詹少德，邱昌將，朱 盼，吳志華,*，陳紅兵

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；2.浙江紡織服裝職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315200；3.廣東省疾病 預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510300）

花生過敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表達(dá)

詹少德1，邱昌將2，朱 盼3，吳志華1,*，陳紅兵1

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；2.浙江紡織服裝職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315200；3.廣東省疾病 預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510300）

本實(shí)驗(yàn)首先從花生中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)克隆了花生過敏原蛋白Ara h 6全cDNA，并以此為模板擴(kuò)增出Ara h 6目的基因。將目的基因與pMD19-T Simple質(zhì)粒進(jìn)行重組后轉(zhuǎn)入BL21（DE3）宿主表達(dá)菌中，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)，并利用鎳離子親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物。DNA測序結(jié)果顯示Ara h 6基因片段全長為438 bp，編碼145 個(gè)氨基酸，與已知該蛋白DNA序列 97%相同；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量為24 kD，與融合組氨酸標(biāo)簽的重組Ara h 6蛋白理論分子質(zhì)量相符；質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明重組蛋白的一級結(jié)構(gòu)與天然Ara h 6匹配度為100%；Western blotting結(jié)果顯示融合蛋白能夠?yàn)榭笰ra h 6多克隆抗體所識別，具有免疫原性。

花生；過敏原；Ara h 6；基因克隆表達(dá)；質(zhì)譜鑒定

食物過敏是人體對某些食物產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)，可導(dǎo)致多種臨床病癥，嚴(yán)重的會引起過敏性休克甚至死亡等[1-2]。據(jù)相關(guān)的流行病學(xué)研究表明，食物過敏影響約5%兒童及3%～4%成年人的健康，且呈增長趨勢[3]。90%食物過敏反應(yīng)是由花生、魚、貝類、奶、蛋、大豆、堅(jiān)果和小麥等八類高致敏性食物引起[4]。

花生作為食物配料的應(yīng)用十分廣泛，其研究也一直都受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)的花生13 種過敏蛋白中[5]，Ara h 6屬于2S白蛋白家族，約占花生蛋白總含量的4.5%[5]，其分子質(zhì)量約為14.5 kD，生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Ara h 6與花生另一種主要過敏原Ara h 2有59%的氨基酸序列同源性，存在交叉反應(yīng)，可以協(xié)同增加致敏性[6]。Ara h 6結(jié)構(gòu)包括由10 個(gè)半胱氨酸殘基構(gòu)成的5 個(gè)二硫鍵[7]，Ara h 6的線性優(yōu)勢區(qū)域集中在肽段AA10～15、45～48、53～60、116～118區(qū)域；Ara h 6的構(gòu)象型表位優(yōu)勢區(qū)有4 個(gè)，它們存在的區(qū)域?yàn)锳A1～13、35～51、53～59、89～105，而在序列同源性、線性表位和構(gòu)象型表位上，Ara h 6與Ara I 6、落花生conglutin、Ara d 6和落花生conglutin 8都有很高的相似性，它們之間發(fā)生交叉反應(yīng)的概率高達(dá)100%[8-9]。

近年來，Ara h 6已經(jīng)成為人們研究花生過敏領(lǐng)域的重要方面，而獲取高純度的過敏原是研究其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的材料基礎(chǔ)。當(dāng)前以生花生為材料進(jìn)行Ara h 6分離純化的研究工作較多，如Marsh[10]和羅春萍[11]等對花生種子進(jìn)行研磨、粗提、柱層析等步驟純化出了高純度的Ara h 6。而作為制備食物過敏原的另一種重要的手段，重組過敏蛋白的研究也越來越受到重視。相比較天然Ara h 6進(jìn)行規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化制備會受到材料來源的限制，如不同地區(qū)、不同種類花生品種中過敏蛋白含量的差別，重組花生Ara h 6的制備具有更為穩(wěn)定的材料來源。此外，有大量文獻(xiàn)表明[12-14]，重組食物過敏原是天然過敏原的一種替代物，可以應(yīng)用于食物過敏原的檢測以及食物過敏的診斷與治療等方面，因而重組過敏原Ara h 6的制備工作具有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）獲得花生過敏原Ara h 6蛋白基因，原核表達(dá)帶有His標(biāo)簽的Ara h 6蛋白，利用鎳離子親和層析（nickel affinity chromatography，Ni-NTA）進(jìn)行純化獲得融合蛋白，實(shí)現(xiàn)了花生過敏原Ara h 6的生物制備。

