范斌朋，王梅芳，劉　永，潘珍妮，于非非，余祥勇

（1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東　湛江　524088；2.華南農(nóng)業(yè)大學海洋學院，廣東　廣州　510642）

扁平鉗蛤性腺發(fā)育的組織學研究

范斌朋1，王梅芳2，劉永1，潘珍妮1，于非非1，余祥勇2

（1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東湛江524088；2.華南農(nóng)業(yè)大學海洋學院，廣東廣州510642）

通過石蠟切片對扁平鉗蛤進行性腺發(fā)育組織學觀察，結(jié)果表明，扁平鉗蛤雌雄性腺的發(fā)育都可分為增殖期、生長期、成熟期、排放期和休止期5個時期。增殖期為濾泡形成期，出現(xiàn)了精原細胞和卵原細胞，貼近濾泡壁分布；在生長期，性腺面積、濾泡數(shù)目和生殖細胞數(shù)目都明顯增大，卵母細胞和精母細胞形成；成熟期雌性濾泡內(nèi)充滿卵細胞，其生發(fā)泡透亮，核仁清晰可見，雄性濾泡內(nèi)充滿著藍紫色的精子，精子尾部聚集在濾泡中央，呈鮮紅色；排放期濾泡破損，卵細胞和精子排放，性腺面積減?。恍葜蛊跒V泡腔萎縮，基本無生殖細胞殘留。扁平鉗蛤生殖周期為一年，5—6月處于性腺發(fā)育增殖期；7—10月性腺進入繁殖期，包括生長期、成熟期和排放期；11月進入休止期；其他月份性腺基本不發(fā)育。

扁平鉗蛤；性腺發(fā)育；組織學鑒定；生殖周期

扁平鉗蛤（Isognomon ephippium）屬于軟體動物門（Phylum Mollusca）雙殼綱（Bivalvia）珍珠貝目（Pterioida）鉗蛤科（Isognomonidae）鉗蛤?qū)伲↖sognomon）。為熱帶、亞熱帶暖溫性貝類，在我國主要分布于廣東的陽江和湛江［1］，我國臺灣地區(qū)、南沙群島周邊以及越南、菲律賓、印度洋等地也有少量分布［2-3］。扁平鉗蛤擁有少見的藍褐色珍珠層，且其分泌珍珠質(zhì)機能旺盛、抗病性強，具培育色澤特異珍珠潛能。國內(nèi)外關(guān)于扁平鉗蛤的研究較少，主要集中在養(yǎng)殖參數(shù)、生存環(huán)境和抗病能力等［2-5］方面，關(guān)于扁平鉗蛤組織學水平的鑒定和分析研究報道目前尚鮮見。扁平鉗蛤作為一種具有人工養(yǎng)殖和育苗育珠價值貝類，其性腺發(fā)育時期和生殖周期的鑒定是人工育苗和養(yǎng)殖的重要依據(jù)。本研究通過組織學切片和顯微鏡觀察，對扁平鉗蛤的性腺發(fā)育時期進行組織學劃分，并通過一年內(nèi)每月1次的取樣觀察，探討性腺發(fā)育周期，為扁平鉗蛤生產(chǎn)和養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

實驗用扁平鉗蛤采自廣東省陽江市東平鎮(zhèn)允波灣附近海域野生貝，試劑包括波恩 Bouin's固定液、石蠟、酒精（體積分數(shù)100%、95%、90%、80%、70%、75%、50%）、二甲苯、染色劑、1%酸酒精、冰醋酸，主要儀器有燈箱、切片機、恒溫水浴鍋等。

1.2實驗方法

將所采集野生貝用錐形籠暫養(yǎng)于東平鎮(zhèn)允波灣實驗基地，網(wǎng)籠吊養(yǎng)按生產(chǎn)上的常規(guī)方法進行，籠間距為1m，吊養(yǎng)于水深1.5m的水層。養(yǎng)殖時間為2015年5月至2016年4月。每月隨機取1組扁平鉗蛤（30只），養(yǎng)殖期共取12組扁平鉗蛤。取其性腺，經(jīng) Bouin's液固定、酒精脫水、包埋等步驟后切片（5～7μm），經(jīng)Ehrilich蘇木精-伊紅染色后脫水并封片，在徠卡顯微鏡下觀察，于MC170HD成像系統(tǒng)下拍照［6］。用于制作切片的扁平鉗蛤樣品體重約 35g，殼長、殼高、殼寬分別為 5.5cm、5.3cm和0.8cm左右。

