韓濱，馬曉峰，張超

急性腦卒中患者外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的AChE相關(guān)的microRNAs的表達(dá)變化

韓濱，馬曉峰，張超△

目的探討急性腦卒中患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）相關(guān)的microRNAs的表達(dá)變化。方法利用microRNAs的預(yù)測(cè)軟件并結(jié)合文獻(xiàn)，篩選靶向AChE的microRNAs。收集發(fā)病24 h以?xún)?nèi)的急性腦卒中患者和與之相匹配的對(duì)照組人群，留取靜脈血提取單個(gè)核細(xì)胞。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)microRNAs和AChE mRNA的表達(dá)，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)AChE蛋白的表達(dá)。結(jié)果預(yù)測(cè)的靶向AChE的microRNAs包括microRNA（miR）-24、-28、-124、-132、-182*、-194、-484。與對(duì)照組相比，腦卒中患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)miR-24、-124、-132和-194表達(dá)升高（P＜0.05），miR-28、-182*及-484無(wú)明顯變化，AChE mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)論腦卒中時(shí)miRNAs可能通過(guò)靶向AChE增強(qiáng)膽堿能抗炎通路。

卒中；乙酰膽堿酯酶；微RNAs；外周血單個(gè)核細(xì)胞；膽堿能抗炎通路

腦卒中是引起人類(lèi)死亡的第二大原因和致殘的主要原因［1］。研究表明microRNAs（miRNAs）參與了缺血性血管事件后續(xù)的病情發(fā)展［2-4］。miRNAs是一類(lèi)高度保守的短鏈非編碼RNAs，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮作用，其在免疫炎癥性疾病的發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用［5］。在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)炎癥中，miR-132可通過(guò)靶向乙酰膽堿酯酶（AChE）加強(qiáng)膽堿能抗炎信號(hào)，減輕炎癥水平［6］。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中，升高miR-132的水平可以減輕小鼠的發(fā)病癥狀［7］。這種作用被用來(lái)治療應(yīng)激誘發(fā)的認(rèn)知缺陷［8］。膽堿能抗炎通路由迷走神經(jīng)傳入纖維、中樞及迷走神經(jīng)傳出纖維組成，在神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的交流中發(fā)揮著重要的橋梁作用［9］。AChE可以調(diào)節(jié)膽堿能狀態(tài)，其活性可以作為反映炎癥狀態(tài)的指標(biāo)［10］。本研究旨在探討AChE相關(guān)的miRNAs對(duì)于腦卒中后炎癥的調(diào)節(jié)作用，為治療腦卒中提供新的治療策略。

Tab.1The stem-loop primers of different genes表1 各基因莖-環(huán)引物序列

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象于2015年10月—2016年4月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院住院的102例急性缺血性腦卒中患者中篩選出30例患者作為腦卒中組。入組標(biāo)準(zhǔn):（1）發(fā)病時(shí)間＜24 h。（2）年齡＞18歲。（3）經(jīng)頭顱CT或MRI診斷為前循環(huán)的腦梗死。排除標(biāo)準(zhǔn):（1）合并感染。（2）合并腫瘤。（3）孕婦。（4）出血性腦卒中。（5）合并慢性炎癥或自身免疫性疾病。（6）合并認(rèn)知障礙。收集于我院進(jìn)行體檢的健康成人30例作為對(duì)照組。腦卒中組平均年齡（62.62±10.97）歲，男17例，女13例；對(duì)照組平均年齡（61.79±10.89）歲，男15例，女15例。2組之間年齡（t=0.294）、性別（χ2=0.268）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；SYBR試劑（德國(guó)Roche公司）；AChE抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀CFX ConnectTM、Bio-Rad ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)、Bio-Rad MyCycler普通PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)、BiofugeStratos高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Sartorius analytic A 1205萬(wàn)分之一分析天平（美國(guó)Sartorius公司）；QL-866-旋渦混合器（中國(guó)其林貝爾公司）。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）分離用含EDTA的抗凝管抽取患者靜脈血后立即置于冰上，以3 000 r/min的速度離心10 min，吸取上層血漿凍存于-80℃冰箱；下層的血沉淀加入等體積的PBS稀釋?zhuān)S后將稀釋后的血沉淀緩慢加入等體積人淋巴細(xì)胞分離液中，2 000 r/min，慢升、慢降，離心20 min。離心結(jié)束后，管底為紅細(xì)胞，中間層為分離液，上層為血漿層，血漿層與分離液層之間有一層較致密的白膜，小心吸取白膜即得到PBMCs。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)miRNAs及AChE的表達(dá)利用Trizol試劑從新鮮的PBMCs中提取出總RNA，并利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度。取1 μg總RNA作為模板，miRNAs采用莖-環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，AChE采用Oligo（dT）引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒建立20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，莖-環(huán)引物序列見(jiàn)表1。然后根據(jù)SYBR的說(shuō)明書(shū)，取2 μL cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，每個(gè)樣本基因重復(fù)3次，反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃10 min，隨后變性95℃15 s，退火58～61℃30 s，延伸72℃20 s，39個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔCt法計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。U6作為miRNAs的內(nèi)參，β-actin作為AChE的內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表2。

