李慕紫，王慶華*，王曉藝，何 云

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

苯甲酸及其類似物與酪氨酸酶分子對接研究

李慕紫1，王慶華2,*，王曉藝1，何 云1

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

以AutoDock 4.2和iGEMDOCK 2.1分子對接軟件對13 種苯甲酸類似物與酪氨酸酶進(jìn)行模擬對接研究，探討苯甲酸類似物對接結(jié)合自由能與實(shí)驗(yàn)測得的酶抑制活性的關(guān)系，并對分子對接結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明：AutoDock 4.2程序中Cu電荷數(shù)的設(shè)置對結(jié)合自由能有顯著影響，銅電荷數(shù)為2.0時(shí)，苯甲酸類似物結(jié)合自由能和pIC50（－lgIC50）線性相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.803 6。iGEMDOCK 2.1預(yù)測苯甲酸類似物的結(jié)果線性較差，即AutoDock 4.2較iGEMDOCK 2.1預(yù)測酪氨酸酶抑制劑的可靠性更高。

酪氨酸酶；苯甲酸；抑制劑；分子對接

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多亞基含銅氧化還原酶，是人體黑色素合成的限速酶，通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成[1]，可預(yù)防和治療色素沉著、黑色素瘤等疾病，在化妝品領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用，使得越來越多的酪氨酸酶抑制劑得到研究開發(fā)[2-3]。

隨著計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的深入，分子對接的應(yīng)用越來越廣，現(xiàn)已有多個(gè)分子對接軟件應(yīng)用于藥物篩選。利用分子對接軟件對這些抑制劑與酪氨酸酶的相互作用進(jìn)行預(yù)測，可以為了解這些化合物的酶活性抑制機(jī)理提供參考[4]。AutoDock是美國Scripps研究所的Olson實(shí)驗(yàn)室開發(fā)與維護(hù)的一款分子對接模擬軟件，主要應(yīng)用于配體-蛋白質(zhì)分子對接[5]。iGEMDOCK軟件是臺(tái)灣國立交通大學(xué)藥物設(shè)計(jì)和系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的分子對接軟件，是一種集分子對接、篩選、對接或篩選后分析及圖形可視化于一體的藥物輔助設(shè)計(jì)工具[6]，其對接過程簡單，選擇受體分子、導(dǎo)入配體后選擇合適的對接模式即可進(jìn)行對接，且能同時(shí)對接多個(gè)配體，常用于快速對接和活性篩選。在具體研究中，不同的對接軟件得到的對接結(jié)果不盡相同，且與對接過程中各參數(shù)的選取密切相關(guān)。本研究利用AutoDock和iGEMDOCK軟件，模擬酪氨酸酶與13 種具有酪氨酸酶抑制活性的苯甲酸類似物的對接，分析小分子對酪氨酸酶的作用模式和機(jī)理，探討對接結(jié)合自由能與抑制活性的相關(guān)性，以及兩種對接軟件用于預(yù)測酪氨酸酶抑制劑強(qiáng)度的可靠性。

1 材料與方法

1.1 AutoDock 4.2軟件分子對接步驟及對接參數(shù)的設(shè)置

AutoDock Tools 1.5.4軟件從官網(wǎng)（http://autodock. scripps.edu/）下載，編號(hào)2y9x的酪氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)文件來自Protein Data Bank，2y9x為雙孢菇酪氨酸酶的X衍射三維晶體結(jié)構(gòu)[7]，有8 個(gè)亞基A～H，對接位點(diǎn)選在A亞基活性中心小分子抑制劑環(huán)庚三烯酚酮（tropolone）所在區(qū)域。為充分暴露其活性中心，刪去其余亞基及配體tropolone，得到用于對接的受體三維結(jié)構(gòu)，保存為pdb格式[8-9]。配體抑制劑結(jié)構(gòu)在ZINC數(shù)據(jù)庫下載，其三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)文件由GlycoBioChem PRODRG2 Server（http://davapc1.bioch. dundee.ac.uk/prodrg）轉(zhuǎn)化。13 種苯甲酸類似物的結(jié)構(gòu)式如圖1所示[10]。用AutoDock Tools 1.5.4軟件處理受體分子：去水加氫，計(jì)算Gasteiger電荷，合并非極性氫原子，保存為pdbqt格式。同樣，AutoDock Tools可對配體進(jìn)行處理，其非極性氫原子被合并，Gasteiger電荷被加上，使能量最小化[11]。AutoDock Tools 1.5.4軟件中的Ligand子程序包可自動(dòng)檢測可旋轉(zhuǎn)鍵的個(gè)數(shù)，在對接過程中，這些鍵可以靈活旋轉(zhuǎn)與受體分子對接。AutoDock 4.2可以進(jìn)行柔性對接，但選取柔性基團(tuán)的不確定因素較多，因此本實(shí)驗(yàn)仍采用剛性對接形式。

