段 兵，何太喜，范媛媛，鄭 冰（順德出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 順德 528303）

凝膠滲透色譜-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定茶葉中吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒

段 兵，何太喜，范媛媛，鄭 冰
（順德出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 順德 528303）

建立用凝膠滲透色譜-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定茶葉中吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒殘留的方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液渦旋混勻后超聲提取，經(jīng)凝膠滲透色譜凈化后，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。結(jié)果顯示，2 種農(nóng)藥在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的檢出限分別為2.0 μg/kg和1.0 μg/kg，定量限分別為5.0 μg/kg和3.0 μg/kg。吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒在3 個(gè)水平的加標(biāo)平均回收率為76.94%～91.68%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.67%～7.90%。

吡蟲(chóng)啉；啶蟲(chóng)脒；凝膠滲透色譜；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；茶葉

吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒都屬于煙堿類農(nóng)藥，作用于煙酸乙酰膽堿酯酶受體，干擾害蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲(chóng)菊酯等殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的害蟲(chóng)有很好的殺滅效果[1]。啶蟲(chóng)脒和吡蟲(chóng)啉廣泛用于茶葉生產(chǎn)中，主要用于防治茶樹(shù)小綠葉蟬、飛虱、薊馬等害蟲(chóng)[2]。但近年來(lái)，歐盟的科學(xué)家觀察到煙堿類農(nóng)藥對(duì)蜜蜂的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)有嚴(yán)重傷害[3-5]，因此將限制3 種農(nóng)藥（吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪、噻蟲(chóng)胺）在歐洲使用，此外歐食品安全局也正在重新評(píng)估吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒對(duì)神經(jīng)發(fā)育和功能的不良影響，正加緊出臺(tái)對(duì)這2 種農(nóng)藥更嚴(yán)格的限制措施[6]。目前，吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[7-8]、液相色譜法[9-11]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-21]。農(nóng)殘凈化方式大多采用固相萃取[7-9,11,14-16]或基質(zhì)分散固相萃取[12,17-18]，缺點(diǎn)是耗材成本偏高且通用性不強(qiáng)。凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）是基于體積排阻原理，根據(jù)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的一種凈化手段[22-25]，能有效將茶葉中的色素以及脂類等大分子干擾物和目標(biāo)物分離。本實(shí)驗(yàn)建立了以凝膠滲透色譜為凈化手段，高效液相色-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)茶葉中吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅茶、綠茶、普洱茶、茉莉花茶和烏龍茶均為實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)樣品。

啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純）美國(guó)Sigma公司；環(huán)己烷（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；乙酸乙酯（分析純） 廣州化學(xué)試劑廠。

Quattro Primier XE三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）） 美國(guó)Waters公司；LabTech Autoclean凝膠色譜儀（配Bio-Beads S-X3，20 mm×300 mm凈化?。?美國(guó)萊伯泰科公司；KQ-100DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；Milli-Q純水系統(tǒng) 美國(guó)密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確各稱取10 mg左右（精確到0.1 mg）啶蟲(chóng)脒和吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，－18 ℃保存。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋相應(yīng)質(zhì)量濃度的混標(biāo)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品的處理

稱取5 g樣品，精確到0.01 g，置于50 mL有蓋離心管，加入20 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液渦旋1 min混勻，超聲提取20 min，6 000 r/min離心5 min，上清液倒入雞心瓶，沉淀再加入10 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液重復(fù)提取一次，合并提取液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液定容至8 mL待GPC凈化。

GPC進(jìn)樣量：滿環(huán)進(jìn)樣（5 mL）；流動(dòng)相：乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液；流速：5 mL/min，收集10～17 min餾分。收集餾分旋轉(zhuǎn)蒸干，用乙腈-0.1%甲酸（2∶8，V/V）溶液溶解定容至1.0 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸溶液（20∶80，V/V）；等度洗脫，流速0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源；模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：500 L/h；錐孔氣流量：100 L/h；離子源溫度：110 ℃；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；定量離子、定性離子、裂解電壓及碰撞能量參考值見(jiàn)表1。