Tab.2The PCR primers of different genes表2 各基因?qū)崟r(shí)定量引物序列

1.3.3 Western blot檢測(cè)AChE蛋白新鮮提取的PBMCs經(jīng)裂解液裂解后，通過(guò)CBA試劑盒檢測(cè)蛋白的濃度，隨后加入上樣緩沖液煮沸10 min，使蛋白變性。然后用10%的SDSPAGE膠進(jìn)行電泳分離，之后將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。經(jīng)5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入TBST稀釋的一抗，搖床置于4℃冰箱中，慢搖、孵育過(guò)夜。第2天用TBST洗滌一抗，隨后加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h后，進(jìn)行曝光，通過(guò)Image J軟件檢測(cè)灰度值。一抗的濃度為鼠抗-AChE（1∶100），內(nèi)參蛋白為鼠抗-GAPDH（1∶1 000）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，2組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料2組間比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)靶向AChE的miRNAs利用Targetscan、Pictar、miRanda［11］并結(jié)合文獻(xiàn)，選取了高度保守的miRNAs，然后選取預(yù)測(cè)軟件及文獻(xiàn)的重疊部分，最終確定了7種miRNAs，包括:miR-24、-28、-124、-132、-182*、-194及-484。

2.2 PBMCs內(nèi)相關(guān)miRNAs的變化與對(duì)照組相比，腦卒中組PBMCs內(nèi)miR-24、-124、-132和-194的表達(dá)均升高（P＜0.05），miR-28、-182*和-484無(wú)明顯變化，見(jiàn)表3。

Tab.3The expression levels of 7 kinds of miRNAs in PBMCs detected by qRT-PCR表3 qRT-PCR檢測(cè)PBMCs內(nèi)7種miRNAs的表達(dá)變化（n=30，）

Tab.3The expression levels of 7 kinds of miRNAs in PBMCs detected by qRT-PCR表3 qRT-PCR檢測(cè)PBMCs內(nèi)7種miRNAs的表達(dá)變化（n=30，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組腦卒中組t miR-24 1.09±0.48 1.79±0.76 4.209＊＊miR-28 1.10±0.10 1.06±0.27 1.125 miR-124 1.07±0.43 1.87±1.30 3.214＊miR-132 1.02±0.19 1.49±0.43 5.480＊＊組別對(duì)照組腦卒中組t miR-182* 1.20±0.82 1.24±1.01 0.185 miR-194 1.03±0.26 1.38±0.83 2.304＊miR-484 1.14±0.54 1.17±0.59 0.170

2.3 PBMCs內(nèi)AChE的變化與對(duì)照組相比，腦卒中組AChE mRNA表達(dá)降低，Western blot定量結(jié)果表明AChE蛋白表達(dá)水平亦降低（均P＜0.05），見(jiàn)表4、圖1。

Tab.4The changes of AChE mRNA and proteins表4 AChE mRNA及蛋白水平的變化（n=15，）

Tab.4The changes of AChE mRNA and proteins表4 AChE mRNA及蛋白水平的變化（n=15，）

＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組腦卒中組t AChE mRNA 1.00±0.32 0.41±0.29 5.224＊＊AChE蛋白灰度比值1.00±0.12 0.53±0.14 9.880＊＊