圖1 苯甲酸類化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of benzoic acid and its analogues

在格點(diǎn)盒子（gridbox）中，格點(diǎn)間距為0.375 ?，大小為60 ?×60 ?×60 ?，格子的中心為默認(rèn)受體活性中心，坐標(biāo)值為（－7.397, －23.551, －32.508）。配體構(gòu)象搜索過程使用半經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)與拉馬克遺傳算法[12]（Lamarckian genetic algorithm，LGA），算法對接的輪數(shù)（number of GA runs）設(shè)為100，對接次數(shù)越多，所耗時(shí)間會(huì)越長，但對接結(jié)果更可靠。在分子對接運(yùn)行過程中，能量評估的最大數(shù)目（max number of evals）設(shè)為250萬，平移步驟大小（rate of crossover）為0.8，其他參數(shù)取默認(rèn)值[13]。

酪氨酸酶為含Cu氧化還原酶，Cu電荷數(shù)的大小對其活性對接有影響，但Cu不是AutoDock 4.2的默認(rèn)原子類型，需要在對接前自行添加Cu和設(shè)置電荷數(shù)，因此，Cu電荷數(shù)是需確定的重要參數(shù)之一[14]。實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)置受體坐標(biāo)文件Cu電荷數(shù)為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，以苯甲酸為例，運(yùn)行得到對接結(jié)合自由能，探討Cu電荷最佳參數(shù)。

1.2 iGEMDOCK 2.1軟件分子對接步驟及對接參數(shù)的設(shè)置

iGEMDOCK 2.1軟件在導(dǎo)入酪氨酸酶受體分子時(shí)，不必刪去多余的亞基，可自行將配體小分子tropolone所在區(qū)域作為活性位點(diǎn)[15]。直接導(dǎo)入配體分子進(jìn)行對接。對接參數(shù)設(shè)置：通用進(jìn)化方法中群體大小（population size）設(shè)為300，子代數(shù)目（generations）設(shè)為80，解的個(gè)數(shù)（number of solutions）設(shè)為10，運(yùn)行docking。

2 結(jié)果與分析

2.1 對接準(zhǔn)確性驗(yàn)證

為驗(yàn)證AutoDock 4.2參數(shù)設(shè)置與對接結(jié)果的準(zhǔn)確性，將酪氨酸酶晶體活性中心中的小分子tropolone作為配體，與刪去配體的酪氨酸酶進(jìn)行對接[16]。對接的最優(yōu)構(gòu)象與在Protein Data Bank下載帶有tropolone結(jié)構(gòu)的酪氨酸酶三維X衍射圖進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)模擬對接的小分子tropolone與三維X衍射圖中的小分子結(jié)合在酪氨酸酶活性中心的相同部位，其構(gòu)象大部分重合（圖2），可見本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的對接參數(shù)合理，能較好地建立抑制劑與酶在活性中心的結(jié)合模型。

圖2 分子對接與三維X衍射結(jié)構(gòu)對比Fig.2 Comparison between docking and three-dimensional X-ray structure

2.2 Cu電荷數(shù)改變對AutoDock對接結(jié)果的影響

圖3顯示了苯甲酸與酪氨酸酶對接結(jié)合自由能與所設(shè)置Cu電荷數(shù)大小的關(guān)系。Cu電荷數(shù)為0時(shí)，結(jié)果偏差大，Cu電荷數(shù)越大，對接結(jié)合自由能與Cu電荷數(shù)的線性關(guān)系越好。綜合考慮Cu的價(jià)態(tài)，本實(shí)驗(yàn)中酪氨酸酶的Cu電荷數(shù)設(shè)為2.0。

圖3 對接結(jié)合自由能與Cu電荷數(shù)關(guān)系Fig.3 Relationship between binding free energy and Cu charge

