陳信全，都立輝，鞠興榮,,*，吳學(xué)友，袁 建，何 榮

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

乳酸片球菌素PA-1在大腸桿菌中的表達(dá)與純化

陳信全1，都立輝1，鞠興榮1,2,*，吳學(xué)友2，袁 建1，何 榮1

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

為了實(shí)現(xiàn)該細(xì)菌素的外源表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)首先利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從乳酸片球菌PAF中擴(kuò)增出乳酸片球菌素PA-1的結(jié)構(gòu)和免疫基因，然后克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1，構(gòu)建了N端含有GST-His-DDDDK標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pGEX/ his-pedAB，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)，重組乳酸片球菌素PA-1在大腸桿菌胞內(nèi)成功表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白先經(jīng)過(guò)鎳親合層析柱純化，然后注入谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶親和色譜柱用腸激酶處理，釋放出成熟的乳酸片球菌素PA-1。利用高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)乳酸片球菌素PA-1純度。以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CMCC54004為指示菌，利用瓊脂擴(kuò)散法檢驗(yàn)乳酸片球菌素PA-1活性。結(jié)果表明，攜帶GST-His-DDDDK標(biāo)簽的融合蛋白無(wú)活性，標(biāo)簽切除后其抑菌活性恢復(fù)，且其純度達(dá)90%以上。

細(xì)菌素；乳酸片球菌素；原核表達(dá)；蛋白純化

乳酸菌細(xì)菌素是由乳酸菌代謝過(guò)程產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)[1]。它們可被人體生物降解和消化，對(duì)健康無(wú)害。大部分乳酸菌細(xì)菌素對(duì)熱穩(wěn)定，具有高等電點(diǎn)和親水特性[2]。最近將乳酸菌細(xì)菌素分為三大類：Ⅰ類細(xì)菌素為含有修飾氨基酸的多肽；Ⅱ類細(xì)菌素為不含修飾氨基酸的多肽；Ⅲ類細(xì)菌素為大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)[3]。Ⅱ類細(xì)菌素包括4 個(gè)亞類，其中Ⅱa類細(xì)菌素為目前成員最多、研究較為深入的一類細(xì)菌素[3-4]。這類細(xì)菌素普遍對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌有強(qiáng)烈抑制作用。近年來(lái)世界范圍內(nèi)發(fā)生多起由單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引起的中毒事件，具有很大的危害性，使得預(yù)防和控制食品中的李斯特氏菌成為關(guān)注的熱點(diǎn)。

乳酸片球菌素PA-1是由乳酸片球菌產(chǎn)生的已被廣泛研究的一種典型Ⅱa類細(xì)菌素[5-7]，成熟的乳酸片球菌素PA-1是由44 個(gè)氨基酸殘基和2 個(gè)二硫鍵組成。其操縱子包含pedA、pedB、pedC、pedD 4 個(gè)基因，即結(jié)構(gòu)基因、免疫基因、分泌基因、加工基因[8]。因其具有強(qiáng)烈的抗李斯特氏菌活性而獲得廣泛關(guān)注[9]。天然的細(xì)菌素資源有限、純化困難，不足以進(jìn)行抑菌作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系及開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究?；瘜W(xué)合成的細(xì)菌素成本高、活性不穩(wěn)定，難以滿足細(xì)菌素相關(guān)研究和實(shí)際應(yīng)用的需求。因此通過(guò)基因重組表達(dá)得到大量細(xì)菌素是低成本、高效益的方法[10-11]。由于大腸桿菌（Escherichia coli）培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、價(jià)格低廉，且表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他基因表達(dá)系統(tǒng)。因此E. coli是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，采用E. coli表達(dá)系統(tǒng)獲得細(xì)菌素已成為研究者的首選[12]。另外，由于細(xì)菌素一般為小分子多肽，因此通常以融合蛋白的方式表達(dá)，這不僅可避免抗菌肽對(duì)宿主的毒性作用，也保護(hù)了抗菌肽免受蛋白酶降解[13]。融合蛋白形成以后通過(guò)酶解法或化學(xué)裂解方法切除標(biāo)簽蛋白獲得成熟細(xì)菌素。早在1998年，Miller等[14]就利用PMAL-p2x載體在E. coli中分泌表達(dá)了麥芽糖結(jié)合蛋（maltose binding protein，MBP）-pediocin AcH，并發(fā)現(xiàn)該融合蛋白具有與天然乳酸片球菌素AcH相似的生物學(xué)活性。Moon等[15]將乳酸片球菌素PA-1成熟肽基因與帶有組氨酸標(biāo)簽蛋白His-tag的倉(cāng)鼠二氫葉酸還原基因序列融合，在E. coli細(xì)胞質(zhì)內(nèi)成功表達(dá)了無(wú)活性的His-tag-倉(cāng)鼠二氫葉酸還原酶-乳酸片球菌素PA-1，純化后的融合細(xì)菌素經(jīng)Xa因子蛋白酶酶切恢復(fù)乳酸片球菌素PA-1活性。韓燁等[16]將乳酸片球菌素Ped-A基因克隆到pET-28a中，經(jīng)誘導(dǎo)在E. coli中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌有抗菌作用。

