常麗賢，章婧嫽，任媛媛，孫聰聰，萬揚，安文彬，張英馳，袁衛(wèi)平，竺曉凡

針對人DNAH2蛋白的鼠源單克隆抗體的制備

常麗賢，章婧嫽，任媛媛，孫聰聰，萬揚，安文彬，張英馳，袁衛(wèi)平，竺曉凡△

目的制備特異性的鼠源單克隆抗DNAH2（Homo sapiens dynein，axonemal，heavy chain 2）抗體。方法首先針對人DNAH2蛋白N端1～300 aa序列，構建可表達His標簽的免疫原融合表達質粒，在大腸桿菌內以IPTG誘導His-免疫原的表達并純化；然后免疫BALB/c小鼠，分離出脾淋巴細胞，并與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞；最后以酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、蛋白免疫印跡法（Western blot）篩選陽性雜交瘤細胞。結果利用IPTG有效誘導了大腸桿菌內DNAH2免疫原的表達；篩選的陽性雜交瘤細胞檢測出DNAH2蛋白條帶。結論成功制備針對人DNAH2蛋白的鼠源單克隆抗體。

抗體，單克??；雜交瘤；質粒；重組，遺傳；DNAH2

DNAH2（Homo sapiens dynein，axonemal，heavy chain 2）蛋白是由定位于17p13.1的DNAH2基因編碼的蛋白質，包括4 427個氨基酸，分子質量約為500 ku，是組成內側動力臂的主要成分，可通過三磷酸腺苷（ATP）水解酶的作用參與細胞纖毛的運動［1-3］。然而，學者們對于DNAH2基因的研究非常有限，目前尚無針對DNAH2蛋白的單克隆抗體。本研究旨在通過單克隆技術制備抗人DNAH2蛋白的鼠源單克隆抗體，為DNAH2蛋白的功能研究提供蛋白工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及實驗動物U2OS細胞、骨髓瘤細胞（SP2/0）為本實驗室凍存；SPF級近交系BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，體質量12～16 g，購自天津科儀嘉欣科技有限公司，飼養(yǎng)于實驗室SPF環(huán)境中。

1.1.2 試劑與儀器PEG4000購自德國MERCK公司；HAT培養(yǎng)基添加劑、RPMI 1640、胎牛血清（FBS）購自GIBCO公司；BCA蛋白測定試劑盒購自Pierce公司；血藍蛋白（KHL）、弗氏（不）完全佐劑、單克隆鼠源抗β-actin一抗購自Sigma公司；鼠源抗His抗體購自MBL公司；辣根過氧化物酶標記的抗鼠源IgG二抗購自KPL公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自Invitrogen公司；BeyoECL Plus（超敏ECL化學發(fā)光試劑盒）購自碧云天公司；牛血清白蛋白（BSA）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、考馬斯亮蘭染色液、SDS上樣緩沖液購自天津科儀嘉欣科技有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)購自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的獲取利用MBL抗原檢索系統(tǒng)對人源DNAH2的功能區(qū)域進行二級結構預測，分析其抗原性，確定多肽候選氨基酸序列，再由北京博爾邁生物技術有限公司針對此序列通過基因工程方式將其連接入帶有His標簽的原核表達質粒pET-28a（+）。在大腸桿菌內通過IPTG誘導His-免疫原的表達，然后進行考馬斯亮蘭染色和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測。以LB培養(yǎng)基搖菌擴增有His標簽的免疫原融合表達質粒（37℃，100 r/min過夜培養(yǎng)）；加入IPTG（24 g/L）誘導蛋白表達，28℃，120 r/min繼續(xù)培養(yǎng)2 h；4℃、15 000 r/min，離心5 min；同時以IPTG誘導表達的陰性對照組，再分別以細菌裂解緩沖液（1×PBS、2%TritonX-100）重懸菌體沉淀；超聲裂解細菌2次后4℃靜置10 min，13 000 r/min離心10 min，轉移上清至1.5 mL離心管中。分別獲取IPTG（-）未誘導組全液、IPTG（+）誘導組全液、IPTG（+）誘導組上清、IPTG（+）誘導組沉淀樣品，加入SDS上樣緩沖液，99℃熱變性10min，分別進行考馬斯亮蘭染色和6%SDS-PAGE電泳。同時取0.5 μg、1.0 μg、2.0 μg的BSA樣品作為考馬斯亮蘭染色后條帶純度及位置的陽性參考。SDS-PAGE電泳結束后，以濕轉法將凝膠上蛋白轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，加入鼠源抗His標簽抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠源IgG二抗（1∶15 000）室溫孵育1 h。TBST溶液洗膜后加入BeyoECL Plus（超敏ECL化學發(fā)光試劑盒）后暗室曝光。檢測合格后，利用上述方法大量誘導攜帶His標簽的免疫原，再通過His標簽，利用Ni Sepharose?6 Fast Flow-AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行免疫原的純化。純化后以考馬斯亮蘭染色進行鑒定。

