段 兵，何太喜，范媛媛，鄭 冰（順德出入境檢驗檢疫局，廣東 順德 528303）

凝膠滲透色譜-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定茶葉中吡蟲啉和啶蟲脒

段 兵，何太喜，范媛媛，鄭 冰
（順德出入境檢驗檢疫局，廣東 順德 528303）

建立用凝膠滲透色譜-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定茶葉中吡蟲啉和啶蟲脒殘留的方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液渦旋混勻后超聲提取，經(jīng)凝膠滲透色譜凈化后，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。結果顯示，2 種農(nóng)藥在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)R2均大于0.99。吡蟲啉和啶蟲脒的檢出限分別為2.0 μg/kg和1.0 μg/kg，定量限分別為5.0 μg/kg和3.0 μg/kg。吡蟲啉和啶蟲脒在3 個水平的加標平均回收率為76.94%～91.68%，相對標準偏差為2.67%～7.90%。

吡蟲啉；啶蟲脒；凝膠滲透色譜；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；茶葉

吡蟲啉和啶蟲脒都屬于煙堿類農(nóng)藥，作用于煙酸乙酰膽堿酯酶受體，干擾害蟲運動神經(jīng)系統(tǒng)，對有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等殺蟲劑產(chǎn)生抗性的害蟲有很好的殺滅效果[1]。啶蟲脒和吡蟲啉廣泛用于茶葉生產(chǎn)中，主要用于防治茶樹小綠葉蟬、飛虱、薊馬等害蟲[2]。但近年來，歐盟的科學家觀察到煙堿類農(nóng)藥對蜜蜂的運動神經(jīng)有嚴重傷害[3-5]，因此將限制3 種農(nóng)藥（吡蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺）在歐洲使用，此外歐食品安全局也正在重新評估吡蟲啉和啶蟲脒對神經(jīng)發(fā)育和功能的不良影響，正加緊出臺對這2 種農(nóng)藥更嚴格的限制措施[6]。目前，吡蟲啉和啶蟲脒的檢測方法主要有氣相色譜法[7-8]、液相色譜法[9-11]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-21]。農(nóng)殘凈化方式大多采用固相萃取[7-9,11,14-16]或基質(zhì)分散固相萃取[12,17-18]，缺點是耗材成本偏高且通用性不強。凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）是基于體積排阻原理，根據(jù)分子質(zhì)量大小進行分離的一種凈化手段[22-25]，能有效將茶葉中的色素以及脂類等大分子干擾物和目標物分離。本實驗建立了以凝膠滲透色譜為凈化手段，高效液相色-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測茶葉中吡蟲啉和啶蟲脒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅茶、綠茶、普洱茶、茉莉花茶和烏龍茶均為實驗室檢驗樣品。

啶蟲脒、吡蟲啉標準品（純度＞99%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純）美國Sigma公司；環(huán)己烷（色譜純） 美國Tedia公司；乙酸乙酯（分析純） 廣州化學試劑廠。

Quattro Primier XE三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）） 美國Waters公司；LabTech Autoclean凝膠色譜儀（配Bio-Beads S-X3，20 mm×300 mm凈化?。?美國萊伯泰科公司；KQ-100DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；Milli-Q純水系統(tǒng) 美國密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確各稱取10 mg左右（精確到0.1 mg）啶蟲脒和吡蟲啉標準品，分別用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，－18 ℃保存。使用時根據(jù)需要稀釋相應質(zhì)量濃度的混標，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品的處理

稱取5 g樣品，精確到0.01 g，置于50 mL有蓋離心管，加入20 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液渦旋1 min混勻，超聲提取20 min，6 000 r/min離心5 min，上清液倒入雞心瓶，沉淀再加入10 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液重復提取一次，合并提取液后旋轉蒸發(fā)至干，用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液定容至8 mL待GPC凈化。