本研究采用基因工程技術(shù)，將乳酸片球菌素PA-1成熟肽基因，與表達(dá)載體pGEX-6p-1中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）基因的核苷酸序列融合，在E. coli細(xì)胞質(zhì)內(nèi)成功表達(dá)了可溶性的融合蛋白GST-His-DDDDK-Pediocin PA-1，通過(guò)兩步親和色譜從細(xì)胞破碎液中分離獲得重組乳酸片球菌素PA-1，最后用腸激酶處理除去重組乳酸片球菌素PA-1上的標(biāo)簽蛋白，獲得具有抗李斯特氏菌活性的乳酸片球菌素PA-1，以期獲得片球菌素的高效表達(dá)，對(duì)片球菌素的深入研究和廣泛應(yīng)用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與載體

乳酸片球菌PAF、E. coli DH5α菌株、表達(dá)菌株E. coli Rosetta（DE3）和表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）CMCC54004江蘇省疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)；pEASY-Blunt載體北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 試劑

透析袋 北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、HSTMMix、DNA Ligation Kit、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒 日本TaKaRa公司；DSTM5000 DNA Marker 廣州東盛生物科技有限公司；多功能DNA純化回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒（離心柱型） 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素美國(guó)Ameresco公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 美國(guó)BioBasic公司；寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker 天根生化科技（北京）有限公司；HisTrap HP、GSTrap 4B親和色譜柱 美國(guó)GE公司；腸激酶、磷酸氫二鈉、咪唑生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

梯度PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；THZ-D型恒溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；JY92-II超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；?KTA蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；恒溫金屬浴 美國(guó)Torrey Pines Scientific公司；瞬時(shí)低速離心機(jī) 美國(guó)Cubee GeneReach公司；微型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

常規(guī)生物學(xué)操作參照《分子克隆手冊(cè)進(jìn)行》[17]方法進(jìn)行。

1.3.1 乳酸片球菌素PA-1基因克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中乳酸片球菌素PA-1基因的序列（HQ876214.1），設(shè)計(jì)引物P1：5’-AT G G C C A ATAT C AT T G G T G G TA A ATAC TAC G GTAATGGGG-3’和引物P2：5’-CCGCTCGAGT TACCACGTATTGGTAGTATCTAGC-3’，該引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以乳酸片球菌PAF新鮮過(guò)夜培養(yǎng)菌液為模板，從乳酸片球菌PAF中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增PA-1的基因片段[18]，該片段由結(jié)構(gòu)基因和免疫基因（pedAB）組成。PCR反應(yīng)體系如下：HSTMMix 25 μL；引物P1、P2各1 μL（終濃度1 μmol/L）；乳酸片球菌PAF新鮮菌液2 μL；加雙蒸水至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR反應(yīng)液進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收純化后與pEASY-Blunt載體連接，構(gòu)建克隆載體pEASY/pedAB。將pEASY/pedAB轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性克隆，接種在LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL的氨芐青霉素）過(guò)夜培養(yǎng)后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。提取測(cè)序正確質(zhì)粒pEASY/pedAB做二次PCR模板。