1 材料與方法

1.1 材料

花生（江西南昌，湘花品種） 市售。

1.2 兔抗Ara h 6血清的制備

本血清參考羅春萍等[12]方法自制并保存，效價(jià)約為1∶100 000。

1.3 質(zhì)粒、菌株與試劑

質(zhì)粒pMD19-T-Simple、大腸桿菌E. coli DH5α、表達(dá)菌株BL21（DE3）-RIPL、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4連接酶、DNA Marker（DL2000） 日本TaKaRa公司；RT-PCR cDNA第一鏈合成試劑盒 德國Qiagen公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒 美國Omega公司；Ni親和層析預(yù)裝柱（5 mL）、羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗 美國Sigma公司；硝酸纖維素膜 美國Millipore公司；氨芐青霉素、卡那霉素（kan）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 南昌精科生物工程有限公司。

1.4 方法

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)GenBank已報(bào)道的花生過敏原Ara h 6的基因序列，設(shè)計(jì)好一對擴(kuò)增引物，為了便于克隆與表達(dá)，在上游引物5’端引入了BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物5’端引入了EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增的目的基因長度為438 bp，對應(yīng)的蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量約16.9 kD。為了使限制性內(nèi)切酶能夠有效識別酶切位點(diǎn)，切斷DNA，分別在上游引物和下游引物的5’端加入CGC和CCG保護(hù)性堿基（酶切位點(diǎn)用下劃線表示）。上游引物：5’-CGCGGATCCATGGC CAAGTCCACCATCC-3’（BamHⅠ），下游引物：5’-CC GGAATTCTTAGCATCTGCCGCCACTC-3’（EcoRⅠ）。

1.4.2 花生種子總RNA的提取

參照胡純秋等[13]的方法進(jìn)行RNA的提取。

1.4.3 花生Ara h 6基因的RT-PCR擴(kuò)增

按照Skramo等[14]的擴(kuò)增方法，首先進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)體系：10×Reaction Buffer 2.0 ?L、MgCl2（25 mmol/L）4.0 ?L、dNTP（10 mmol/L）2.0 ?L、Oligo（dT）Primer（0.8 ?g/?L）引物2.0 ?L、RNase Inhibitor（50 U/?L） 1.0 ?L、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（≥2.5 U/?L）0.8 ?L、無RNase水5.2 ?L、總RNA樣品3.0 ?L。反應(yīng)條件為：37 ℃孵育60 min，合成cDNA，然后99 ℃變性5 min，最后4 ℃放置5 min。再以此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃變性1 min；68.7 ℃退火1 min；73 ℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系：10×Reaction Buffer 2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL、上游引物（25 μmol/L）和下游引物（25 μmol/L）各2.0 μL，cDNA 2.0 μL、ddH2O 14.2 μL、Taq酶（5 U/μL）0.3 μL。最后以DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并1%凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.4.4 Ara h 6基因的克隆和測序[15]

將純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定純度后，與pMD19-T Simple載體連接，并轉(zhuǎn)入經(jīng)CaCl2處理的E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建克隆載體pMD19-T-Ara h 6，之后再通過含氨芐青霉素的平板過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆子?？寺≥d體采用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，對酶切產(chǎn)物和重組質(zhì)粒進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.5 Ara h 6基因pET-28a表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)Morris等[16]的方法，將測序正確的克隆載體及表達(dá)載體pET-28a，分別用EcoRⅠ和BamHⅠ 雙酶切，之后通過凝膠電泳的方法回收小片段及酶切后的載體。同時(shí)使用T4連接酶對兩個(gè)回收片段進(jìn)行相互連接，并轉(zhuǎn)入E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，通過含卡那霉素的LB平板進(jìn)行篩選，挑菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取陽性質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，并將陽性克隆質(zhì)粒，送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA測序，使用DNAMan軟件（版本號6.0.3.99）對結(jié)果進(jìn)行序列對比分析。