GPC進樣量：滿環(huán)進樣（5 mL）；流動相：乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液；流速：5 mL/min，收集10～17 min餾分。收集餾分旋轉蒸干，用乙腈-0.1%甲酸（2∶8，V/V）溶液溶解定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液（20∶80，V/V）；等度洗脫，流速0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源；模式：多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：500 L/h；錐孔氣流量：100 L/h；離子源溫度：110 ℃；毛細管電壓：3.0 kV；定量離子、定性離子、裂解電壓及碰撞能量參考值見表1。

表1 吡蟲啉和啶蟲脒的母離子、子離子及相對應的錐孔電壓、碰撞能量Table 1 Precursor ions, product ions, cone voltages and collision energies for imidacloprid and acetamiprid

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

基于目標物的極性，本實驗考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液4 種溶劑，按1.2.2節(jié)的步驟進行實驗，甲醇、乙腈的提取溶液較乙酸乙酯和乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液的顏色淺，共萃物質(zhì)少，但經(jīng)過GPC凈化后對收集的餾分進行分析，這4 種溶劑的基質(zhì)影響和回收率相差不大，考慮到乙腈的毒性較大且GPC的流動相為乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液，因此本實驗采用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液作為提取溶劑。

2.2 凝膠色譜條件的優(yōu)化

茶葉提取液含有色素、茶多酚和脂多糖等大分子干擾物，因此可以選擇GPC作為凈化手段，采用Bio-Beads S-X3，20 mm×300 mm凈化柱，乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液作為流動相，5 mL/min的流速。樣品分析之前，需要確定目標物在GPC上的洗脫規(guī)律，將5 mL混合標準溶液（含分析物100 ng，乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶液稀釋）過GP C凈化，從0 min開始，每2 min收集一次餾分于一支收集管，共收集10 支。然后分別檢測各收集管目標物含量以繪出洗脫曲線，結果見圖1。從GPC洗脫曲線可以看出，2 種目標物在10～17 min流出，因此本實驗收集10～17 min的餾分。

圖1 GPC洗脫曲線Fig.1 GPC elution curve

2.3 方法線性關系和檢出限

取5 份空白樣品，按1.2.2節(jié)進行處理，分別用0.5、1、5、10、50、100 μg/L的2 種農(nóng)藥混合標準溶液各1 mL定容，過濾后上質(zhì)譜分析，以定量離子響應強度（y）對標準溶液質(zhì)量濃度（x）繪制標準曲線，結果顯示，吡蟲啉和啶蟲脒在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關系。同時做空白樣品加標實驗，以每種農(nóng)藥信噪比RSN=3條件下確定為檢出限，以RSN=10條件下確定為定量限，結果見表2。

表2 吡蟲啉和啶蟲脒的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of detection (LOD,SN= 3), and limits of quantification (LOQ,SN= 10) for imidacloprid and acetamiprid

2.4 回收率和精密度實驗結果

表3 茶葉中添加吡蟲啉和啶蟲脒的回收率及相對標準偏差（n=6）TTaabbllee 33 RReeccoovveerriieess aanndd RRSSDDss ooff iimmiiddaacclloopprriidd aanndd aacceettaammiipprriidd ssppiikkeedd into teeaa ((n==66))

圖2 陽性樣品和空白樣品添加回收TIICC圖Fig.2 Total ion current (TIC) chromatogram of positive sample (A) and spiked sample (B)

本實驗選擇紅茶樣品在5、10、25 μg/kg三個水平添加吡蟲啉和啶蟲脒進行回收率實驗，按1.2.2節(jié)處理樣品，每個水平做6 個平行，計算回收率和相對標準偏差。結果如表3所示。在3 種添加條件下，吡蟲啉和啶蟲脒的平均回收率范圍為76.94%～91.68%，相對標準偏差為2.67%～7.90%。結果比較理想。陽性樣品和空白樣品添加回收總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）見圖2。

2.5 樣品分析

按照本實驗方法對實驗室出口歐盟的紅茶、綠茶、普洱茶、茉莉花茶和烏龍茶樣品各10 個批次進行檢測，結果表明：在茉莉花茶和普洱茶中未檢測出吡蟲啉和啶蟲脒殘留，而紅茶、綠茶和烏龍茶則分別有5、5 批次和3 批次中檢測出吡蟲啉和啶蟲脒的殘留，但其含量均未超出歐盟規(guī)定的吡蟲啉低于50 μg/kg和啶蟲脒低于100 μg/kg的要求。

3 結 論

本研究了凝膠滲透色譜作為凈化手段，建立了茶葉中吡蟲啉和啶蟲脒殘留檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法，該方法前處理相對于固相萃取方法成本較低，同時對干擾基質(zhì)的凈化效果比較理想。該方法也可用于分析茶葉中其他一些脂溶性農(nóng)藥殘留的分析。

[1] 趙桂芝. 百種新農(nóng)藥使用方法[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002: 73.