1.3.2 表達(dá)載體pGEX/his-pedAB的構(gòu)建

根據(jù)pGEX-6p-1質(zhì)粒多克隆區(qū)的酶切位點(diǎn)和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中乳酸片球菌素PA-1成熟肽基因及免疫基因序列（HQ876214.1）設(shè)計(jì)引物：P3：5’-GCTGGATCC CACCATCATCATCATCATGACGACGAC GA CAAGAAATACTACGGTAATGGGGTTACTTG TG-3’；P4：5’-CCGCTCGAGTTACCACGTATT GGTAGTATCTAGCATGTTAA-3’，下劃線分別表示引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，粗體字表示His標(biāo)簽和腸激酶酶切位點(diǎn)。融合蛋白順序?yàn)椋篏ST-His×6-DDDDKPediocin PA-1。以測(cè)序正確pEASY/pedAB為模板，P3、P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物回收、純化后進(jìn)行Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物連接到同樣雙酶切的pGEX-6p-1載體，構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-6p-1/pedAB。轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將基因測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/pedAB轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coli Rosetta（DE3）。1.3.3 重組乳酸片球菌素PA-1的誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化

將含陽(yáng)性質(zhì)粒pGEX-6p-1/pedAB的重組菌單菌落，接種于裝有LB液體培養(yǎng)基（含終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素）的三角瓶中，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，直至OD600nm值為0.6～0.8。向三角瓶中加入終濃度為1 mol/L的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，采集1 mL菌體懸浮液離心后取菌體進(jìn)行細(xì)菌總蛋白組分的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)[19]，剩下菌液在8 000×g條件下離心5 min收集菌體，用生理鹽水清洗菌體2 次。用發(fā)酵液初始體積1%的結(jié)合緩沖液（含有500 mol/L NaCl、20 mol/L Na3PO4和20 mol/L 咪唑的水溶液，pH 7.4）懸浮菌體，置于冰水混合物中超聲破碎菌體細(xì)胞，直至菌體溶液澄清，得到菌體裂解液。將菌體裂解液離心（15 000×g，4 ℃，30 min），取上清，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，得到重組乳酸片球菌素PA-1粗提液，對(duì)粗提液蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

粗提液上樣于His Trap HP 親和層析凝膠柱，10 mL結(jié)合緩沖液（500 mol/L NaCl、20 mol/L Na3PO4、20 mol/L咪唑，pH 7.4）清洗柱子，用5～10 倍體積的洗脫緩沖液（500 mol/L NaCl、20 mol/L Na3PO4、500 mol/L咪唑，pH 7.4）洗脫，收集洗脫峰部分的洗脫液進(jìn)行第二步純化。取100 ?L進(jìn)行SDS-PAGE分析及活性檢驗(yàn)。將剩余洗脫緩沖液注入預(yù)先處理過(guò)的截留分子質(zhì)量為7 000 D的透析袋中，用大量的GSTtrap 4B結(jié)合緩沖液（140 mol/L NaCl、2.7 mol/L KCl、10 mol/L Na2HPO4、1.8 mol/L KH2PO4，pH 7.4）對(duì)其進(jìn)行透析過(guò)夜。透析后樣品經(jīng)12 000×g離心 20 min后取上清液，注入已用結(jié)合緩沖液平衡好的GSTtrap 4B親和色譜柱。用約10 mL GSTtrap結(jié)合緩沖液洗到基線穩(wěn)定，最后用約10 mL的腸激酶酶切緩沖液（25 mol/L Tris-HCl、50 mol/L NaCl、2 mol/L CaCl2、pH 7.6）平衡柱子。將1 mL腸激酶mix（160 U腸激酶溶解在920 ?L 4 ℃腸激酶酶切緩沖液里）注入GSTtrap 4B親和色譜柱，然后將上下堵頭擰上，置于25 ℃水浴16 h。將親和色譜柱重新接上?KTA蛋白純化系統(tǒng)，用5 mL酶切緩沖液洗脫被切下來(lái)的游離細(xì)菌素，收集到樣品送到交蘇州普泰生物技術(shù)有限公司，采用Nano液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography electrospray ionization tandam mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）進(jìn)行鑒定。

1.3.4 細(xì)菌素活性鑒定和純度測(cè)定

以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為指示劑，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)表達(dá)片球菌素的活性[20]。取10 ?L樣品（經(jīng)0.22 ?m濾膜過(guò)濾除菌）注入接種有體積分?jǐn)?shù)為0.5%的新鮮過(guò)夜單核細(xì)胞增生李斯特菌菌液（37 ℃條件下培養(yǎng)16 h）的BHI固體平板上的瓊脂孔（約3 mm）中，在超凈工作臺(tái)上靜止1 h后，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h，觀察抑菌圈。以純化融合乳酸片球菌素PA-1為對(duì)照，檢驗(yàn)酶切分離的乳酸片球菌素PA-1活性。