2　結(jié)果與分析

2.1性腺的組織學分期以及外部特征

扁平鉗蛤性腺位于足上方，一層透亮的薄膜包裹著性腺以及整個內(nèi)臟團；在消化盲囊表層，也有部分性腺分布。性腺成熟時，外觀圓潤飽滿，近似橢圓形。濾泡是生殖細胞發(fā)育和成熟的主要場所，由末端膨大的生殖管形成，濾泡呈囊泡狀，形狀不固定，大小不一，由濾泡壁和濾泡腔兩部分組成，濾泡間隙充滿結(jié)締組織。傳統(tǒng)性腺組織學分期方法一般將性腺的發(fā)育分為增殖期、生長期、成熟期、排放期和休止期［7-8］等5個時期，本研究依此將扁平鉗蛤的性腺發(fā)育亦分為5個時期，具體如下。

增殖期（Ⅰ）性腺開始形成期。肉眼可見一層薄而透亮的淡黃色性腺或淺白色性腺（圖1：A、B），主要分布于消化腺的兩側(cè)以及消化盲囊的表層。切片觀察結(jié)果，雌性性腺開始發(fā)育，濾泡逐漸形成，呈彎月狀、圓形、橢圓形等，濾泡壁逐漸增厚。卵原細胞逐漸形成并緊貼濾泡壁。卵原細胞形狀不規(guī)則，多呈橢圓形或圓形，直徑約5μm左右；細胞膜界限模糊，細胞核相對偏大，直徑約3μm，呈圓形，染色質(zhì)凝集，核內(nèi)不易觀察到核仁（圖1：C）。雄性結(jié)締組織間開始出現(xiàn)濾泡，濾泡內(nèi)出現(xiàn)精原細胞和初級精母細胞。精原細胞體積相對較大，著色較淺；初級精母細胞近圓形，體積較精原細胞小，著色較精原細胞深（圖1：D）。

生長期（Ⅱ）性腺持續(xù)發(fā)育期，肉眼觀察性腺較為明顯。切片觀察結(jié)果顯示，雌性濾泡數(shù)量較增殖期多，卵泡內(nèi)包含大量卵母細胞。卵母細胞形態(tài)多呈經(jīng)典梨形，其一端向濾泡腔突出，另一端以卵柄與濾泡壁相連；核質(zhì)比增大，細胞核透亮，形成圓形或橢圓形的生發(fā)泡；核內(nèi)可見染色質(zhì)疏松分布；核仁偏位，直徑約3～4μm（圖1：E）。同時，腔內(nèi)開始出現(xiàn)少量成熟卵細胞，為圓形。生殖細胞逐漸充滿整個濾泡腔。雄性濾泡數(shù)量顯著增多，體積也明顯變大，濾泡內(nèi)主要為精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞和少量精細胞，濾泡腔較充盈、空隙縮?。▓D1：F）。

成熟期（Ⅲ）扁平鉗蛤肥滿，性腺顏色較亮，面積較大，此時挑破其表面薄膜，可見到深黃色卵子或乳白色精液流出。切片觀察結(jié)果顯示，雌性卵母細胞的卵柄逐漸變窄，大部分發(fā)生斷裂并脫離濾泡壁進入濾泡腔中，成熟的卵母細胞占滿整個濾泡腔，近圓形，直徑約為50～60μm。生發(fā)泡體積隨之增大，直徑約25～30μm，居中，核膜清晰，著色較淺。核仁明顯，直徑約5μm，偏位，著藍紫色（圖1：G）。雄性精巢最為豐滿，精原細胞、精母細胞、精子細胞和精子自外向內(nèi)依次排列，充滿濾泡腔。少量精原細胞和精母細胞靠近濾泡壁分布，著色較淺。精子體積小，著藍紫色，呈輻射狀排列于濾泡中央，精子尾部聚集，著鮮紅色（圖1：H）。