2.3 AutoDock 4.2和iGEMDOCK 2.1軟件對接結(jié)果

本研究篩選了13 種苯甲酸類似物的酪氨酸酶抑制劑，由文獻(xiàn)[9,17-21]獲得其抑制常數(shù)和半抑制濃度（IC50），抑制劑的活性數(shù)據(jù)及兩種軟件預(yù)測的最低對接結(jié)合自由能見表1。

表1 苯甲酸類似物對酪氨酸酶的抑制作用及對接結(jié)合自由能Table1 Inhibitory effect and binding free energy of benzoic acid and its analogues against tyrosinase

以抑制劑pIC50（－lgIC50）為橫坐標(biāo)，對接結(jié)合自由能（取各對接構(gòu)象中的最低對接結(jié)合自由能）為縱坐標(biāo)，得到AutoDock 4.2軟件對接的苯甲酸類似物與對接結(jié)合自由能相關(guān)性圖。Cu電荷數(shù)設(shè)置為2.0時(shí)，其回歸方程為y＝－0.798 5x－6.950 7（r＝0.803 6）；Cu電荷數(shù)設(shè)置為0時(shí)，其回歸方程為y＝0.107 1x－3.705 4（r＝0.203 2）。

苯甲酸及其類似物與酪氨酸酶iGEMDOCK 2.1的對接結(jié)合自由能見表1，其pIC50與對接結(jié)合自由能的回歸方程為y＝－0.981 3x－88.674（r＝0.112 2）。

2.4 酪氨酸酶對接的成鍵作用與活性中心分析

通過13 種抑制劑與酪氨酸酶的相互作用分析，發(fā)現(xiàn)與抑制劑作用的氨基酸殘基主要有：His85、His263、His259、His296、His61、Phe292、Val283、Ala286、Gly281、Ser283等。選取苯甲酸預(yù)測所得對接結(jié)合自由能最低的構(gòu)象作為最佳構(gòu)象進(jìn)行分析。苯甲酸與酪氨酸酶關(guān)鍵殘基的作用機(jī)理如圖4所示。由苯甲酸與受體的結(jié)合模型可推測其他抑制劑作為底物占據(jù)酶活性中心的作用機(jī)理。

圖4 苯甲酸與酪氨酸酶活性中心結(jié)合構(gòu)象Fig.4 Conformation of benzoic acid combined with active sites of tyrosinase

3 討 論

在酪氨酸酶對接研究中，Cu電荷數(shù)的設(shè)置對苯甲酸類抑制劑自由能的影響很大。Cu是穩(wěn)定酶活性中心和進(jìn)行催化反應(yīng)的重要輔助因子，設(shè)置較大的Cu電荷數(shù)，能夠提高抑制劑與受體的親和力，使對接結(jié)合自由能更小，根據(jù)Cu離子的氧化價(jià)態(tài)為＋2，將對接的Cu電荷數(shù)設(shè)為2.0，并獲得了較好的對接結(jié)果。13 種苯甲酸類似物對接結(jié)合自由能與抑制劑實(shí)驗(yàn)測定的抑制活性具有較好的線性相關(guān)性，基本能夠反映抑制劑與酶結(jié)合力越大，對酶活性抑制作用越強(qiáng)。對接研究中曾以多種酪氨酸酶抑制劑與2y9x結(jié)構(gòu)對接，發(fā)現(xiàn)若不按抑制劑的結(jié)構(gòu)類似性分類研究，對接結(jié)合自由能與pIC50無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)性。苯甲酸類化合物的羧基具有絡(luò)合作用，可能與酪氨酸酶的銅離子形成絡(luò)合物，抑制酶的活性[22]。抑制劑與酶對接結(jié)合自由能越小，結(jié)合能力越強(qiáng)，抑制效果更明顯，則實(shí)驗(yàn)測得的IC50越大。