1.4.6 表達(dá)載體在E. coli BL21（DE3）中的表達(dá)及檢測

表達(dá)過程參考Guo等[17]的方法，具體操作為：將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E. coli BL21（DE3）中，轉(zhuǎn)化成功后挑取抗卡那霉素陽性菌落于4 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。第2天取1.5 mL的過夜培養(yǎng)菌液接種于75 mL新鮮培養(yǎng)基中，并繼續(xù)37 ℃振蕩培養(yǎng)，于600 nm波長處測定光密度（OD）值為0.6～0.7，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前的對照，然后加入0、0.05、0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。離心分別收集培養(yǎng)2、3、4、9 h的菌體，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌3 次后，再用該緩沖液溶解和等體積十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）懸浮，100 ℃水浴5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測。

1.4.7 重組產(chǎn)物的純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組質(zhì)粒菌液進(jìn)行超聲波破碎細(xì)胞，并在4 ℃、10 000 r/min離心30 min，取上清，選擇Ni-NTA純化目的蛋白，利用親和柱中鎳離子對組氨酸特異親和作用結(jié)合上樣蛋白液中的目的蛋白，然后使用咪唑洗脫緩沖液（300 mmol/L）洗脫親和柱，收集洗脫液，具體方法按照Amersham公司操作手冊進(jìn)行，分別收取洗脫峰液，SDS-PAGE檢測純化結(jié)果。

1.4.8 質(zhì)譜檢測重組產(chǎn)物

采用串聯(lián)質(zhì)譜對融合蛋白氨基酸序列[18-19]與天然Ara h 6氨基酸序列進(jìn)行對比分析。將純化的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色，將目的條帶割下，加入滅菌蒸餾水，密封，冷凍保存，并送至暨南大學(xué)生命與健康工程研究院功能蛋白質(zhì)中心進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of fl ight mass spectrometry，MALDI-TO F/MS）鑒定。

1.4.9 重組產(chǎn)物的Western blotting檢測

采用Western blotting將融合蛋白轉(zhuǎn)移到膜上[20]，然后使用抗Ara h 6抗體進(jìn)行檢測，獲得融合蛋白與Ara h 6抗體的結(jié)合能力，反映出其免疫原性[21-22]。參考Wang Hua等[22]的方法，將純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析后，進(jìn)行轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，條件為：恒流40 mA，1 h；然后將膜取出，用5%的脫脂乳封阻，37 ℃溫育1 h；用TBST洗滌3 次，每次洗滌10 min，加入1∶3 000稀釋的兔抗Ara h 6血清將膜浸沒，37 ℃溫育1 h；洗滌；加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)羊抗兔IgG二抗，37 ℃溫育1 h；洗滌；最后加入4-氯-1-萘酚顯色5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ara h 6基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、克隆載體、表達(dá)載體的鑒定

采用1.0%瓊脂糖電泳檢測Ara h 6基因的RT-PCR的擴(kuò)增情況，結(jié)果如圖1A所示，分子質(zhì)量在500 bp左右出現(xiàn)了一條較為明亮的條帶，為目的產(chǎn)物條帶，其大小與預(yù)計(jì)Ara h 6基因大小相符合，初步確定為Ara h 6的cDNA片段，且純度很高。對構(gòu)建的pMD19-T-Ara h 6載體進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鑒定（圖1B），結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶切所得的小片段條帶與圖1A中RT-PCR目的電泳條帶一致，分子質(zhì)量接近500 bp，片段大小正確，另一片段載體大小約為3 000 bp，采用DNAMan軟件對送檢陽性克隆質(zhì)粒的基因測序結(jié)果進(jìn)行序列對比分析，結(jié)果顯示序列與已公布的Ara h 6基因序列相似度為97%，由此可證明基本克隆到正確的Ara h 6基因，進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)中重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定Ara h 6a h 6基因表達(dá)體系Fig.1 Agarose gel electrophoresis for identification of the expression system for Ara h 6 gene

圖2 2 Ara h 6a h 6基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of plasmid pET-28a(+)-Ara h 6

使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切重組表達(dá)載體pET-28a（＋）-Ara h 6，構(gòu)建簡圖見圖2。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1C），切出的兩條帶中有分子質(zhì)量接近500 bp大小的酶切片段，與目的基因片段大小相符，另一片段為表達(dá)載體大小，可以認(rèn)為Ara h 6的編碼基因正確的融合到表達(dá)載體上，無其他的基因插入，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 Ara h 6基因的誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物純化