圖1　扁平鉗蛤性腺切片F(xiàn)ig.1　The historical sections of gonad in I.ephippium

排放期（Ⅳ）性腺出現(xiàn)不同程度的萎縮，面積減小，顏色較暗，飽滿度下降。切片結(jié)果顯示，雌性性腺發(fā)育經(jīng)過成熟期以后，成熟卵細胞大多數(shù)已完成排放，僅殘留少量處于不同發(fā)育時期的雌性生殖細胞，并最終走向退化。濾泡性狀不規(guī)則，出現(xiàn)不同程度的中空，有得甚至破裂（圖1：I）。雄性精子大量的排放，濾泡腔出現(xiàn)程度不一的射線狀空腔。濾泡壁殘留一些發(fā)育稍晚的精原細胞和精母細胞，陸續(xù)發(fā)育成精子排放（圖1：J）。

休止期（Ⅴ）性腺萎縮松弛，面積較小，甚至基本無法辨別，顏色偏白色。切片觀察發(fā)現(xiàn)，雌性經(jīng)過排放期后，濾泡內(nèi)幾乎觀察不到雌性生殖細胞，濾泡壁變薄、塌陷并開始退化。休止期末期，結(jié)締組織大量增生，濾泡徹底消失，性腺發(fā)育經(jīng)歷1個周期（圖1：K）。雄性完成精子排放后，濾泡成為空腔，腔內(nèi)所殘余的各期精細胞也逐漸消失。休止期晚期濾泡消失，結(jié)締組織大量增生，性腺發(fā)育完成 1個周期（圖1：L）。

2.2生殖周期

本研究對每月所采60個扁平鉗蛤的性腺進行切片觀察，統(tǒng)計其性腺的發(fā)育程度，如表1所示。5、6月所采樣品中，大部分個體（41.7%）處于性腺發(fā)育增殖期；7月36.7%個體進入生長期；8月份有18.3%處于生長期，26.7%處于成熟期；9月有3.3%處于生長期，41.7%處于成熟期，3.3%處于排放期；10月有6.7%處于成熟期，41.7%處于排放期；11月3.3%的樣品處于成熟期，11.7%處于排放期；12月和來年1月大部分貝性腺不發(fā)育，只有少量個體處于休止期；2月、3月和4月未見性腺發(fā)育個體。從進入繁殖期（包括生長期、成熟期、排放期）的性腺比例看，5月和6月比例為0；7月升高到36.7%；8月繼續(xù)升至45.0%；9—10月保持最高水平48.3%；11月下降至15.0%；從12月至來年4月，都無進入繁殖期性腺發(fā)現(xiàn)。

數(shù)據(jù)顯示，扁平鉗蛤在5—6月處于性腺發(fā)育增殖期，7—10月性腺逐漸飽滿，進入繁殖期，11月性腺逐漸萎縮進入休止期，其余月份性腺基本不發(fā)育。可見，扁平鉗蛤的生殖周期為一年期。

表1　扁平鉗蛤性腺發(fā)育分期統(tǒng)計Table1　The statistics of the gonad development of I.ephippium

3　討　論

3.1扁平鉗蛤性腺發(fā)育的組織學分期

與傳統(tǒng)的顯微鏡直接觀察相比，性腺的組織學切片能更好地闡述性腺、濾泡、生殖細胞的形態(tài)特征和發(fā)生分布，鑒定貝類性腺發(fā)育情況，指導(dǎo)人工受精和養(yǎng)殖。王梅芳［9-10］等對櫛江珧（Atrina pectinata linnaeus）性腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行了研究，徐宗芹［11］等描述了企鵝珍珠貝（Pteda penguin（R?ding））性腺各個發(fā)育時期的形態(tài)特征及各種生殖細胞的發(fā)生分布，呂豪［12］等分析了太平洋牡蠣的性腺發(fā)育分期，林志華［13］等對文蛤的性腺發(fā)育周期進行了探討，這些結(jié)果給貝類的生理代謝和繁殖育種研究提供了組織學基礎(chǔ)。

扁平鉗蛤是培育色澤特異珍珠的潛能品種，掌握其性腺發(fā)育情況是人工繁殖和育珠的前提條件。目前尚未見關(guān)于其性腺分期和生殖周期的報道。本研究通過組織切片和顯微觀察，將扁平鉗蛤性腺發(fā)育分可分為5個時期，即增殖期、生長期、成熟期、排放期以及休止期，并歸納了各個時期的主要特征。增殖期為濾泡形成期，并出現(xiàn)了精原細胞和卵原細胞，貼近濾泡壁分布。在生長期，性腺面積、濾泡數(shù)目和生殖細胞數(shù)目都明顯增多，卵母細胞和精母細胞形成。成熟期性腺發(fā)育最為飽滿，雌性濾泡內(nèi)充滿圓形的卵細胞，其生發(fā)泡透亮，核仁清晰可見；雄性濾泡內(nèi)充滿著藍紫色的精子，精子尾部聚集在濾泡中央，呈鮮紅色。排放期濾泡破損，卵細胞和精子大量排放，性腺面積減小，性狀不規(guī)則。休止期濾泡腔萎縮，基本無生殖細胞殘留，濾泡退化難易分辨。以上性腺特征與櫛江珧［9］、企鵝珍珠貝［11］、太平洋牡蠣［12］和文蛤［13］等存在一定的相似之處。