[2] 岳鉞. 農(nóng)藥新品種及使用[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 1985: 180; 193.

[3] 王彥華, 俞瑞鮮, 趙學平, 等. 新煙堿類和大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑對四種赤眼蜂成蜂急性毒性和安全性評價[J]. 昆蟲學報, 2012, 55(1): 36-45.

[4] LAYCOCK I, LENTHALL K M, BARRATT A T, et al. Effects of imidacloprid, a neonicotinoid pesticide, on reproduction in worker bumble bees (Bombus terrestris)[J]. Ecotoxicology, 2012, 21(7): 1937-1945. DOI:10.1007/s10646-012-0974-4.

[5] 趙怡楠, 高景林, 王玉潔, 等. 新煙堿類農(nóng)藥對海南中蜂的急性毒性測定及風險評估[J]. 農(nóng)藥, 2014, 53(3): 206-209.

[6] 陳宗懋, 姜亞萍. 歐食品安全局對吡蟲啉和啶蟲脒的新評價[J]. 中國茶葉, 2014(2): 1. DOI:10.3969/j.issn.1000-3150.2014.02.001.

[7] 馮楠, 李淑娟, 蔡會霞, 等. 固相萃取-氣相色譜法測定蔥中啶蟲脒的殘留量[J]. 農(nóng)藥, 2008, 47(10): 759-761. DOI:10.3969/ j.issn.1006-0413.2008.10.022.

[8] 潘永波, 張艷玲. 氣相色譜法測定香蕉中的噻嗪酮和吡蟲啉[J]. 農(nóng)藥, 2013, 52(12): 903-904.

[9] 路海燕, 李斌, 陳忠正, 等. 分散固相萃取-HPLC檢測綠茶茶湯中吡蟲啉和啶蟲脒殘留[J]. 食品科學, 2013, 34(20): 203-206. DOI:10. 7506/spkx1002-6630-201320043.

[10] 徐艷, 何健, 季一兵, 等. 高效液相色譜法同時測定中藥材亳菊中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的殘留量[J]. 分析試驗室, 2011, 30(7): 79-82. DOI:10.3969/j.issn.1000-0720.2011.07.020.

[11] 師君麗, 宋春滿, 孔光輝, 等. 高效液相色譜法同時測定煙草中吡蟲啉、啶蟲脒、多菌靈和甲基硫菌靈[J]. 分析試驗室, 2012, 31(12): 82-85.

[12] TOMASINI D, SAMPAIO M R, CALDAS S S, et al. Simultaneous determination of pesticides and 5-hydroxymethylfurfural in honey by the modified QuEChERS method and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J]. Talanta, 2012, 99(18): 380-386. DOI:10.1016/j.talanta.2012.05.068.

[13] Y??EZ K P, BERNAL J L, NOZAL M J, et al. Determination of seven neonicotinoid insecticides in beeswax by liquid chromatography coupled to electrospray-mass spectrometry using a fused-core column[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1285(2): 110-117. DOI:10.1016/j.chroma.2013.02.032.

[14] 戴平望. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中5 種農(nóng)藥殘留量[J].理化檢驗: 化學分冊, 2014, 50(4): 508-511.

[15] 劉冰, 趙紅霞. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定茶葉中18 種農(nóng)藥殘留[J]. 分析試驗室, 2013, 32(10): 77-83.

[16] 胡貝貞, 蔡海江, 宋偉華. 茶葉中氟蟲腈等8 種農(nóng)藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定及不確定度評定[J]. 色譜, 2012, 30(9): 889-895.