將培養(yǎng)在IPTG 37 ℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)2、3、4、9 h的菌液進(jìn)行破碎，并進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3A所示。與未經(jīng)誘導(dǎo)的對照樣相比，含IPTG誘導(dǎo)的樣品，在約26 kD處有明顯的表達(dá)蛋白條帶，由于該基因誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物連接有pET-28a（＋）上的His-Tag，去掉pET-28a（+）載體的N端含有的硫氧環(huán)蛋白和His標(biāo)簽，近似為Ara h 6蛋白大小16 kD，與理論值相符。另外，也可以看出使用IPTG誘導(dǎo)時(shí)間不同，其表達(dá)量也有所不同。通過QuantityOne凝膠成像軟件分析結(jié)果，顯示使用IPTG誘導(dǎo)2 h有明顯目的蛋白表達(dá)；在誘導(dǎo)4 h后隨著時(shí)間增加，目的蛋白含量無明顯變化。因此可以認(rèn)為使用0.1 mmol/L IPTG對表達(dá)菌進(jìn)行誘導(dǎo)4 h可以獲得較多表達(dá)產(chǎn)物。

基于誘導(dǎo)表達(dá)的重組Ara h 6蛋白為帶有His標(biāo)簽的融合蛋白，利用親和柱中鎳離子對組氨酸特異親和作用結(jié)合上樣蛋白液中的目的蛋白，取各洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3B所示。使用QuantityOne軟件進(jìn)行灰度掃描分析顯示了獲得的重組目的蛋白純度在80%左右。

圖3 重組Ara h 6 SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of recombinant Ara h 6

2.3 Ara h 6基因重組產(chǎn)物的鑒定

對融合蛋白樣品進(jìn)行了MALDI-TOF/MS分析，結(jié)果見圖4。通過對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)純化所得的蛋白與花生過敏原Ara h 6相匹配，重組蛋白的一級結(jié)構(gòu)與Ara h 6匹配度為100%。

圖4 重組蛋白Ara h 6質(zhì)譜鑒定Fig.4 MALDI-TOF/MS spectrum of recombinant Ara h 6

圖5 重組Ara h 6蛋白Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of recombinant Ara h 6

親和層析純化的融合蛋白經(jīng)過轉(zhuǎn)膜之后與兔抗天然Ara h 6血清反應(yīng)，在目標(biāo)蛋白處有明顯特異性印跡，而與兔陰性血清反應(yīng)無任何印跡出現(xiàn)（圖5），該結(jié)果表明該重組蛋白具有免疫原性，保持生物活性。