3.2扁平鉗蛤的生殖周期

本研究數(shù)據(jù)顯示，扁平鉗蛤的生殖周期為一年期，5—6月為性腺發(fā)育增殖期；7—10月進入繁殖期（包括生長期、成熟期和排放期）；11月性腺逐漸萎縮進入休止期；其余月份性腺基本不發(fā)育。相關(guān)研究也在其他貝類中得以開展，閆斌倫等［124］發(fā)現(xiàn)，連云港海區(qū)的毛蚶性腺發(fā)育為一年，其繁殖盛期在7月中旬至8月中旬，排放期為7月至9月；林志華［13］等發(fā)現(xiàn)，文蛤的性腺發(fā)育周期亦為一年，1—3月為增殖期，4—5月為生長期，5—7月為其成熟期，8月之后進入排放期和休止期?？梢?，不同貝類性腺發(fā)育都存在5個時期，但性腺成熟的具體月份存在一定差別，這很大程度上歸因于物種差異、地理分布、餌料投喂和養(yǎng)殖環(huán)境的變化［13-15］。

3.3雌雄同體問題

于非非等［16-17］指出，雙殼貝類多為雌雄異體，少數(shù)個體存在雌雄同體及性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象。王梅芳等［9-10］研究表明，櫛江珧一般為雌雄異體，但也存在雌雄同體現(xiàn)象。企鵝珍珠貝為雌雄異體，同時也觀察到了企鵝珍珠貝的性別轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，相關(guān)報道指出，在其所取的128例企鵝珍珠貝中，僅發(fā)現(xiàn)1例為雌雄同體［11］。本實驗共解剖240個扁平鉗蛤，通過對其性腺切片的觀察，并未發(fā)現(xiàn)扁平鉗蛤存在雌雄同體個體，提示扁平鉗蛤為雌雄異體貝類，可能不存在性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。

4　結(jié)　論

本研究對扁平鉗蛤雌雄性腺的發(fā)育進行組織學分期，分別為增殖期、生長期、成熟期、排放期和休止期，各個時期的主要特征為：增殖期為濾泡形成期，出現(xiàn)精原細胞和卵原細胞，貼近濾泡壁分布；生長期，性腺面積、濾泡數(shù)目和生殖細胞數(shù)目都明顯增多，卵母細胞和精母細胞形成；成熟期性腺發(fā)育最為飽滿，雌性濾泡內(nèi)充滿卵細胞，其生發(fā)泡透亮，核仁清晰可見，雄性濾泡內(nèi)充滿著藍紫色的精子，精子尾部聚集在濾泡中央，呈鮮紅色；排放期濾泡破損，卵細胞和精子排放，性腺面積減小。休止期濾泡腔萎縮，基本無生殖細胞殘留。

扁平鉗蛤的生殖周期為一年期，5—6月處于性腺發(fā)育增殖期，7—10月進入繁殖期（包括生長期、成熟期和排放期），11月性腺逐漸萎縮進入休止期，其他月份性腺基本不發(fā)育。

［1］黃宗國.中國海洋生物種類與分布：增訂版［M］.北京：海洋出版社，2008：418-452.

［2］李強勇.扁平鉗蛤生物學特征及其海區(qū)養(yǎng)殖的初步研究［D］.湛江：廣東海大學，2013.

［3］李優(yōu).溫度和鹽度對扁平鉗蛤生長及代謝的影響［D］.湛江：廣東海大學，2015.

［4］李曉梅，杜宇，林熾賢.海南西瑁洲島潮間帶的底棲貝類組成與數(shù)量分布［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（5）：2406-2408.

［5］倪純治，曾文陽.香港大埔海海水和幾種食用貝類中含大腸菌群的初步檢測［J］.熱帶海洋，1985，4（3）：80-84.