表1 吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的母離子、子離子及相對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量Table 1 Precursor ions, product ions, cone voltages and collision energies for imidacloprid and acetamiprid

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

基于目標(biāo)物的極性，本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液4 種溶劑，按1.2.2節(jié)的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，甲醇、乙腈的提取溶液較乙酸乙酯和乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液的顏色淺，共萃物質(zhì)少，但經(jīng)過(guò)GPC凈化后對(duì)收集的餾分進(jìn)行分析，這4 種溶劑的基質(zhì)影響和回收率相差不大，考慮到乙腈的毒性較大且GPC的流動(dòng)相為乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液作為提取溶劑。

2.2 凝膠色譜條件的優(yōu)化

茶葉提取液含有色素、茶多酚和脂多糖等大分子干擾物，因此可以選擇GPC作為凈化手段，采用Bio-Beads S-X3，20 mm×300 mm凈化柱，乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液作為流動(dòng)相，5 mL/min的流速。樣品分析之前，需要確定目標(biāo)物在GPC上的洗脫規(guī)律，將5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（含分析物100 ng，乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液稀釋）過(guò)GP C凈化，從0 min開(kāi)始，每2 min收集一次餾分于一支收集管，共收集10 支。然后分別檢測(cè)各收集管目標(biāo)物含量以繪出洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。從GPC洗脫曲線可以看出，2 種目標(biāo)物在10～17 min流出，因此本實(shí)驗(yàn)收集10～17 min的餾分。

圖1 GPC洗脫曲線Fig.1 GPC elution curve

2.3 方法線性關(guān)系和檢出限

取5 份空白樣品，按1.2.2節(jié)進(jìn)行處理，分別用0.5、1、5、10、50、100 μg/L的2 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL定容，過(guò)濾后上質(zhì)譜分析，以定量離子響應(yīng)強(qiáng)度（y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。同時(shí)做空白樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以每種農(nóng)藥信噪比RSN=3條件下確定為檢出限，以RSN=10條件下確定為定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of detection (LOD,SN= 3), and limits of quantification (LOQ,SN= 10) for imidacloprid and acetamiprid

2.4 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 茶葉中添加吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）TTaabbllee 33 RReeccoovveerriieess aanndd RRSSDDss ooff iimmiiddaacclloopprriidd aanndd aacceettaammiipprriidd ssppiikkeedd into teeaa ((n==66))

圖2 陽(yáng)性樣品和空白樣品添加回收TIICC圖Fig.2 Total ion current (TIC) chromatogram of positive sample (A) and spiked sample (B)

本實(shí)驗(yàn)選擇紅茶樣品在5、10、25 μg/kg三個(gè)水平添加吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，按1.2.2節(jié)處理樣品，每個(gè)水平做6 個(gè)平行，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表3所示。在3 種添加條件下，吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的平均回收率范圍為76.94%～91.68%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.67%～7.90%。結(jié)果比較理想。陽(yáng)性樣品和空白樣品添加回收總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）見(jiàn)圖2。

2.5 樣品分析

按照本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室出口歐盟的紅茶、綠茶、普洱茶、茉莉花茶和烏龍茶樣品各10 個(gè)批次進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：在茉莉花茶和普洱茶中未檢測(cè)出吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒殘留，而紅茶、綠茶和烏龍茶則分別有5、5 批次和3 批次中檢測(cè)出吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的殘留，但其含量均未超出歐盟規(guī)定的吡蟲(chóng)啉低于50 μg/kg和啶蟲(chóng)脒低于100 μg/kg的要求。

3 結(jié) 論

本研究了凝膠滲透色譜作為凈化手段，建立了茶葉中吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒殘留檢測(cè)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法，該方法前處理相對(duì)于固相萃取方法成本較低，同時(shí)對(duì)干擾基質(zhì)的凈化效果比較理想。該方法也可用于分析茶葉中其他一些脂溶性農(nóng)藥殘留的分析。

[1] 趙桂芝. 百種新農(nóng)藥使用方法[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2002: 73.

