郭文宇，孔令平，孫姍姍，王宇，趙明慧，周旋，王旭東，張侖

細胞與分子生物學

長鏈非編碼RNA HOTAIR影響人舌鱗癌細胞Tb3.1增殖與凋亡的體內外研究

郭文宇，孔令平，孫姍姍，王宇，趙明慧，周旋，王旭東，張侖△

目的研究長鏈非編碼RNA HOTAIR對人舌鱗癌細胞系Tb3.1增殖與凋亡的影響。方法使用HOTAIR siRNA（siHOTAIR）敲低HOTAIR的表達；實驗分為siHOTAIR組、無義序列組和空白對照組。前2組分別用siHOTAIR和無義序列轉染舌鱗癌細胞，空白對照組細胞不做任何處理。實時定量PCR檢測HOTAIR的表達水平；四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測Tb3.1細胞增殖；Western blot檢測B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、BAX的表達；流式細胞儀檢測細胞凋亡；平板克隆形成實驗檢測細胞增殖情況；并行細胞衰老檢測。動物實驗建立Tb3.1裸鼠皮下荷瘤模型，通過免疫組織化學染色及TUNEL法評價干擾HOTAIR后對Tb3.1細胞增殖、凋亡的作用。結果siHOTAIR處理后HOTAIR的表達水平降低；Western blot結果示Cleaved Caspase-3和BAX表達水平升高，Bcl-2表達水平降低。MTT結果顯示siHOTAIR組細胞增殖受到抑制；流式細胞示siHOTAIR組細胞凋亡升高；細胞衰老實驗顯示siHOTAIR組細胞衰老數(shù)目增加；免疫組化結果顯示，siHOTAIR組較對照組Ki-67、Bcl-2表達減少，Caspase-3、BAX表達增加；TUNEL結果顯示，siHOTAIR組較空白對照組腫瘤細胞凋亡水平升高。結論干擾HOTAIR可以促進舌鱗癌細胞的凋亡并抑制其增殖，HOTAIR可以作為舌鱗癌治療的研究方向。

舌腫瘤；癌，鱗狀細胞；RNA，小分子干擾；細胞增殖；細胞凋亡；HOTAIR

口腔鱗癌居惡性腫瘤發(fā)病率第6位，在全世界每年口腔鱗癌的發(fā)病人數(shù)達500萬例［1-2］。近年來，雖然采用了手術、放化療等綜合性的治療措施，患者的5年生存率仍不到50%［3-4］。腫瘤細胞的增殖和凋亡對于腫瘤進展起重要作用［5］。而口腔鱗癌以舌鱗癌為主，因此研究舌鱗癌細胞的增殖和凋亡對于進一步認識舌鱗癌生物學行為有重要意義。研究表明，長鏈非編碼RNAHOX轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）作為癌基因可通過促進腫瘤細胞增殖、減少細胞凋亡加快腫瘤的進展［6］，但其在舌鱗癌中的作用鮮有報道。本研究旨在通過體內體外實驗探討HOTAIR對舌鱗癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞與試劑人舌鱗癌細胞系Tb3.1受贈于上海交通大學第九人民醫(yī)院。胎牛血清（2 mmol/L L-谷氨酰胺基本培養(yǎng)基）購自美國Hyclone公司。siRNA購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司?；驍U增試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。細胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。BAX抗體購自中國博士德生物工程有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體購自美國CST公司；B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、Ki-67抗體、二抗、三抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。化學發(fā)光底物購自美國Pierce公司。PVDF膜、TUNEL原位凋亡試劑盒購自美國Roche公司。流式細胞檢測細胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。4周齡SPF級雌性裸鼠BALB/C-nu購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，體質量15～18 g，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經病學研究所。

1.1.2 儀器細胞孵箱（美國Thermo公司）。實時定量基因擴增儀CFX96（美國Bio-Rad公司）。激光掃描共聚焦顯微鏡、DP-70倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。流式細胞儀BD FACSCantoⅡ（美國BD公司）。

1.2 細胞研究

1.2.1 細胞培養(yǎng)細胞置于含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組分為3組。siHOTAIR組:HOTAIR干擾序列siHOTAIR轉染舌鱗癌細胞Tb3.1。無義序列組:陰性對照siRNA無義序列轉染舌鱗癌細胞Tb3.1。空白對照組:舌鱗癌細胞Tb3.1不做任何轉染處理。