1.2.2 動物免疫將200 μg免疫原與弗氏完全佐劑混合，對BALB/c小鼠進行腹腔注射，每只小鼠免疫量為50 μg。初次免疫后，將200 μg免疫原與弗氏不完全佐劑混合，進行2～3次免疫。

1.2.3 細胞融合首先從免疫后BALB/c雌性小鼠的脾臟組織中分離脾淋巴細胞，同時以10%FBS-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓瘤細胞（SP2/0）；然后將骨髓瘤細胞與脾淋巴細胞按2∶1～10∶1的比例混合后離心，加入等量50%PEG，進行3次細胞融合，以形成多個雜交瘤，以10%FBS-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，并進行編號，再分離收集上清液為“單克隆前抗體液”，以ELISA進行效價檢測。酶標板每孔加入50 μL以PBS稀釋的免疫原（1 mg/L），4℃靜置包被過夜；棄去各孔液體后加入封閉液處理1 h；甩干后加入不同稀釋比例的多克隆抗體液，37℃孵育1 h；洗滌后加入POD標記的抗小鼠源IgG二抗，37℃孵育1 h；洗滌后TMB顯色，反應終止，檢測光密度（OD）值。當OD＞0.2時進一步行Western blot檢測，其中所采用的樣品為U2OS全細胞裂解液。在500 ku附近出現(xiàn)條帶視為陽性雜交瘤細胞。

1.2.4 單克隆雜交瘤細胞的篩選在96孔板中以含15% FBS的HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)上述經(jīng)過ELISA、Western blot初步鑒定的陽性雜交瘤細胞，采用有限稀釋法稀釋細胞，再采用半量換液法，每隔3 d更換HAT培養(yǎng)基1次，第10天吸取少量上清液為“單克隆抗體液”，再依次以ELISA、Western blot進行篩選。2周后更換培養(yǎng)基為HT培養(yǎng)基。將陽性孔細胞陸續(xù)轉移至24孔、12孔、6孔板中擴大培養(yǎng)。陸續(xù)收集上清，再以Western blot進行效價鑒定。合格者即為制備的單克隆鼠源抗DNAH2抗體。

2 結果

2.1 DNAH2免疫原位點的分析通過MBL抗原檢索系統(tǒng)對人源DNAH2的功能區(qū)域進行二級結構預測，分析其抗原性。從溶解度（accessibility）、柔韌性（flexibility）、露在分子表面的難易度（surface probability）、抗原性（antigenecity）、親水性（hydrophilicity）、極性（dipole）等因素發(fā)現(xiàn)人DNAH2蛋白（NP_065928.2）N端1～300 aa序列的綜合抗原性分數(shù)（total antigenic score）較高，露在分子表面的概率較大。另外，此段序列為人DNAH2蛋白1～3亞型的共有片段，與小鼠DNAH2相比差異很大、特異性較高，故選擇人DNAH2蛋白N端1～300 aa序列來表達重組蛋白抗原，作為免疫BALB/c小鼠的免疫原，見圖1。

2.2 DNAH2免疫原的鑒定針對人DNAH2蛋白N端1～300 aa序列，構建可表達His標簽的免疫原融合表達質粒，然后在大腸桿菌內通過IPTG誘導His-免疫原的表達，以考馬斯亮蘭染色和Western blot實驗進行純化前的初步鑒定。在分子質量37 ku附近有重組蛋白目的條帶出現(xiàn)，而在IPTG（+）誘導組沉淀中目的蛋白表達量最多，故對沉淀部分進行純化獲取目的蛋白，見圖2。經(jīng)過純化處理后，再次進行考馬斯亮蘭染色鑒定。在分子質量約37 ku附近檢測到目的蛋白條帶，且純度較高。純化獲取的重組蛋白總量為3 mg，見圖3。

2.3 單克隆抗DNAH2抗體的Western blot分析以純化后的免疫原免疫BALB/c小鼠后，從脾臟中分離脾淋巴細胞，并與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞；挑選單克隆后獲得3個單克隆鼠源抗DNAH2抗體，再進行Western blot實驗，分析DNAH2抗體的有效性，以及U2OS細胞中DNAH2蛋白的表達。在分子質量約500 ku附近檢測到目的蛋白條帶，表明制備的3個抗體均有效，U2OS細胞可表達DNAH2蛋白，見圖4。

Fig.1Analysis of DNAH2 immunogen site圖1 DNAH2免疫原位點的分析

Fig.2Coomassie blue staining and Western blot assay in unpurified immunogen圖2 未純化免疫原的考馬斯亮蘭染色和Western blot檢測

Fig.3Coomassie blue staining of purified immunogen圖3 純化后免疫原的考馬斯亮蘭染色

Fig.4Western blot assay showing monoclonal mouse anti-DNAH2 antibody圖4 單克隆鼠源抗DNAH2的Western blot檢測