Fig.1The expression levels of AChE proteins圖1 AChE蛋白水平的變化

3 討論

研究表明人體內(nèi)AChE直接或間接地參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，已經(jīng)證實(shí)其在多種疾病中可作為體內(nèi)炎癥的一個(gè)指標(biāo)，如腦卒中［10］和炎癥性腸?。?1］。AChE通過(guò)調(diào)節(jié)ACh水平參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。本研究預(yù)測(cè)了靶向AChE的miRNAs，包括miR-24、-28、-124、-132、-182*、-194和-484。一種miRNA可以靶向多種mRNA，并且一種mRNA也可有多種miRNAs靶向相應(yīng)的3′端非編碼區(qū)（3′-UTR）［12］，為預(yù)測(cè)靶向AChE的多種miRNAs提供了理論基礎(chǔ)，本研究預(yù)測(cè)結(jié)果符合這一基本原則。研究進(jìn)一步探討了上述miRNAs在急性腦卒中患者和健康人群中的變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，腦卒中組miR-24、-124、-132和-194的表達(dá)出現(xiàn)了升高，而miR-28、-182*和-484沒(méi)有明顯變化。有研究顯示，青年卒中患者外周血miR-24和-194水平升高，而miR-28、-182*和-484也沒(méi)有明顯變化［3］，與本研究不同的是，沒(méi)有檢測(cè)到miR-124和-132水平的變化，考慮原因可能為研究對(duì)象之間年齡存在較大差異。miR-132可通過(guò)靶向AChE加強(qiáng)膽堿能抗炎通路的強(qiáng)度［6］，在炎癥狀態(tài)下，miR-132表達(dá)升高，本研究與之相符。同時(shí)，膽堿能系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)miR-124的表達(dá)，減少了白細(xì)胞介素（IL）-6及腫瘤壞死因子（TNF）-α的產(chǎn)生，減輕了炎癥反應(yīng)［13］，提示miR-124在炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著一定的作用。本研究證實(shí)miR-124發(fā)生了明顯的變化，提示miR-124參與了腦卒中炎癥的調(diào)節(jié)。

與對(duì)照組相比，腦卒中患者PBMCs內(nèi)AChE mRNA及蛋白表達(dá)出現(xiàn)下降，提示這些miRNAs可能參與了AChE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，加強(qiáng)了膽堿能抗炎信號(hào)，從而參與了卒中后炎癥的調(diào)節(jié)。有研究顯示，腦卒中患者AChE的活性下降［10］，與本研究結(jié)果一致。卒中患者PBMCs內(nèi)乙酰膽堿的分解酶AChE發(fā)生了劇烈的變化，提示在腦卒中患者體內(nèi)AChE扮演著非常重要的角色。本研究有一些局限性:（1）未證實(shí)異常變化的miRNAs直接靶向AChE，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。（2）影響膽堿能系統(tǒng)的因素較多，如年齡、情緒等，需更好地控制混雜因素的影響。

綜上所述，靶向AChE的miR-24、-124、-132和-194在腦卒中組的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，且AChE的水平與炎癥有關(guān)，這些miRNAs可能具有調(diào)節(jié)腦卒中患者體內(nèi)炎癥的功能。因此對(duì)這些miRNAs的研究可能為以后腦卒中的診斷、治療及研究提供一種新的方向和策略。

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（2016-06-06收稿2016-07-07修回）

（本文編輯李國(guó)琪）

The change of AChE related microRNAs derived from peripheral blood mononuclear cells in acute ischemic stroke

HAN Bin，MA Xiaofeng，ZHANG Chao△
Department of Neurology，Tianjin Neurological Institute，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China△

ObjectiveTo investigate the expression changes of acetylcholinesterase（AChE）related microRNAs derived from peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in patients with stroke.MethodsThe microRNAs for targeting AChE mRNA were selected via prediction software and previous studies.PBMCs were extracted from venous blood samples of acute ischemic stroke patients（onset＜24 h）and healthy controls.The expressions of microRNAs and AChE mRNA were quantified using real-time PCR（RT-PCR）.The protein level of AChE was detected by Western blot assay.ResultsThepredicted microRNAs included microRNA（miR）-24，-28，-124，-132，-182*，-194 and-484.The expression levels of miR-24，-124，-132 and-194 were significantly elevated in stroke patients compared with those of controls（P＜0.05）.There were no significant changes in expression levels of miR-28，-182*and-484.Additionally，the relative expression levels of intracellular AChE mRNA and protein decreased significantly in stroke patients（P＜0.05）.ConclusionMiRNAs can enhance cholinergic anti-inflammatory pathway by targeting AChE in patients with acute ischemic stroke.

stroke；acetylcholinesterase；microRNAs；peripheral blood mononuclear cells；cholinergic antiinflammatory pathway

R741

A

10.11958/20160518

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81401361）

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（郵編300052）

韓濱（1988），男，碩士，主要從事神經(jīng)免疫性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究

△通訊作者E-mail:bjyb254@163.com