1.2.3 HTOAIR基因的mRNA表達水平的檢測細胞給予處理后，Trizol提取RNA，逆轉錄合成cDNA。實時定量PCR法將cDNA按照試劑盒配成體系，HOTAIR引物上游:5′-GAGAAAAGGCTGAAATGGAGGACC-3′；下游:5′-TCTTCCCTCCTCTGGCTCTCTCTC-3′。在95℃預變性2 min，95℃15 s，62℃60 s，40個循環(huán)。同時給予內參GAPDH相同處理（引物上游:5′-CTCAAGGGCATCCTGGGCTAC-3′，下游5′-CAGCCCCAGCGTCAAAGGT-3′）。對比內參后檢測siHOTAIR處理舌鱗癌細胞后，HOTAIR敲低的效果。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞存活率取處理后的對數(shù)生長期細胞，以2×103/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板，37℃分別培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，加入10 μL MTT溶液（5 g/L），37℃培養(yǎng)4 h后，2 000 r/min離心10 min，小心吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，于振蕩器上振蕩15 min，在全自動酶標儀上于570 nm處測定光密度（OD）值。細胞存活率=處理組細胞OD值/空白對照組OD值×100%。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測舌鱗癌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、BAX、Cleaved Caspase-3的表達取細胞數(shù)目約6×105個加至6孔板中（約1×104個/cm2），按實驗分組分別處理3組細胞，24 h后提取總蛋白，使用Nanodrop紫外分光光度計測定總蛋白濃度和純度，將所需上樣量的蛋白經電泳、轉膜后，一抗4℃孵育過夜，TBST充分洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，洗去二抗，將化學發(fā)光底物滴加于PVDF膜，膠片曝光成像。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡分別取3組已處理24 h后的細胞，用無EDTA的胰酶消化后，PBS洗2遍，離心，按凱基生物凋亡試劑盒中的方法處理細胞:加入500 μL的binding buffer懸浮細胞，加入5 μL AnnexinV混勻后，加入5 μL Propidium ropidi（PI），混勻，后在流式細胞儀下檢測細胞凋亡，其中只能夠被Annexin V單染的，而無PI染色的為早期凋亡細胞，根據(jù)細胞數(shù)目百分比得出凋亡率。

1.2.7 平板克隆形成實驗檢測細胞增殖情況分別取3組細胞，按1×103/孔密度接種到6孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，待肉眼可見的細胞克隆形成時終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛后，用結晶紫染色10 min，在顯微鏡下分別取4個視野，用血細胞計數(shù)板計數(shù)4次求平均值。

1.2.8 細胞衰老檢測待6孔板中的3組細胞生長24 h后吸除細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細胞固定液，用PBS洗滌細胞3次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液。37℃孵育過夜，用保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)。光學顯微鏡下觀察。

1.3 動物實驗本研究將裸鼠按隨機數(shù)字表法分為3組: siHOTAIR組、無義序列組、空白對照組，每組5只。用帶6號針頭的注射器抽取200 μL經胰酶消化、離心、重懸的細胞懸液，細胞濃度為2×107/mL的Tb3.1單細胞懸液分別注射于上述3組裸鼠左側腹股溝皮下。瘤細胞接種3周后，手術取出皮下荷瘤標本，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，制備厚度4 μm的石蠟切片。

1.3.1 免疫組織化學檢測石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，抗原修復，3%H2O2孵育，胎牛血清封閉，分別滴加Ki-67、Caspase-3、Bcl-2、BAX一抗（1∶200稀釋）。4℃孵育過夜；PBS充分洗滌，加入生物素標記的二抗（1∶100稀釋），37℃孵育1 h；洗去二抗，加入辣根過氧化物酶標記的三抗（1∶100稀釋），37℃孵育1 h；DAB顯色，蘇木素復染，梯度脫水，封片；DP-70倒置顯微鏡采集圖像。根據(jù)抗體著色深度判斷。定性觀察按細胞有無顯色及染色強度計分:細胞無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。

1.3.2 TUNEL實驗檢測細胞凋亡石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，按照TUNEL原位凋亡試劑盒說明書進行檢測。加TUNEL反應混合液，于37℃反應1 h，PBS洗5 min×3次，DAPI染色15 min。水溶性封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像。藍色熒光標記為細胞核，綠色熒光標記為斷裂DNA片段。以顏色的深淺為判斷陰性和陽性的標準，深綠色提示有意義，即為凋亡細胞。通過判斷強染色的細胞數(shù)目來比較凋亡。

1.4 統(tǒng)計學方法使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包處理實驗數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 siHOTAIR下調HOTAIR的表達空白對照組和無義序列組的Tb3.1舌癌細胞HOTAIR表達水平差異無統(tǒng)計學意義，siHOTAIR組的HOTAIR表達水平較空白對照組和無義序列組明顯下降（F= 85.860，n=3，P＜0.01），見圖1。

