信號(hào)被識(shí)別后，T3SS分泌YscP來(lái)調(diào)控針長(zhǎng)度［20］。本研究預(yù)測(cè)顯示，VscP位于細(xì)胞外，由此推測(cè)溶藻弧菌VscP的分泌信號(hào)先被識(shí)別，最后被分泌至胞外發(fā)揮其調(diào)控作用，但其分泌與調(diào)控機(jī)制尚未明。

學(xué)者多認(rèn)為 T3SS針狀樣注射裝置與鞭毛有共同的祖先，也有人認(rèn)為T(mén)3SS由鞭毛進(jìn)化而來(lái)［21-22］。VscP單亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型發(fā)現(xiàn)，其與鞭毛FliK單亞基有相似的構(gòu)型，該結(jié)果可為解釋 T3SS的起源提供重要線索?！胺肿映摺钡鞍拙哂蓄?lèi)似鞭毛FliK蛋白的底物特異性開(kāi)關(guān)（Type 3 Secretion Substrate Specificity Switch，T3S4），該開(kāi)關(guān)位于蛋白的C-端結(jié)構(gòu)域［11］。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，位于溶藻弧菌VscP 蛋白C-端的第369～389個(gè)氨基酸殘基為調(diào)控針長(zhǎng)度的T3S4，這與上述研究結(jié)果一致。研究表明，T3SS注射裝置中的“分子尺”蛋白與YscO相互作用可引起T3SS阻塞［23］，而YscP蛋白C-末端的T3S4結(jié)構(gòu)域可直接與YscO發(fā)生相互作用［24］。多序列相似性比較顯示，VscP的C-末端100多個(gè)氨基酸殘基在弧菌中高度保守，推測(cè)VscP蛋白的T3S4結(jié)構(gòu)域是揭示系統(tǒng)針狀樣裝置內(nèi)腔通路的關(guān)鍵。下一步研究將對(duì) VscP進(jìn)行分段基因缺失，對(duì)缺失株與野生株進(jìn)行分析，以期揭示潛在的“分子尺”蛋白傳感針長(zhǎng)度的生成機(jī)制。

4　結(jié) 論

本研究克隆獲得溶藻弧菌HY9901株T3SS的“分子尺”VscP蛋白的全基因序列。該基因 ORF為1 206 bp，編碼401個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為44.44 ku，理論pⅠ值為5.72。VscP氨基酸序列無(wú)信號(hào)肽，不存在跨膜區(qū)，有多個(gè)重要的功能活性位點(diǎn)如N-糖基化等。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示具有一個(gè)T3S4功能域。同源性分析表明與副溶血弧菌親緣關(guān)系較近。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，VscP的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。亞基三維結(jié)構(gòu)模型顯示VscP與鞭毛FliK單亞基有相似的構(gòu)型。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of Yop Secretion Protein P（VscP） from Vibrio alginolyticus Strain HY9901

LI Jing1，2，3，PANG Huan-ying1，2，3，JIAN Ji-chang1，2，3，LU Yi-shan1，2，3，WU Zao-he2，3，4，TANG Ju-fen1，2，3
（1.Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China； 3.Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088，China； 4.Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China）

Primers for PCR cloning were designed according to the whole genome sequence of Vibrio alginolyticus published in GenBank.The type 3 secretion system （T3SS） Yop secretion protein P （VscP）gene of V.alginolyticus strain HY9901 was amplified by PCR and cloned into pMD 18-T vector.Sequence analysis reveals that the ORF of VscP gene （GenBank Accession：FR780678） is 1 206 bp and eneodes a putative protein of 401 amino acids.The predicted molecular weight （MW） of VscP was 44.4 ku with an estimated pI of 5.72.Using Signal Server 4.1 and TMHMM Server 2.0 software，and it was predieted that the VscP protein did not contain a signal peptide or a transmembranous region.The VscP protein had three N-glycosylation sites，two cAMP and cGMP dependent protein kinase phosphorylation site，five protein kinase C phosphorylation sites，nine casein kinase II phosphorylation sites，twoN-myristoylation sites，one amidation site and three loci microbody C-terminal targeting signal predieted by SoftBerry-Psite software.This protein shows high genetic relationship with Vibrio parahaemolyticus via a molecular phylogenetic tree constructed by MEGA6.0 software.A model of VscP subunits application of SWISS-MODEL work-space is built and its three-dimensional structure is found to have similar configuration with flagellar hook-length control protein FliK.

Vibrio alginolyticus； type 3 secretion system； gene cloning； bioinformatics analysis； vscP

Q78

A

1673-9159（2016）04-0030-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.006

2016-03-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（31402344）；海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專(zhuān)項(xiàng)（GD2012-B01004）

李靜（1990－），女，碩士研究生，研究方向：海洋環(huán)境與生物資源保護(hù)。E-mail：janelee812@163.com

吳灶和，男，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)及病害防治，E-mail：wuzaohe@163.com；

龐歡瑛，女，博士，副教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害的研究。E-mail：phying1218@163.com