AutoDock 4.2軟件在進(jìn)行構(gòu)象搜索時(shí)使用的是半經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)，對接結(jié)合自由能考慮因素有范德華力、氫鍵、靜電作用力、去溶劑化和扭轉(zhuǎn)作用能。肉桂酸是苯丙烯酸類化合物，其結(jié)構(gòu)與苯甲酸相似，因苯環(huán)上的碳鏈延長，可旋轉(zhuǎn)的鍵增多，與酶的親和力更強(qiáng)，對接結(jié)合自由能較苯甲酸要小，相應(yīng)IC50也較小。而3,4-二羥基肉桂酸與酪氨酸酶的天然底物L(fēng)-多巴（3,4-二羥基苯丙氨酸）結(jié)構(gòu)非常類似，其IC50在13 種苯甲酸類似物中最小，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的酶活性抑制作用，而通過AutoDock 4.2對接得到的結(jié)合自由能亦是最小。酪氨酸酶非競爭性抑制劑4-氟苯甲酸、4-氯苯甲酸、4-溴苯甲酸的結(jié)合自由能與pIC50相關(guān)性很好，鹵素原子的電負(fù)性越小，IC50越低，結(jié)合自由能值越小，其機(jī)理可能是酶催化時(shí)在底物與氧之間形成氫氧橋，鹵素原子能影響氫氧橋的形成[23]，且鹵素原子的電負(fù)性越小，鹵代烴的活性越強(qiáng)，抑制效果越好，與AutoDock 4.2的對接結(jié)果一致。

iGEMDOCK 2.1軟件打分時(shí)考慮范德華力、氫鍵和靜電作用力，苯甲酸及其類似物與酪氨酸酶的對接結(jié)果顯示范德華力約占對接總能量的60%。但iGEMDOCK 2.1對接結(jié)合自由能與pIC50的線性相關(guān)性不高。

本研究采用AutoDock 4.2軟件，通過添加Cu并調(diào)整其電荷數(shù)，成功將苯甲酸及其類似物等13 種抑制劑與酪氨酸酶進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)對接結(jié)合自由能與抑制劑實(shí)驗(yàn)測定的抑制活性具有較好的線性相關(guān)性，可用于結(jié)構(gòu)相似的同類化合物中活性預(yù)測和相互作用分析。相比而言，iGEMDOCK 2.1軟件在本研究所采用的13 種抑制劑中的對接結(jié)果與實(shí)驗(yàn)測定活性的相關(guān)性不如AutoDock 4.2。因此，在虛擬分子對接中應(yīng)根據(jù)具體的體系和需要，選擇適宜的對接軟件。

[1] 李娜, 魯曉翔. 酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(7): 406-409.

[2] 鄭宗平, 蘭山, 秦川, 等. 天然酪氨酸酶抑制劑研究進(jìn)展: 種類及其構(gòu)效關(guān)系[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(8): 374-378.

[3] 畢云楓, 宋鳳瑞, 劉志強(qiáng). 天然酪氨酸酶抑制劑的種類及其對酪氨酸酶抑制作用的研究進(jìn)展[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2014, 40(2): 454-459. DOI:10.13481/j.1671-587x.20140247.

[4] KHAN M T H. Molecular design of tyrosinase inhibitors: a critical review of promising novel inhibitors from synthetic origins[J]. Pure and Applied Chemistry, 2007, 79(12): 2277-2295. DOI:10.1351/ pac200779122277.

[5] KANADE S R, SUHAS V L, CHANDRA N, et al. Functional interaction of diphenols with polyphenol oxidase[J]. FEBS Journal, 2007, 274(16): 4177-4187. DOI:10.1111/j.1742-4658.2007.05944.x.

[6] YANG J M, CHEN C C. GEMDOCK: a generic evolutionary method for molecular docking[J]. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2004, 55(2): 288-304. DOI:10.1002/prot.20035.

[7] ISMAYA W T, ROZEBOOM H J, WEIJN A, et al. Crystal structure of Agaricus bisporus mushroom tyrosinase: identity of the tetramer subunits and interaction with tropolone[J]. Biochemistry, 2011, 50(24): 5477-5486. DOI:10.1021/bi200395t.

[8] 朱杰華, 宋勝玉, 谷萬港. 基于結(jié)構(gòu)的HIV-1整合酶抑制劑的虛擬篩選[J]. 中國生物制品學(xué)雜志, 2014, 27(1): 78-81.

[9] 張海玲, 光翠娥, 江波, 等. 皂苷類似物與腎素的分子對接和結(jié)合能分析[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2014, 33(10): 1056-1062. DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2014.10.008.

[10] 陳清西, 林建峰, 宋康康. 酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 46(2): 274-282. DOI:10.3321/ j.issn:0438-0479.

[11] YIN S J, SI Y X, CHEN Y F, et al. Mixed-type inhibition of tyrosinase from agaricus bisporus by terephthalic acid: computational simulations and kinetics[J]. Protein Journal, 2011, 30(4): 273-280. DOI:10.1007/ s10930-011-9329-x.