2.2 Tb3.1細胞存活情況培養(yǎng)72 h時，siHOTAIR組細胞存活率最低，24～120 h時siHOTAIR組細胞存活率均低于空白對照組和無義序列組（均P＜0.05），干擾HOTAIR后細胞的增殖受到抑制；各時點空白處理組與無義序列組差異均無統(tǒng)計學意義，見圖2。

2.3 Tb3.1凋亡相關蛋白的表達siHOTAIR組Cleaved Caspase-3、BAX蛋白表達較空白對照組和無義序列組顯著上調，而Bcl-2蛋白表達顯著下調，見圖3。

Fig.1The relative expression levels of HOTAIR after transfection of siHOTAIR圖1 siHOTAIR處理Tb3.1后HOTAIR的相對表達量

Fig.2Comparison of cell survival rates in different time points between different groups圖2 不同時點各組細胞存活率比較

Fig.3Changes of apoptosis related protein after treatment with siHOTAIR圖3 siHOTAIR處理Tb3.1后凋亡相關蛋白表達水平的改變

2.4 siHOTAIR后腫瘤細胞的凋亡情況siHOTAIR組細胞凋亡率明顯高于空白對照組和無義序列組（n=3，F(xiàn)=36.543，P＜0.01），見圖4。

2.5 siHOTAIR后舌癌細胞的增殖情況平板克隆形成實驗顯示，siHOTAIR組細胞形成克隆的數(shù)目明顯少于空白對照組和無義序列組（F=10.306，n=3，P＜0.01），提示HOTAIR促進Tb3.1細胞的增殖，見圖5、6。

Fig.4Changes of apoptotic rates after treatment with siHOTAIR圖4 siHOTAIR處理后細胞凋亡率的改變

Fig.5Cell clone forming ability after treatment with siHOTAIR圖5 siHOTAIR處理后細胞克隆形成能力

Fig.6The number of Tb3.1 cell clone after treatment with siHOTAIR圖6 siHOTAIR處理Tb3.1后克隆形成數(shù)目

2.6 siHOTAIR后舌癌細胞衰老情況siHOTAIR組較空白對照組和無義序列組細胞衰老增加，抑制HOTAIR表達引起了腫瘤細胞衰老比例增加，見圖7。

2.7 HOTAIR對舌鱗癌生長的影響免疫組織化學染色結果顯示，Ki-67染色空白對照組和無義序列組為深染，siHOTAIR組為淡染。siHOTAIR組較空白對照和無義序列組中Ki-67表達水平下降，腫瘤細胞增殖受到抑制。Bcl-2染色空白對照組和無義序列組為深染，siHOTAIR組為淡染。BAX和Caspase-3染色空白對照組和無義序列組為淡染，siHOTAIR組為深染。siHOTAIR組較空白對照組和無義對照組Bcl-2表達水平降低，BAX、Caspase-3表達水平升高，見圖8。

2.8 HOTAIR對舌鱗癌細胞凋亡的影響TUNEL結果顯示，siHOTAIR組斷裂DNA染色1個視野有12個，空白對照組有2個，無義序列組有2個，提示siHOTAIR組細胞凋亡較空白對照組和無義序列組明顯增加，抑制HOTAIR表達促進腫瘤細胞的凋亡，見圖9。

Fig.7The senescence of Tb3.1 cells after treatment with siHOTAIR（×400）圖7 siHTOAIR處理Tb3.1舌癌細胞后細胞衰老的情況（×400）

3 討論

3.1 HOTAIR不同層面調控腫瘤的進展HOTAIR是長度為2.2 kb堿基的長鏈非編碼RNA，是Hox基因家族成員［7-9］。HOTAIR通過5′末端結合PRC2復合物，通過3′末端結合LSD1/CoREST/REST復合物，引起組蛋白H3K27三甲基化和H3K4去甲基化，進而沉默相關基因，敲低HOTAIR引起SUZ12和LSD1結合的降低，基因的沉默效果受到抑制［10-11］。HOTAIR在乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、頭頸部癌等多種惡性腫瘤中過表達，通過表觀遺傳學的改變引起了一系列基因的上調或下調來影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡、轉移［12］。