［6］梁久征，王麗遠，龐寶成.毛蚶組織切片的制作和觀察［J］.河北漁業(yè)，2016（2）：10-12.

［7］林志華，單樂州，柴雪良，等.文蛤的性腺發(fā)育和生殖周期［J］.水產(chǎn)學報，2000，（28）5：510-514.

［8］閻斌倫，許星鴻，鄭家聲，等.毛蚶的性腺發(fā)育和生殖周期［J］.海洋湖沼通報，2005（4）：92-98.

［9］王梅芳，余祥勇，王如才.櫛江珧生殖細胞的發(fā)生［J］.青島海洋大學學報，2007，（30）3：441-446.

［10］王梅芳，余祥勇，葉富良.北部灣及附近海域櫛江珧性腺發(fā)育研究［J］.廣西科學，2000，7（2）：140-143

［11］徐宗芹，王梅芳，梁飛龍，等.企鵝珍珠貝生殖細胞的發(fā)生［J］.廣東海洋大學學報，2009，（29）6：32-35.

［12］呂豪.太平洋牡礪控溫條件下的性腺發(fā)育、條件指數(shù)和積溫的關(guān)系［J］.中國水產(chǎn)科學，1998（5），1：18-23.

［13］尤仲杰，陸彤霞，馬斌，等.鹽度對墨西哥灣扇貝幼蟲和稚貝生長與存活的影響［J］.動物學雜志，2003，38（3）：58-60.

［14］謝仁政，初慶柱，黃海立，等.鹽度對珠母貝幼蟲和稚貝存活和生長的影響［J］.廣東海洋大學學報，2013（6）：57-61.

［15］余祥勇，劉永，馮奕成，等.低鹽度海水對企鵝珍珠貝存活的影響［J］.湛江海洋大學學報，2005（4）：22-26.

［16］于非非，余祥勇，王梅芳，等.雙殼類的性轉(zhuǎn)換現(xiàn)象及其機理探討［J］.水生生物學報，2007（4）：576-580.

［17］LIAO C Y，XU Y F，WANG Y L.The procreation circle of Chlamys Atreri［J］.Journal of Shanchai Fisheries University，1983，7（1）：1-2.

（責任編輯：陳莊）

Histological Study on the Development of Gonad of Isognomon ephippium

FAN Bin-peng1，WANG Mei-fang2，LIU Yong1，PAN Zhen-ni1，YU Fei-fei1，YU Xiang-yong2
（Fisheries College，Guangdong Ocean University，zhanjiang 524088，China；Ocean College，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Isognomon ephippium，with special lurid pearl layer，is a potential aquaculture breed to cultivate special color special pearl.The historical identification of gonad development and reproductive cycle was important for breeding and pearl cultivation in I.ephippium.The development of gonad in I.ephippium was analyzed by histological sections technology.The data indicated that the development of both male and female gonads of I.ephippium was devided into the proliferation stage，increasing stage，maturation stage，breeding stage and suspensive stage，with specific characteristics of gonads and germ cells.In the proliferation stage，oogonium and spermatogonium were produced in new follicles.In increasing stage，the area of the gonads，the number of follicles and germ cells were increased obviously.Massive oocytes and spermatocytes existed in follicles.In maturation stage，the follicles were filled with oocytes，which had bright germinal vesicle，clear nucleolus，and sperms with red tails.In breeding stage，mature germ cells were released from damaged follicles.In suspensive stage，follicles were shrinked and no germ cells were found.The reproductive cycle of I.ephippium was one year，including proliferation stage from May to June，increasing stage from July to August，maturation stage fromAugust to September，breeding stage from September to October，suspensive stage from October to November.Most gonads did not grow from December to next April.

Isognomon ephippium； gonad development； histological identification； reproductive cycle

S917.4

A

1673-9159（2016）04-0001-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.001

2016-05-06

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項項目（A201308A11、A201308A05）；廣東海洋大學優(yōu)秀青年骨干教師培養(yǎng)項目（2014004）；廣東海洋大學博士啟動基金（E15041）

范斌朋（1988—），男，碩士研究生，研究方向為海洋經(jīng)濟動物發(fā)育生物學。E-mail：806360059@qq.com

于非非（1980—），女，講師，研究方向為貝類的遺傳育種。E-mail：yufeifei2000@163.com

余祥勇，男，教授，研究方向為水產(chǎn)動物育種及養(yǎng)殖。E-mail：topearly@126.com