3 討論

作為細胞表面的骨架蛋白特化結構，纖毛是廣泛存在于動、植物細胞中的“運動器官”［3-4］。纖毛的基本結構包括纖毛膜、纖毛基質及軸絲。軸絲是纖毛的骨架結構，由位于中央的中央微管、周圍9排環(huán)形排列的二聯(lián)微管及其附屬蛋白構成。二聯(lián)微管包含A管和B管，兩者緊密連接，從A管伸出兩條短臂，分別稱為外側動力臂和內側動力臂。其中，內側動力臂具有ATP酶活性，可將化學能轉變?yōu)闄C械能，促進AB微管之間的相對滑動和纖毛的彎曲，導致纖毛運動［3-4］。

DNAH2蛋白從N端至C端所包含的區(qū)域依次為:（1）動力蛋白的莖干Stem（包含DHC N1和DHC N2）。（2）AAA-6（包含AAA1與P-loop-NTPase）。（3）AAA2（包含1個P-loop-NTPase）。（4）AAA3（包含2個AAA超家族）。（5）TPR2。（6）AAA4。（7）P-loop-NTPase。（8）Stalk。（9）MT（動力蛋白微管結合莖）。（10）AAA5（包括AAA-9）。（11）重鏈和動力蛋白區(qū)D6（包括AAA-6、TRP4及TRP5）11個區(qū)域［1-3］。另外，位于蛋白質結構中的最后一個P環(huán)往往與C端的區(qū)域呈伸展的“線圈”，該結構可能是與其他蛋白質相互作用的位點［1-3］。目前對于DNAH2蛋白的研究數(shù)據(jù)十分有限，針對DNAH2蛋白的商品化抗體也均為多克隆抗體。本實驗是以基因工程手段人工表達DNAH2蛋白N端1～300 aa片段，并以其為免疫原免疫小鼠，通過細胞融合-雜交瘤細胞篩選制備抗人DNAH2的小鼠源單克隆抗體。

在形成大分子蛋白質嚴密的空間結構中，特定位點氨基酸的種類、電荷量、極性等屬性與蛋白質分子空間結構的形成和生理功能的發(fā)揮密切相關。當DNAH2蛋白發(fā)生特定位點的點突變時，可能會改變氨基酸所在部位與水的親和力，干擾DNAH2的ATP水解酶活性，從而影響DNAH2的蛋白結合作用。前期的全外顯子組測序表明DNAH2蛋白的點突變與范可尼貧血（Fanconi anemia，F(xiàn)A）之前存在潛在的關聯(lián)［5］。范可尼貧血是一種常染色體或X連鎖隱性遺傳性疾病，以造血衰竭為主要臨床表現(xiàn)，常并發(fā)多種先天軀體畸形或實體腫瘤［6-8］。本實驗室將利用制備的小鼠單克隆抗人DNAH2抗體進行免疫共沉淀、質譜分析等相關蛋白組學研究，探討DNAH2蛋白與范可尼貧血的相關性。本實驗也為DNAH2的功能研究提供了更好的蛋白工具，具有一定的實用意義。

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（2016-04-09收稿2016-07-08修回）

（本文編輯魏杰）

The preparation of the mouse monoclonal antibodies specific for the DNAH2 protein

CHANG Lixian，ZHANG Jingliao，REN Yuanyuan，SUN Congcong，WAN Yang，AN Wenbin，
ZHANG Yingchi，YUAN Weiping，ZHU Xiaofan△State Key Laboratory of Experimental Hematology，Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Tianjin 300020，China△

ObjectiveTo prepare specific mouse monoclonal antibodies against Homo sapiens dynein，axonemal，heavy chain 2（DNAH2）.MethodsFirstly，recombinant plasmid encoding His tagged immunogen，targeting N-terminal sequence of DNAH2 protein（1-300 aa），in E.coli was constructed.IPTG was used to induce the expression of Hisimmunogen，which was then purified and immunized in BALB/c mice.Hybridoma cells were obtained through the fusion between myeloma cells and splenocytes isolated from BALB/c mice.Finally，ELISA and Western blot assays were performed to screen the positive hybridoma.ResultsIPTG was used efficiently to induce the expression of DNAH2 immunogen in E.coli.DNAH2 protein bands were detected in screened positive hybridoma.ConclusionMouse monoclonal anti-DNAH2 antibody is prepared successfully.

antibodies，monoclonal；hybridomas；plasmids；recombination，genetic；DNAH2

R341.1，R349.83

A

10.11958/20160317

國家自然科學基金資助項目（81500156，81170470）

天津，中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院血液學研究所（郵編300020）

常麗賢（1984），女，醫(yī)師，博士，主要從事范可尼貧血的相關機制研究

△通訊作者E-mail:xfzhu@ihcams.ac.cn