通過(guò)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)分離的乳酸片球菌素PA-1純度。HPLC的檢測(cè)條件為：色譜柱：Gemini-NX交換柱；流動(dòng)相：三氟醋酸-乙腈（1∶1 000，V/V）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸片球菌素PA-1基因的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

圖1 乳酸片球菌素PPAA--11結(jié)構(gòu)基因和免疫基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification products of structural and immunity genes of pediocin PA-1

由圖1可知，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析表明約500 bp處有明顯的擴(kuò)增條帶，同預(yù)期目的片段（532 bp）大小相符。回收目的片段克隆至平端載體pEASY-Blunt，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pEASY/pedAB，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，挑單克隆菌過(guò)夜培養(yǎng)送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，結(jié)果顯示序列100%匹配，說(shuō)明成功從乳酸片球菌中擴(kuò)增出乳酸片球菌素PA-1結(jié)構(gòu)基因及免疫基因。

圖2 表達(dá)載體pGEX-6p-1/pedAB的構(gòu)建過(guò)程Fig.2 Construction of the expression vector pGEX-6p-1/pedAB

利用克隆質(zhì)粒pEASY/pedAB作為模板，進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增乳酸片球菌素PA-1成熟結(jié)構(gòu)基因及免疫基因且在其上下游分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增片段經(jīng)雙酶切后連接入載體pGEX-6p-1構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-6p-1/pedAB（圖2）。轉(zhuǎn)化E. coli DH5α挑陽(yáng)性單克隆菌過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ、XhoⅠ單、雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示：?jiǎn)蚊盖械玫? 513 bp片段（泳道2和3）；雙酶切產(chǎn)生4 870 bp和550 bp兩條條帶（泳道4），分別對(duì)應(yīng)線性表達(dá)載體pGEX-6p-1和插入目的基因大小，說(shuō)明融合基因his-pedAB成功插入表達(dá)載體pGEX-6p-1。且該陽(yáng)性克隆質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確、無(wú)突變現(xiàn)象，表明乳酸片球菌素PA-1的表達(dá)載體成功構(gòu)建。

圖3 重組質(zhì)粒pGEX/His-pedAB的酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Results of double enzyme digestion of recombinant plasmid pGEX/His-pedAB

2.2 重組乳酸片球菌素PA-1的誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化

圖4 融合片球菌素PA-1表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant pediocin PA-1

對(duì)發(fā)酵液及其超聲破碎上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示，泳道1和2在34 kD處有明顯的表達(dá)蛋白條帶，與預(yù)測(cè)的融合片球菌素大小相當(dāng)，發(fā)酵液中檢測(cè)出同樣的蛋白條帶說(shuō)明表達(dá)可溶。對(duì)表達(dá)菌體的破碎上清液采用HisTrap親和色譜柱分離純化結(jié)果如圖5所示，洗脫過(guò)程產(chǎn)生單一洗脫峰，說(shuō)明重組菌表達(dá)了大量含His標(biāo)簽的融合蛋白。分離純化后融合蛋白用SDS-PAGE分析結(jié)果如圖4的泳道3，同樣出現(xiàn)與泳道1、2大小相同的目的蛋白條帶，表明融合片球菌素在E. coli成功表達(dá)。隨后利用GSTtrap 4B色譜柱對(duì)HisTrap柱純化蛋白進(jìn)行第二步純化，且對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)行腸激酶酶處理從而分離出乳酸片球菌素PA-1。取純化后的乳酸片球菌素PA-1樣品送往蘇州普泰生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Nano LCESI-MS/MS 鑒定，鑒定結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)，證實(shí)與乳酸片球菌素PA-1序列完全一致。

圖5 融合片球菌素的PA-1 HisTrap HP柱分離色譜Fig.5 Saparation chromatogram of recombinant pediocin PA-1 by HisTrap HP affinity column

2.3 表達(dá)細(xì)菌素活性鑒定和純度

以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為指示菌，利用瓊脂擴(kuò)散法鑒定表達(dá)融合片球菌素PA-1和酶切分離后的完整細(xì)菌素活性。結(jié)果如圖6所示，融合片球菌素并無(wú)明顯抑制李斯特氏菌活性，而酶切去除標(biāo)簽蛋白后的片球菌素恢復(fù)抑菌活性。高效液相色譜測(cè)定經(jīng)兩步色譜純化后的片球菌素純度達(dá)到90%以上（圖7）。

圖6 表達(dá)細(xì)菌素抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活性Fig.6 Anti-Listeria activity of the expressed pediocin PA-1