[12] KHATIB S, NERYA O, MUSA R, et al. Enhanced substituted resorcinol hydrophobicity augments tyrosinase inhibition potency[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2007, 50(11): 2676-2681. DOI:10.1021/jm061361d.

[13] 李偉. 蛋白質(zhì)配體結(jié)合位點(diǎn)柔性的系統(tǒng)分析及分子柔性對接方法的發(fā)展和應(yīng)用[D]. 北京: 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2012: 78-107.

[14] SENDOVSKI M, KANTEEV M, BEN-YOSEF V S, et al. First structures of an active bacterial tyrosinase reveal copper plasticity[J]. Journal of Molecular Biology, 2011, 405(1): 227-237. DOI:10.1016/ j.jmb.2010.10.048.

[15] 劉文, 蔣世云, 李強(qiáng), 等. 酚類抑制劑抗5-脂氧合酶的分子對接研究[J]. 生物技術(shù)通訊, 2012, 23(4): 527-531. DOI:10.3969/ j.issn.1009-0002.

[16] 偉堯, 朱琛, 張卓, 等. 硝基咪唑類似物作為尿素酶抑制劑的分子對接研究[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2010(2): 6-9; 95.

[17] 張麗娟. 苯甲酸類似物對酪氨酸酶的效應(yīng)及其抑菌作用[D]. 廈門:廈門大學(xué), 2006: 52-76.

[18] 林建成, 邱凌, 張麗娟, 等. 茴香醛與茴香酸對蘑菇酪氨酸酶單酚酶的抑制作用[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007(2): 254-257. DOI:10.3321/j.issn:0438-0479.

[19] 張春樂. 抑制劑對蘑菇氨酸的抑制效應(yīng)及抗菌活性[D]. 廈門: 廈門大學(xué), 2007: 30-48.

[20] 龔盛昭, 楊卓如, 程江. 肉桂酸抑制酪氨酸酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究[J]. 高校化學(xué)工程學(xué)報(bào), 2007, 21(2): 345-349. DOI:10.3321/ j.issn:1003-9015.

[21] 閆軍, 李昌生, 陳聲利, 等. 咖啡酸, 阿魏酸和香草酸對酪氨酸酶活性的影響[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2004, 9(3): 337-339. DOI:10.3969/j.issn.1009-2501.

[22] 鄒先偉, 蔣志勝. 植物源酪氨酸酶抑制劑研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2004, 35(6): 702-705. DOI:10.3321/j.issn:0253-2670.

[23] WANG Q, SHI Y, SONG K K, et al. Inhibitory effects of 4-halobenzoic acids on the diphenolase and monophenolase activity of mushroom tyrosinase[J]. Protein Journal, 2004, 23(5): 303-308. DOI:10.1023/ B:JOPC.0000032649.60933.58.

Molecular Docking of Benzoic Acid and Its Analogues with Tyrosinase

LI Muzi1, WANG Qinghua2,*, WANG Xiaoyi1, HE Yun1
(1. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2. School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

Benzoic acid and its 12 analogues were docked with tyrosinase by using AutoDock 4.2 and iGEMDOCK 2.1 software, respectively. The linear correlation between docking binding free energy and experimental inhibitory activity of benzoic acid analogues was studied. The results from AutoDock 4.2 showed that the change in Cu charge had a significant effect on binding free energy, and the linear correlation coefficient between binding free energy and pIC50was up to 0.803 6 when Cu charge was 2.0, but the linear correlation coefficient from iGEMDOCK 2.1 was poor. The prediction capacity of AutoDock 4.2 was more reliable than that of iGEMDOCK 2.1.

tyrosinase; benzoic acid; inhibitors; molecular docking

10.7506/spkx1002-6630-201603017

Q74

A

1002-6630（2016）03-0087-04

李慕紫, 王慶華, 王曉藝, 等. 苯甲酸及其類似物與酪氨酸酶分子對接研究[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 87-90. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603017. http://www.spkx.net.cn

LI Muzi, WANG Qinghua, WANG Xiaoyi, et al. Molecular docking of benzoic acid and its analogues with tyrosinase[J]. Food Science, 2016, 37(3): 87-90. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603017. http://www.spkx.net.cn

2015-04-20

李慕紫（1992—），女，碩士研究生，主要從事中藥活性成分研究與新藥開發(fā)。E-mail：muzilee_12@163.com

*通信作者：王慶華（1969—），男，教授，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：wqhwj@163.com