[17] 馮永巍, 薛慶海, 汪振炯. 高效液相色譜-串聯(lián)飛行質(zhì)譜法測定茶葉中6 種農(nóng)藥的殘留量[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(5): 176-179.

[18] 劉妍慧, 于常紅, 劉巖. 基質(zhì)固相分散萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS-MS)同時測定茶葉中11 種農(nóng)藥的殘留量[J]. 茶葉科學, 2014, 34(3): 271-278. DOI:10.3969/j.issn.1000-369X.2014.03.011.

[19] 張海超, 艾連峰, 郭春海, 等. TurboFlow在線凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水果蔬菜中多菌靈、吡蟲啉、啶蟲脒與甲基硫菌靈的殘留量[J]. 分析測試學報, 2014, 33(3): 295-300. DOI:10.3969/ j.issn.1004-4957.2014.03.009.

[20] 湖南出入境檢驗檢疫局. SN/T 2561—2010 進出口食品中吡啶類農(nóng)藥殘留的測定: 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[21] GBYLIK-SIKORSKA M, SNIEGOCKI T, POSYNIAK A. Determination of neonicotinoid insecticides and their metabolites in honey bee and honey by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2015, 990: 132-140. DOI:10.1016/j.jchromb.2015.03.016.

[22] 廖雅樺, 周冀衡, 穆小麗, 等. 凝膠滲透色譜-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定煙草中50 種農(nóng)藥殘留量[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版), 2010, 36(4): 404-409.

[23] 姚翠翠, 石志紅, 曹彥忠. 凝膠滲透色譜-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物脂肪中164 種農(nóng)藥殘留[J]. 分析試驗室, 2010, 29(2): 84-92. DOI:10.3969/j.issn.1000-0720.2010.02.021.

[24] 周相娟, 李偉, 許華, 等. 凝膠滲透色譜技術及其在食品安全檢測方面應用[J]. 現(xiàn)代儀器, 2009(1): 1-4.

[25] 劉小文, 吳國星, 高熹, 等. 幾種新技術在茶葉農(nóng)藥殘留分析樣品前處理中的應用[J]. 云南大學學報(自然科學版), 2008, 30(增刊1): 210-214.

Determination of Imidacloprid and Acetamiprid in Tea by Gel Permeation Chromatography-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

DUAN Bing, HE Taixi, FAN Yuanyuan, ZHENG Bing
(Shunde Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shunde 528303, China)

A method was developed for the determination of imidacloprid and acetamiprid residues in tea using gel permeation chromatography (GPC)-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Tea samples were extracted with acetonitrile under ultrasonic irradiation and cleaned up with GPC. The elution fractions at retention times between 10 and 17 min were collected for subsequent analysis. The portions collected from GPC were blown to dryness under nitrogen gas stream and then the residue was re-dissolved with acetonitrile-0.1% formic acid. The calibration curves developed were linear in the range of 0.5–100 μg/L with a correlation coefficient higher than 0.99. The limits of detection (LODs) for imidacloprid and acetamiprid were 2.0 and 1.0 μg/kg, and the limits of quantification (LOQs) were 5.0 and 3.0 μg/kg, respectively. The average recoveries of the method at three different spiked levels ranged from 76.94% to 91.68% for imidacloprid and acetamiprid with relative standard deviations (RSDs) from 2.67% to 7.90%.

imidacloprid; acetamiprid; gel permeation chromatography (GPC); ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); tea

10.7506/spkx1002-6630-201604043

O657.63

A

1002-6630（2016）04-0238-04

段兵, 何太喜, 范媛媛, 等. 凝膠滲透色譜-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定茶葉中吡蟲啉和啶蟲脒[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 238-241. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604043. http://www.spkx.net.cn

DUAN Bing, HE Taixi, FAN Yuanyuan, et al. Determination of imidacloprid and acetamiprid in tea by gel permeation chromatography-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2016, 37(4): 238-241. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604043. http://www.spkx.net.cn

2015-04-20

段兵（1977—），男，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：ysdb@hotmail.com