3.2 HOTAIR的表達與腫瘤細胞的轉移、增殖、凋亡及不良預后有關HOTAIR在骨肉瘤中過表達，下調HOTAIR可以抑制Ki-67、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉移［13］。有學者發(fā)現(xiàn)，檢測HOTAIR在乳腺癌患者血清中的表達水平對于辨別乳腺癌患者的靈敏度高達80%，特異度達68.3%，同時乳腺癌患者的分級與HOTAIR的表達水平呈正相關，因而HOTAIR在血清中的表達水平可以作為潛在的腫瘤生物學標志；干擾HOTAIR后，間質指標N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、鋅指增強子結合蛋白1（ZEB1）、鋅指轉錄因子（slug）、Twist-1下調，細胞上皮間質轉化（EMT）受到抑制，HOTAIR參與腫瘤細胞EMT［14］。敲低HOTAIR后膠質瘤細胞中的成視網膜細胞瘤蛋白（RB）、p21和p16均上調，S期細胞比例減少，細胞周期停滯［15］，說明HOTAIR影響腫瘤細胞周期。有學者研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中干擾HOTAIR后，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡增加，Western blot證實了抗凋亡基因Bcl-2表達水平降低，促凋亡基因Caspase-3、Caspase-9水平增加，表明HOTAIR參與腫瘤細胞凋亡的調控［16］。

3.3 HOTAIR參與調控舌鱗癌細胞Tb3.1的增殖與凋亡本研究中發(fā)現(xiàn)siHOTAIR轉染Tb3.1舌鱗癌細胞后，HOTAIR表達水平降低，細胞增殖能力下降。siHOTAIR處理細胞后促凋亡基因Cleaved Caspase-3、BAX的表達水平升高，抗凋亡基因Bcl-2的表達水平下降。此外，HOTAIR還能影響舌鱗癌細胞的衰老，干擾HOTAIR表達后細胞衰老比例增加。本研究進一步證實了干擾HOTAIR后，瘤細胞的生長受到抑制、細胞凋亡增加，說明干擾HOTAIR可以抑制舌鱗狀癌細胞的增殖及誘導凋亡。

綜上所述，敲低HOTAIR具有抑制Tb3.1人舌鱗癌細胞增殖、誘導凋亡的作用。本研究為選擇人舌鱗癌細胞基因治療策略提供了實驗依據(jù)；HOTAIR是舌鱗癌細胞基因治療的一個頗具前景的候選靶點。

（圖8、9見插頁）

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（2015-12-16收稿2016-04-08修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of long non-coding RNA HOTAIR on proliferation and apoptosis of human tongue squamous cell carcinoma in vitro and in vivo

GUO Wenyu，KONG Lingping，SUN Shanshan，WANG Yu，ZHAO Minghui，ZHOU Xuan，WANG Xudong，ZHANG Lun△
Department of Maxillofacial&E.N.T（ear，nose，and throat）Oncology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital；National Clinical Research Center of Cancer；Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China△

ObjectiveTo investigate the influence of long non-coding RNA HOTAIR in proliferation and apoptosis of human tongue squamous cell carcinoma in vitro and in vivo.MethodssiHOTAIR was used to inhibit the HOTAIR expression in Tb3.1 human tongue squamous cell carcinoma cell line.The experiments were divided into siHOTAIR group，nonsense sequence group and blank control group.Real-time PCR was used to detect the HOTAIR expression.MTT assay was employed to determine the cell survival.The expression levels of Bcl2，BAX，caspase-3，cleaved caspase-3 were examined by Western blot assay.Tb3.1 xenograft tumor model was established in BALB/c nude mice，and the tumor model was divided into control group，negative group，and siHOTAIR treated group.The tumor tissues were measured by immunohistochemistry stain（IHC）and TUNEL assay.ResultsThe detection of real-time PCR showed that HOTAIR expression was reduced after treated with siHOTAIR.Western blots assay showed that Bcl-2 protein was suppressed while cleaved caspase-3 and BAX protein were up-regulated after treated with siHOTAIR.MTT assay indicated that the cell survival rate was significantly reduced in siHOTAIR treated group.Flow cytometry detected that apoptosis levels were increased in siHOTAIR group.The level of cell senescence was higher in the siHOTAIR group than that of control group. Results of IHC indicated that Ki-67 and Bcl-2 protein of tumor tissue were inhibited，while BAX and cleaved caspase-3protein expressions were elevated simultaneously in the siHOTAIR group.TUNEL assay suggested that more apoptosis was observed in siHOTAIR group.ConclusionHOTAIR can affect proliferation and apoptosis of tongue squamous cancer cells.HOTAIR may be one of the new candidate targets for human tongue cancer therapy.

tongue neoplasms；carcinoma，squamous cell；RNA，small interfering；cell proliferation；apoptosis；HOTAIR

R739.86

A

10.11958/20150403

國家自然科學基金資助項目（81172573）

天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻喉科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（郵編300060）

郭文宇（1990），男，碩士在讀，主要從事頭頸部腫瘤的診治研究

△通訊作者E-mail:Lun_zhang_jing@yahoo.com.cn