圖7 片球菌素PA-1的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of pediocin PA-1

3 結(jié)論與討論

E. coli是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，采用E. coli表達(dá)系統(tǒng)獲得細(xì)菌素已成為研究者的首選[12]。本實(shí)驗(yàn)探索了一種將GST與細(xì)菌素相融合來(lái)高效表達(dá)乳酸片球菌PA-1的新方法。GST作為融合蛋白表達(dá)載體，有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解，提高其穩(wěn)定性、可溶性，并可作為標(biāo)簽，通過(guò)親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物。通過(guò)在GST和目的蛋白間引入His標(biāo)簽以實(shí)現(xiàn)表達(dá)融合蛋白的兩步純化，使所表達(dá)片球菌素純度達(dá)90%以上，為片球菌的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理深入研究奠定了基礎(chǔ)。

GST融合的片球菌素?zé)o活性，經(jīng)酶切去除標(biāo)簽蛋白后的片球菌素恢復(fù)抑菌活性。這可能由于GST包含的半胱氨酸干擾片球菌中自身半胱氨酸間的二硫鍵形成，從而改變了片球菌素的原來(lái)結(jié)構(gòu)。乳酸片球菌素PA-1氨基酸序列含有4 個(gè)半胱氨酸，分別在N端與C端形成一個(gè)二硫鍵[21]。而研究表明二硫鍵對(duì)Ⅱa類細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)和活性非常關(guān)鍵[6,22]。同樣的現(xiàn)象被Gibbs[23]、Moon[15]、趙愛(ài)珍[24]等揭示。

本研究在原核表達(dá)系統(tǒng)E. coli中成功實(shí)現(xiàn)了乳酸片球菌素PA-1的可溶性表達(dá)，為Ⅱa類細(xì)菌素的表達(dá)與純化研究提供有力的數(shù)據(jù)支撐。

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Expression and Purification of Pediocin PA-1 in Escherichia coli

CHEN Xinquan1, DU Lihui1, JU Xingrong1,2,*, WU Xueyou2, YUAN Jian1, HE Rong1
(1. Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing of Jiangsu Higher Education Institutions, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China; 2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Pediocin PA-1 is a representative class IIa bacteriocin produced by Pediococci with the potential to serve as a food-grade preservative for controlling Listeria contamination. To obtain its soluble expression, Pediocin PA-1 structural and immunity gene pedAB was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from Pediococcus acidilactici PAF, and cloned into the vector pGEX-6p-1 to construct the pGEX/his-pedAB encoding the recombinant pediocin PA-1 with GST-His-DDDDK in the N-terminal of pediocin PA-1. The plasmid pGEX/his-pedAB was then transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3). After induction with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, the recombinant pediocin PA-1 was successfully expressed in E. coli cytoplasm. The expressed fusion protein was purified by Ni-NTA metal affinity chromatography, subsequently loaded to GST affinity column and treated with recombinant bovine enterokinase. Mature pediocin PA-1 was liberated from the recombinant protein. The purity of pediocin PA-1 was detected by high-performance liquid chromatography and mass spectrometry. The antibacterial activity of pediocin PA-1 was determined by agar diffusion method using Listeria monocytogenes CMCC54004 as an indicator. The results showed that fusion pediocin PA-1 did not have bactericidal activity against Listeria monocytogenes, but when the GST-His-DDDDK in the N-terminal was removed, the cleaved pediocin PA-1 restored its bactericidal activity. The purified pediocin PA-1 had a purity above 90%.

bacteriocin; pediocin; prokaryotic expression; protein purification

10.7506/spkx1002-6630-201603019

TS201.2

A

1002-6630（2016）03-0097-06

陳信全, 都立輝, 鞠興榮, 等. 乳酸片球菌素PA-1在大腸桿菌中的表達(dá)與純化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 97-102. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603019. http://www.spkx.net.cn

CHEN Xinquan, DU Lihui, JU Xingrong, et al. Expression and purification of pediocin PA-1 in Escherichia coli[J]. Food Science, 2016, 37(3): 97-102. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603019. http://www.spkx.net.cn

2015-04-24

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271930）；江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項(xiàng)目（KYLX_1167）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CXZZ13_0636）

陳信全（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：sincher-chen@foxmail.com

*通信作者：鞠興榮（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)、功能食品及農(nóng)產(chǎn)品精深加工。E-mail：xingrongju@163.com