3 討 論

花生過敏反應(yīng)是人體對花生過敏原產(chǎn)生的由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，對于過敏患者具有終身過敏的特點(diǎn)[17]。鑒于融合花生過敏蛋白可以作為天然過敏原的一種替代物，特別是用于過敏蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的制備，因此研究中獲得結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與天然產(chǎn)物高度一致的融合過敏蛋白Ara h 6具有重要的意義。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是開發(fā)最早、技術(shù)最成熟的外源蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)[20]。pET系列質(zhì)粒因其克隆表達(dá)融合蛋白的高效性以及帶有多種可選擇的融合標(biāo)簽，是目前應(yīng)用最廣泛的原核表達(dá)載體系統(tǒng)[23]。pET-28a作為其中一種質(zhì)粒其效果穩(wěn)定、靈敏度高尤其表達(dá)產(chǎn)物的量多，因此本實(shí)驗(yàn)中采用該質(zhì)粒作為表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)利用瓊脂糖凝膠電泳分別對RT-PCR擴(kuò)增的基因產(chǎn)物、克隆載體pMD19-T-Ara h 6以及表達(dá)載體pET-28a（＋）-Ara h 6進(jìn)行鑒定（圖1），皆可見低于500 bp大小的特異性擴(kuò)增條帶，與目的基因大小符合，表明成功獲得Ara h 6基因、Ara h 6克隆載體以及Ara h 6表達(dá)載體?；蛐蛄袑Ρ冗M(jìn)一步確定得到的克隆載體具有正確的Ara h 6基因序列，表明成功構(gòu)建Ara h 6基因表達(dá)體系，為融合Ara h 6蛋白的表達(dá)純化奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌BL21（DE3）作為工程菌，并探索IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對融合蛋白的表達(dá)的影響，結(jié)果顯示0.1 mmol/L IPTG于37 ℃誘導(dǎo)4 h，培養(yǎng)的工程菌可以獲得較高量的融合蛋白的表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白因其上攜帶His的標(biāo)簽，本研究采用Ni-NTA進(jìn)行親和純化，提純目的蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示純化后的目的蛋白的純度可達(dá)到80%。為進(jìn)一步確定表達(dá)出的融合產(chǎn)物的蛋白的結(jié)構(gòu)，可以選擇質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的檢測[24]。Wu Zhihua等[25]在融合花生Ara h 1的研究中運(yùn)用此技術(shù)，將表達(dá)的融合蛋白與Ara h 1一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，進(jìn)一步確定表達(dá)出融合花生Ara h 1蛋白。本實(shí)驗(yàn)中利用質(zhì)譜對純化的融合蛋白進(jìn)行檢測，通過與數(shù)據(jù)庫中Ara h 6結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白的一級結(jié)構(gòu)與Ara h 6匹配度為100%，這表明研究成功合成融合Ara h 6蛋白。另一方面，Western blotting可以檢測抗原抗體之間的特異性結(jié)合能力[26]。選擇相應(yīng)的抗體用來確定過敏原蛋白與之結(jié)合能力的強(qiáng)弱，用來反映獲得的目的蛋白的生物活性和免疫原性。本實(shí)驗(yàn)中以抗Ara h 6兔血清為抗體，檢測純化的融合蛋白與其特異性結(jié)合能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該融合和蛋白與抗Ara h 6兔血清有很強(qiáng)的結(jié)合能力，表明表達(dá)的融合蛋白具有非常好的免疫原性。

因此，本研究成功表達(dá)出了花生Ara h 6融合蛋白，該融合蛋白與兔抗Ara h 6有較好的特異性結(jié)合能力。研究成果對利用融合蛋白進(jìn)行免疫檢測、食物過敏的診斷以及過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備有積極的意義。

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Gene Cloning and Prokaryotic Expression of Peanut Allergen Ara h 6

ZHAN Shaode1, QIU Changjiang2, ZHU Pan3, WU Zhihua1,*, CHEN Hongbing1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Zhejiang Fashion Institute of Technology, Ningbo 315200, China; 3. Center for Disease Control and Prevention of Guangdong Province, Guangzhou 510300, China)

Ara h 6 is one of the major peanut allergens. Ara h 6 cDNA was synthesized from total RNA using Oligo primers by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) in order to provide a template for the PCR amplifi cation of Ara h 6 gene. The target gene was cloned into pMD19-T vector to construct a recombinant vector. Then the recombinant vector was transferred into the bacterial expression host BL21 (DE3). IPTG was used t o induce protein expression, and the expressed product was purifi ed by Ni affi nity chromatography. DNA sequence analysis showed that the full-length gene fragment of Ara h 6 was 438 bp and encoded 145 amino acids, which was 97% identical to the known DNA sequence. Sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis (SDS-PAGE) results showed that the molecular weight of the expressed fragment was 24 kD, which matched with the theoretical value of the His-tagged fusion recombinant protein Ara h 6. Mass spectrometric results showed that the matching degree of structure was 100% between the recombinant protein and natural Ara h 6. Western blotting indicated that the protein could be recognized by anti-Ara h 6 polyclonal antibody, and has strong immunogenicity.

peanut; allergen; Ara h 6; recombinant expression; mass spectrometry

10.7506/spkx1002-6630-201603024

TS207.2

A

1002-6630（2016）03-0125-06

詹少德, 邱昌將, 朱盼, 等. 花生過敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表達(dá)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 125-130. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603024. http://www.spkx.net.cn

ZHAN Shaode, QIU Changjiang, ZHU Pan, et al. Gene cloning and prokaryotic expression of peanut allergen Ara h 6[J]. Food Science, 2016, 37(3): 125-130. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6 630-201603024. http://www.spkx.net.cn

2015-03-26

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAK10B03）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102205）；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（20133BBF60004）

詹少德（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：universitync@163.com

*通信作者：吳志華（1976—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：wuzhihua@ncu.edu.cn