[2] 岳鉞. 農(nóng)藥新品種及使用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 1985: 180; 193.

[3] 王彥華, 俞瑞鮮, 趙學(xué)平, 等. 新煙堿類和大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲(chóng)劑對(duì)四種赤眼蜂成蜂急性毒性和安全性評(píng)價(jià)[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2012, 55(1): 36-45.

[4] LAYCOCK I, LENTHALL K M, BARRATT A T, et al. Effects of imidacloprid, a neonicotinoid pesticide, on reproduction in worker bumble bees (Bombus terrestris)[J]. Ecotoxicology, 2012, 21(7): 1937-1945. DOI:10.1007/s10646-012-0974-4.

[5] 趙怡楠, 高景林, 王玉潔, 等. 新煙堿類農(nóng)藥對(duì)海南中蜂的急性毒性測(cè)定及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J]. 農(nóng)藥, 2014, 53(3): 206-209.

[6] 陳宗懋, 姜亞萍. 歐食品安全局對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的新評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)茶葉, 2014(2): 1. DOI:10.3969/j.issn.1000-3150.2014.02.001.

[7] 馮楠, 李淑娟, 蔡會(huì)霞, 等. 固相萃取-氣相色譜法測(cè)定蔥中啶蟲(chóng)脒的殘留量[J]. 農(nóng)藥, 2008, 47(10): 759-761. DOI:10.3969/ j.issn.1006-0413.2008.10.022.

[8] 潘永波, 張艷玲. 氣相色譜法測(cè)定香蕉中的噻嗪酮和吡蟲(chóng)啉[J]. 農(nóng)藥, 2013, 52(12): 903-904.

[9] 路海燕, 李斌, 陳忠正, 等. 分散固相萃取-HPLC檢測(cè)綠茶茶湯中吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒殘留[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(20): 203-206. DOI:10. 7506/spkx1002-6630-201320043.

[10] 徐艷, 何健, 季一兵, 等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定中藥材亳菊中多菌靈、吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的殘留量[J]. 分析試驗(yàn)室, 2011, 30(7): 79-82. DOI:10.3969/j.issn.1000-0720.2011.07.020.

[11] 師君麗, 宋春滿, 孔光輝, 等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定煙草中吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒、多菌靈和甲基硫菌靈[J]. 分析試驗(yàn)室, 2012, 31(12): 82-85.

[12] TOMASINI D, SAMPAIO M R, CALDAS S S, et al. Simultaneous determination of pesticides and 5-hydroxymethylfurfural in honey by the modified QuEChERS method and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J]. Talanta, 2012, 99(18): 380-386. DOI:10.1016/j.talanta.2012.05.068.

[13] Y??EZ K P, BERNAL J L, NOZAL M J, et al. Determination of seven neonicotinoid insecticides in beeswax by liquid chromatography coupled to electrospray-mass spectrometry using a fused-core column[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1285(2): 110-117. DOI:10.1016/j.chroma.2013.02.032.

[14] 戴平望. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中5 種農(nóng)藥殘留量[J].理化檢驗(yàn): 化學(xué)分冊(cè), 2014, 50(4): 508-511.

[15] 劉冰, 趙紅霞. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定茶葉中18 種農(nóng)藥殘留[J]. 分析試驗(yàn)室, 2013, 32(10): 77-83.

[16] 胡貝貞, 蔡海江, 宋偉華. 茶葉中氟蟲(chóng)腈等8 種農(nóng)藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定及不確定度評(píng)定[J]. 色譜, 2012, 30(9): 889-895.

[17] 馮永巍, 薛慶海, 汪振炯. 高效液相色譜-串聯(lián)飛行質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中6 種農(nóng)藥的殘留量[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(5): 176-179.

[18] 劉妍慧, 于常紅, 劉巖. 基質(zhì)固相分散萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS-MS)同時(shí)測(cè)定茶葉中11 種農(nóng)藥的殘留量[J]. 茶葉科學(xué), 2014, 34(3): 271-278. DOI:10.3969/j.issn.1000-369X.2014.03.011.

[19] 張海超, 艾連峰, 郭春海, 等. TurboFlow在線凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水果蔬菜中多菌靈、吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒與甲基硫菌靈的殘留量[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2014, 33(3): 295-300. DOI:10.3969/ j.issn.1004-4957.2014.03.009.

[20] 湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局. SN/T 2561—2010 進(jìn)出口食品中吡啶類農(nóng)藥殘留的測(cè)定: 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[21] GBYLIK-SIKORSKA M, SNIEGOCKI T, POSYNIAK A. Determination of neonicotinoid insecticides and their metabolites in honey bee and honey by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2015, 990: 132-140. DOI:10.1016/j.jchromb.2015.03.016.

[22] 廖雅樺, 周冀衡, 穆小麗, 等. 凝膠滲透色譜-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定煙草中50 種農(nóng)藥殘留量[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2010, 36(4): 404-409.

[23] 姚翠翠, 石志紅, 曹彥忠. 凝膠滲透色譜-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物脂肪中164 種農(nóng)藥殘留[J]. 分析試驗(yàn)室, 2010, 29(2): 84-92. DOI:10.3969/j.issn.1000-0720.2010.02.021.

[24] 周相娟, 李偉, 許華, 等. 凝膠滲透色譜技術(shù)及其在食品安全檢測(cè)方面應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代儀器, 2009(1): 1-4.

[25] 劉小文, 吳國(guó)星, 高熹, 等. 幾種新技術(shù)在茶葉農(nóng)藥殘留分析樣品前處理中的應(yīng)用[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 30(增刊1): 210-214.

Determination of Imidacloprid and Acetamiprid in Tea by Gel Permeation Chromatography-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

DUAN Bing, HE Taixi, FAN Yuanyuan, ZHENG Bing
(Shunde Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shunde 528303, China)

A method was developed for the determination of imidacloprid and acetamiprid residues in tea using gel permeation chromatography (GPC)-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Tea samples were extracted with acetonitrile under ultrasonic irradiation and cleaned up with GPC. The elution fractions at retention times between 10 and 17 min were collected for subsequent analysis. The portions collected from GPC were blown to dryness under nitrogen gas stream and then the residue was re-dissolved with acetonitrile-0.1% formic acid. The calibration curves developed were linear in the range of 0.5–100 μg/L with a correlation coefficient higher than 0.99. The limits of detection (LODs) for imidacloprid and acetamiprid were 2.0 and 1.0 μg/kg, and the limits of quantification (LOQs) were 5.0 and 3.0 μg/kg, respectively. The average recoveries of the method at three different spiked levels ranged from 76.94% to 91.68% for imidacloprid and acetamiprid with relative standard deviations (RSDs) from 2.67% to 7.90%.

imidacloprid; acetamiprid; gel permeation chromatography (GPC); ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); tea

10.7506/spkx1002-6630-201604043

O657.63

A

1002-6630（2016）04-0238-04

段兵, 何太喜, 范媛媛, 等. 凝膠滲透色譜-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定茶葉中吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 238-241. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604043. http://www.spkx.net.cn

DUAN Bing, HE Taixi, FAN Yuanyuan, et al. Determination of imidacloprid and acetamiprid in tea by gel permeation chromatography-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2016, 37(4): 238-241. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604043. http://www.spkx.net.cn

2015-04-20

段兵（1977—），男，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：ysdb@hotmail.com